■ PFOS・PFOA・PFHxS 検査マニュアル
固相抽出―液体クロマトグラフ―質量分析法
1．はじめに
ペルフルオロオクタンスルホン酸（PFOS）およびペルフルオロオクタン酸（PFOA）の2物質は，2020年に水質管理上留意すべき項目である「水質管理目標設定項目」に位置付けられ，2物質の合算値として0.00005 mg/L (50 ng/L)の暫定目標値が設定されている．また，ペルフルオロヘキサンスルホン酸（PFHxS）は，2021年に毒性評価が定まらず水道水中での検出実態が明らかでない項目である「要検討項目」に位置付けられたが，その目標値はまだ設定されていない1, 2)．
水道水中PFAS分析の標準検査方法（いわゆる公定法）は，上記の3物質を対象として，厚生労働省から発出されている「水質管理目標設定項目の検査方法」の中に「目標31」として示されている3)．本法は，分析対象物質に対応する内部標準物質を検水に添加した後，固相抽出により精製・濃縮して試験溶液とし，液体クロマトグラフ－質量分析計（LC-MS）あるいは液体クロマトグラフ－タンデム型質量分析計（LC-MS/MS）を用いて，選択イオン検出（SIM）法または選択反応モニタリング(SRM)法で分析する方法である．内部標準物質は固相抽出前に検水に添加することにより，固相抽出を含む前処理全体でのロスを補正するとともに，内部標準法によりPFOS，PFOAおよびPFHxSの濃度を求める．
2．標準品・試薬
PFOS，PFOAおよびPFHxSのいずれも，直鎖体の他に複数の分岐異性体が存在するため，環境試料や水道水試料から検出されることがある．分析に用いる標準物質あるいは標準液は，直鎖体を主成分とするものを用いる．分岐鎖PFOS，PFOAおよびPFHxSが含まれる標準物質・標準液を用いてもよいが，直鎖PFOS，PFOAおよびPFHxSを主成分とし，かつ直鎖PFOS，PFOAおよびPFHxSの濃度が明確なものを用いる必要がある．標準品は塩（例えばPFOSナトリウム塩）としての濃度が記載された市販品を使用しても問題ないが，PFOS，PFOAおよびPFHxSはいずれも酸（C8HF18O3S，C8HF15O2およびC6HF13O3S）としての濃度を求めて報告値とする必要があるため，濃度の換算には注意する．
また，内部標準物質として，13C-PFOS，13C-PFOA，13C-PFHxSもしくは18O-PFHxSを用いる．13C-PFOS，13C-PFOAおよび13C-PFHxSには，13Cの数が異なる複数の種類の市販品が販売されているが，直鎖13C-PFOS，13C-PFOAおよび13C-PFHxSを主成分とする標準品であれば，13Cの数や分子内の位置によらず，どのようなものでも使用できる．なお，一般的に入手可能な13C-PFOS，13C-PFOA，13C-PFHxSおよび18O-PFHxSとしては，13C4-PFOS，13C8-PFOS，13C2-PFOA，13C4-PFOA，13C8-PFOA，13C3-PFHxS，13C6-PFHxS，18O2-PFHxS等がある．
なお，「水道水質検査方法の妥当性評価ガイドライン」4)に従い，各検査機関の標準作業手順書（SOP）に示す検査方法の妥当性を評価できれば，必ずしも内部標準物質を使用する必要はないが，良好な分析精度を得るためには，分析対象物質に対応する内部標準物質を用いることが望ましい．PFOS，PFOAおよびPFHxSは器具及び装置等に吸着しやすい物質であり，内部標準物質を使用しない場合は回収率の補正ができないため，十分な回収率（真度）が得られることを確認する必要がある．
PFOS，PFOAおよびPFHxSは難分解性だが，保存容器の開閉を繰り返すとメチルアルコールが徐々に揮発して濃度が変化する可能性があるため，標準液および内部標準液の繰り返し使用には注意する．
試験に用いる試薬や精製水，メタノール，アセトニトリル等の溶媒は，測定対象成分を含まないものを用いる．特に，移動相に用いる精製水や溶媒からのブランクの検出に注意し，後述する空試験（ブランク確認試験）において分析結果に影響がないことを確認する．
3．試料の採取
試料は，精製水およびアセトンで洗浄したガラスまたはポリプロピレン容器に採取し，満水にして直ちに密栓し，速やかに試験する．PFOS，PFOAおよびPFHxSは使用する容器の種類によっては吸着のおそれがあるため，予め標準液を用いた添加回収実験を行い，良好な回収を示すことを確認した上で使用する．速やかに試験できない場合は，冷蔵保存する．前述の通りPFOS，PFOAおよびPFHxSは難分解性であるが，採水容器への吸着等の影響を極力防ぐため，試料採取後，速やかに試験することが望ましい．速やかに試験できない場合は試験日まで試料を冷蔵保存しておく．
