【試験溶液の調製】
① LC/MS 測定用試験溶液の調製
・遊離体BPA 測定用試験溶液
血清、腹水は 1mL を、尿は2mL を採り、 内部標準物質であるBPA-d16 を5ng
加えた後、マルチモードタイプカートリッジに負荷する。水 3mL及び20%メタノール3mLで洗浄した後、メタノール3mL
で溶出し、 減圧乾固後 、20%メタノール1mL に溶解して試験溶液とする。
・総BPA 測定用試験溶液
血清、腹水は 1mL を、尿は2mL を採り、 0.2M 酢酸緩衝液(pH 5)
1mL、ß-グルクロニダーゼ6,500units/mL（試薬ß-グルクロニダーゼを0.2M 酢酸緩衝液(pH 5)
で10倍希釈）を50μL 加えた後、37℃で1 時間インキュベートする。その後の操作は、遊離体BPA
測定用試験溶液と同様に行い、試験溶液を調製する。② GC/MS 測定用試験溶液の調製
・遊離体BPA 測定用試験溶液
尿試料100 mL を共栓付き三角フラスコに採り、13C-BPA 0.1μg
を加え、これに(1+1)リン酸1mL を加え、pH 3
以下にする。これを、予めメタノール5mL、精製水10mLでコンディショニングしたC18 カートリッジに負荷しBPA
を抽出する。カートリッジを10%メタノール10mL で洗浄後、3mL のメタノールでBPA を溶出させ、100mL
のナス型フラスコに受け、酢酸エチル20mL を加え、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固する。フラスコにBSTFA 200μL
とアセトン2mL を加え一夜放置してTMS 化し、ロータリーエバポレーターでアセトンを留去する。これにn-ヘキサン2mL
を加え、超音波洗浄器を用いて溶解させ、予めn-ヘキサン5mL
で洗浄したフロリジルカートリッジに負荷し、流出液を試験管に採取する。更に、n-ヘキサン2mL
ずつでフラスコを2回洗浄し、カートリッジに負荷し、先の流出液と合わせる。流出液に窒素ガスを吹き付け、1mL
に濃縮し、これをGC/MS-SIM で定量する。
・総BPA 測定用試験溶液
尿試料100mL を共栓付き三角フラスコに採り、ß-グルクロニダーゼ溶液100μL と13C-BPA
0.1μg を加え、37℃で90 分間酵素処理する。その後の操作は遊離体BPA 測定用試験溶液と同様に行い、試験溶液を調製する。
【検出下限・定量下限】
全操作を通したブランク値の標準偏差（SD）の3 倍を検出下限値（LOD）、10 倍を定量下限値（LOQ）とする。 |