なお，水道水の検査においては，採水時に残留塩素除去剤（例えばアスコルビン酸ナトリウム）を添加して検査を行うことがある．水道水中の残留塩素によりPFOS，PFOAおよびPFHxSが分解することはないと考えられるため，採水時に脱塩素処理を行う必要はないが，アスコルビン酸ナトリウム等で残留塩素を除去した検水を検査に用いても問題はない．
4. 前処理方法
試料の前処理方法は，検水500 mLを固相抽出により精製および1000倍濃縮し，試験溶液をLC-MSあるいはLC-MS/MS分析に供する（図1）．内部標準物質（13C-PFOS，13C-PFOA，13C- PFHxSあるいは18O-PFHxS）は固相抽出前に検水に添加することで，固相抽出を含む前処理全体でのPFOS，PFOAおよびPFHxSのロスを補正する．固相カラムは，陰イオン交換基を被覆したシリカゲル若しくはポリマー系充塡剤を充塡したもの（例えば，Oasis WAX，InertSep MA-2等の名称で市販されている）またはこれと同等以上の性能を有するものを用いる．
前処理操作の手順は下記の通りである．混合内部標準液（0.1 mg/L）50 μLを加えて撹拌した検水500 mLを毎分５m Lの流量で固相カラムに流す（陰イオン交換カラムを用いる場合，通水速度が～5 mL/minと一般的な逆相カラムの10～20 mL/minと比べて遅いため通水に時間が掛かることに留意する）．なお，固相カラムは予め0.1％アンモニア・メタノール溶液４mL，メタノール４mL，精製水4 mLを順次注入してカラムのコンディショニングを行ったものを用いる（アンモニア水の取り扱いには十分に注意する）．精製水約５mLで固相カラムを洗浄した後，窒素ガスを通気して固相カラムを乾燥させる．次いで，固相カラムの通水方向とは逆から0.1％アンモニア水・メタノール５mLを緩やかに流し，溶出液を試験管に採る．試験管の溶出液に窒素ガスを緩やかに吹き付けて，0.5 mLまで濃縮し，これを試験溶液とする．
上述のように，内部標準物質の使用により前処理操作全体のロスを補正することができるが，内部標準物質そのものの回収率が低いと（目安として50%以下），回収率補正の精度が悪くなり良好な真度が得られない場合がある．そのような場合は，容器のメタノールで洗い込み，その洗浄液も固相カラムに通水することで，回収率を向上させることができると考えられる5)．
なお，固相抽出を行わずに，LC-MSに直接注入して分析することもできるが，濃縮を行わない分だけ低濃度の分析が必要になるため，用いる試薬・溶媒等に含まれているブランクや器具・装置からの溶出の影響を受けやすくなることに注意する．また，その場合は「水道水質検査方法の妥当性評価ガイドライン」4)に従い，検査方法の妥当性を評価する必要がある．また上記のガイドラインにおける「標準検査方法以外の検査方法を検査室に導入する場合」に該当するので，室内精度を含む全ての性能パラメータを確認する必要がある．
5. 分析方法
上記の前処理操作で得られた試験溶液の一定量をLC-MSあるいはLC-MS/MSに注入する．LC-MSあるいはLC-MS/MSの分析条件例を表1および表2に示した．LCカラムは，表1に記載したもの以外にも，一般的なODSカラム（例えば，ACQUITY UPLC BEH C18，Inertsil ODS-3，ZORBAX Eclipse XDB-C18，L-column ODS等の名称で市販されている）を使用しても問題はない6)．その他の分析条件例については，厚生労働省および国立医薬品食品衛生研究所が示している「PFOS及びPFOA固相抽出-液体クロマトグラフ-質量分析法質疑応答集 (Q&A)」7)や引用文献5)に記載されているので参考にして頂きたい．
移動相由来のブランクが検出される場合は，リテンションギャップカラムの使用等を検討する．リテンションギャップカラムは，LCの注入口手前に接続することで，移動相由来のブランク成分の溶出を遅らせ，試料中のピークと移動相由来のブランクのピークをずらすことで，ブランクの影響を低減させることができる．表1に示したものの他にも，InfinityLab PFC Delay Column等の名称で市販されているものや，通常のLCカラムも使用できる．
| 装置 | パラメータ | 設定値 |
|---|---|---|
| LC | 機種 | Prominence UFLC（島津製作所） |
| LCカラム | InertSustain AQ-C18 (3μm, 2.1×150 mm, ジーエルサイエンス) | |
| リテンション ギャップカラム | Delay column for PFAS (3.0×30 mm, ジーエルサイエンス) | |
| 移動相A | 10 mM酢酸アンモニウム | |
| 移動相B | アセトニトリルあるいはメタノール | |
| 移動相条件 | B:25% (0-1 min) – B:100% (26-30 min) | |
| 移動相流量 | 0.2 mL/min | |
| カラム温度 | 40 ℃ | |
| 注入量 | 5μL | |
| MS | 機種 | LCMS-8050 (島津製作所) |
| 検出器 | SIMあるいはSRM | |
| イオン化法 | ESIネガティブモード | |
| プローブ電圧 | 3.5 kV | |
| その他の MS条件 |
ネプライザーガス流量：3 L/min, ドライングガス流量：10 L/min ヒーティングガス流量：10 L/min, インターフェイス電圧：3.0 kV インターフェイス温度：300℃, 脱溶媒温度：500℃ DL温度：250℃, ヒートブロック温度：400℃ コンバージョンダイノード電圧：10 kV, CIDガス圧力：270 kPa |
| 対象物質 | プリカーサイオン(m/z) | プロダクトイオン (m/z) | |
|---|---|---|---|
| 定量イオン | 確認イオン | ||
| PFOS | 499 | 80 | 99 |
| PFOA | 413 | 169 | 369 |
| PFHxS | 399 | 80 | 99 |
| 13C4-PFOS※1 | 503 | 80 | 99 |
13C8-PFOS※1| 507 | 80 | 99 |
|
| 13C2-PFOA※2 | 415 | 370 | 169 |
| 13C4-PFOA※2 | 417 | 372 | 169 |
| 13C8-PFOA※2 | 421 | 376 | 172 |
| 13C3-PFHxS※3 | 402 | 80 | 99 |
| 13C6-PFHxS※3 | 405 | 80 | 99 |
| 18O2-PFHxS※3 | 403 | 84 | 103 |
※1 PFOSの内部標準物質, ※2 PFOAの内部標準物質, ※3 PFHxSの内部標準物質
表2に示すそれぞれの対象物質と内部標準物質のモニターイオンのピークの保持時間が標準物質と一致することを確認し，ピーク面積を求める．LC-MSを用いる場合は，表中のプリカーサイオンをモニターイオンとする．試料から分岐鎖PFOS，PFOAおよびPFHxSのピークが見られる場合は，各物質について直鎖と各分岐鎖のピーク面積を合わせた面積を求める．ただしその場合も，PFOS，PFOAおよびPFHxSはいずれも直鎖と分岐鎖の異性体のピークが分離する分析条件を設定して分析を行う．PFOS，PFOAおよびPFHxSいずれも直鎖と分岐鎖の異性体のピーク面積を合わせて濃度を算定するため，異性体のピークを分離しなくても濃度の算定結果に違いは生じないと考えられるが，異性体のピークを分離しない条件で分析した場合，検査対象物と妨害物のピーク分離が不十分になる可能性があるため，選択性の観点から直鎖と分岐鎖の異性体のピークを分離する必要がある．直鎖PFOS，PFOAおよびPFHxSのみが含まれる標準品を用いる場合は，それぞれの直鎖体のピークしか確認できないため，図2のクロマトグラム等を参考に，分岐鎖PFOS，PFOAおよびPFHxSの保持時間を特定して定性する．
なお，PFOS，PFOAおよびPFHxSはモニターイオンによって直鎖と分岐鎖の異性体のピーク面積の割合が異なることが知られている8)．表2に示したモニターイオンは，直鎖と分岐鎖の異性体のピーク面積を合わせて濃度を算出した際に，十分な強度が得られ，なおかつ分岐鎖の異性体のピーク面積割合が高いプロダクトイオンを定量イオンとして示している．そのため，前述の質疑応答集 (Q&A7))では，原則として表2に示した定量イオンを用いてPFOS，PFOA及びPFHxSの濃度を求めることとしている．
次に，各対象物質のモニターイオンのピーク面積と，対応する内部標準物質のモニターイオンピーク面積との比を求め，試料と同一日に分析した検量線用標準試料から作成した検量線を用いて，試験溶液中の各対象物質の濃度を求める．標準物質および内部標準物質は直鎖PFOS，PFOAおよびPFHxSの濃度が明確なものを用い，分岐鎖PFOS，PFOAおよびPFHxSのピーク面積は合わせず，直鎖PFOS，PFOAおよびPFHxSのピーク面積のみを用いて検量線を作成する．
試験溶液中の各物質の濃度を，前処理の濃縮倍率（1000倍）で除して，検水中の各物質の濃度を算定する．また，PFOSおよびPFOAの暫定目標値を超過していないことを評価する場合は，それぞれの濃度を合計する．その際，どちらかが定量下限未満であった場合は，定量下限未満の物質の濃度は0として濃度を合計する．なお，PFOS，PFOAおよびPFHxSはいずれも酸（C8HF17SO3，C8HF15O2およびC6HF13SO3）としての濃度を求めて報告値とする．
PFOSおよびPFOAの定量下限は，PFOSおよびPFOAそれぞれについて，暫定目標値の1/10に相当する0.000005 mg/L (5 ng/L)まで測定できることを確認する必要がある．PFHxSについては目標値が設定されていないが，PFOSおよびPFOAと一斉分析が可能であり，これら2物質と同等の感度が得られることから，PFOSおよびPFOAと同程度の濃度まで測定できることを確認することが望ましい．図1の前処理方法に従い1000倍濃縮した試料を測定すれば，標準的なLC-MS/MSでは検水中の濃度として1 ng/L（試験溶液中の濃度として1 μg/L）まで測定が可能であることが報告されている5)．固相抽出を行わずに，LC-MS/MSに直接注入して分析する場合は，固相抽出を行う場合と同様に，PFOSおよびPFOAそれぞれについて暫定目標値の1/10に相当する0.000005 mg/Ｌ (5 ng/L)まで測定できることを確認する必要がある．
6. 空試験
「空試験」とは，精製水を用いたブランク確認試験のことであり，用いる試薬，器具，装置等から分析対象物質が検出されないか，検出されても分析結果に影響がないことを確認する．具体的には，精製水500 mLを採り，上記「4．前処理方法」および「5．分析方法」と同様に操作して試験溶液中のPFOS，PFOAおよびPFHxSの濃度を求め，それらが検量線の濃度範囲の下限値を下回ることを確認する．求めた濃度が検量線の濃度範囲の下限値以上の場合は，是正処置を講じた上で上記4および5と同様の操作を再び行い，求められた濃度が当該濃度範囲の下限値を下回るまで操作を繰り返す．PFOS，PFOAおよびPFHxSは実験環境からのコンタミにより試験操作中に試料に混入する可能性が高い物質であるため，空試験は必ず毎回行い，分析結果に影響を及ぼさないことを確認する必要がある．
7. 留意点
全ての操作において，標準液および試料と触れる部分にポリテトラフルオロエチレン（PTFE）が使用されている容器等を用いないことが原則である．試験操作中にPFOS，PFOAおよびPFHxSが溶出し，標準液および試料に混入する可能性がある．また，固相抽出装置やLC-MSのチューブ，バルブ，デガッサ等にもPTFEが使われている場合がある．この場合も可能な限り部品を交換し，不可能な場合には事前に空試験を行い，使用する器具や装置が検査結果に影響を及ぼさないことを十分に確認する必要がある．
その他，「PFOS及びPFOA固相抽出-液体クロマトグラフ-質量分析法質疑応答集 (Q&A)」8)に分析上の留意点が記載されており，随時，追加されているので参考として頂きたい．
8. 妥当性評価
「水道水質検査方法の妥当性評価ガイドライン」4)に従い検査方法の妥当性を評価する場合は，検量線と添加試料の両方について評価を行う．
検量線の評価は，キャリーオーバー，真度および精度の目標を満たすことを確認する．キャリーオーバーは，最高濃度の標準試料の測定後に測定したブランク試料中の検査対象物の濃度が，検量線の濃度範囲の下限値を下回ることを確認する．真度は，標準試料を繰り返し測定し，各濃度の標準試料を検量線により定量した濃度の平均値が，いずれの濃度点においても調製濃度の80〜120%の範囲内にあることを確認する．精度は，標準試料を繰り返し測定し，各濃度の標準試料を検量線により定量した濃度の相対標準偏差（RSD）が，いずれの濃度点においても20%以下であることを確認する．
添加試料の評価は，原則として検査対象物を含まない水道水に標準液を添加し，選択性，真度および併行精度（必要に応じて室内精度）の目標を満たすことを確認する．選択性は，定量を妨害するピークがないか，妨害ピークを認める場合は，できるだけ検査対象物のピークと妨害ピークを分離できる測定条件を設定する．真度は，５個以上の添加試料を検査方法に従って試験し，得られた試験結果の平均値の添加濃度に対する比を求め，70〜130%の範囲内であることを確認する．併行精度は，添加試料を検査方法に従って複数回試験し，得られた試験結果の併行精度（RSD）が20%以下であることを確認する．自由度が４以上となるように試験を行う．室内精度添加試料を検査方法に従って複数の検査員又は検査日により複数回試験し，得られた試験結果の室内精度（RSD）が25%以下であることを確認する．自由度が４以上となるように試験を行う．
その他，妥当性評価の詳細については「水道水質検査方法の妥当性評価ガイドライン」4)に記載されているので参考として頂きたい．
9. 今後の課題
上述のように，水道水中のPFOS，PFOA，PFHxS等の分析では，試料によっては直鎖体以外に分岐異性体のピークが幾つか検出されることがある．本稿で紹介した厚生労働省の公定法では「直鎖体のピーク面積のみを用いて検量線を作成」し，「PFOS，PFOA，PFHxSはそれぞれ直鎖と分岐異性体のピーク面積を合わせて濃度を算定」することが規定されているが，モニターイオン等の分析条件によって直鎖体と分岐異性体の感度比は異なることから，分岐異性体の標準品を用いて作成した検量線を用いて定量しなければ，分岐異性体の正確な定量値が得られない．PFOS，PFOA，PFHxS等の分岐異性体の濃度をより正確に定量するための方法については現在検討中であり，今後の課題と考えられる．
参考資料
- 厚生労働省（2024）水道水質基準について
https://www.mhlw.go.jp/stf/seisakunitsuite/bunya/topics/bukyoku/kenkou/suido/kijun/index.html - 厚生労働省 (2024) 水質基準項目と基準値（51項目）
https://www.mhlw.go.jp/stf/seisakunitsuite/bunya/topics/bukyoku/kenkou/suido/kijun/kijunchi.html - 厚生労働省（2024）水質管理目標設定項目の検査方法（平成15年10月10日健水発第1010001号，最終改正：令和6年3月21日薬生水発0321第1号）
https://www.mhlw.go.jp/content/10900000/001231493.pdf - 厚生労働省 (2017) 水道水質検査方法の妥当性評価ガイドラインの一部改正について．平成24年9月6日健水発0906第1～4号（最終改正平成29年10月18日薬生水発1018第1～4号）.
http://www.mhlw.go.jp/file/06-Seisakujouhou-10900000-Kenkoukyoku/0000181618_2.pdf - Norihiro Kobayashi, Sokichi Takagi, Teruaki Kinoshita, Osamu Sakata, Fumi Nakano, Naoto Watanabe, Azumi Nomura, Nobuyuki Kawai, Toshiya Hiraiwa, Manabu Okumura, Koji Furukawa, Tomohiro Kasuya, Noritomo Iwama, Jun Yonekubo, Reika Takahara, Seiya Tanaka, Yuko Tsuchiya, Yoshiaki Ikarashi (2022) Development and validation of an analytical method for simultaneous determination of perfluoroalkyl acids in drinking water by liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Journal of Water and Environment Technology, 20(6), 219–237.
https://doi.org/10.2965/jwet.22-058 - 日本水道協会 (2021) 上水試験方法2020年版 III. 有機物編．㈱協友，東京，1680pp. ISBN: 978-4-909897-11-4.
- 厚生労働省，国立医薬品食品衛生研究所（2021）PFOS及びPFOA固相抽出-液体クロマトグラフ-質量分析法質疑応答集 (Q&A)
https://www.nihs.go.jp/dec/section3/qa/pfas.html - Pim de Voogt (2010) Reviews of Environmental Contamination and Toxicology Vol. 208: Perfluorinated Alkylated Substances.