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内分泌かく乱化学物質の健康影響に関する検討会
中間報告書追補その2

 

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  【装置及び測定条件】
液体クロマトグラフ/タンデム質量分析計 (LC/MS/MS) によるマルチプル リアクション モニタリング (MRM) による分析を行う。測定条件の一例を以下に示す。
分析用カラム:C18 逆相系カラム注2 (内径, 2.0 mm; 長さ, 50 mm; 粒径, 3 μm)
カラム温度:50℃
分析用移動相:(A) 0.02%アンモニア水; (B) アセトニトリル
グラジエント条件:(B), 20 → 60% (10 min), リニア
分析用移動相の流速:0.2 mL/min
注入量:5 μL
イオン化法:エレクトロスプレーイオン化 (ESI) 法; ネガティブモード
モニターイオン(プレカーサーイオン/プロダクトイオン):
E2, (m/z= 271/m/z= 145);E2-d3, (m/z= 274/m/z= 145)

【試験溶液の調製】
粉砕した飼料 10 g に E2-d3 を 100 ng 添加する。メタノールを 50 mL 加えて室温で1時間静置した後、ホモジナイズ(2分間)を行う。超音波照射(10分間)後、遠心分離し、上清を回収する。残渣にメタノール 10 mL を加えて洗浄し、遠心分離後、上清を回収し、先の上清と併せて 50 mL に定容する。この抽出液 2.0 mL をグラファイトカーボン/アミノプロピルシリカゲル固層抽出カラムに負荷する。メタノール 20 mL で洗浄後、ジクロロメタン/メタノール(50:50) 10 mL で溶出させる。窒素気流下で乾固させ、LC の溶出開始液 0.20 mL に溶解して試験溶液とする。

【検量線】
内部標準法により定量する。すなわち、E2-d3 に対するE2 の面積比から検量線を作成し、定量値を求める。

【検出下限値及び定量下限値】
操作ブランク値の標準偏差の 3 倍を検出下限値 (LOD) とし、10 倍を定量下限値(LOQ) とする。

【注解】
動物飼料の原料として魚粉が使用されることがあるため、飼料中の E2 の分析方法を構築したものである。
注1:スペルコ製、スペルクリン ENVI-Carb/LC-NH2 (500mg/500mg) 等がある。
注2:インタクト製、カデンツァ CD-C18, 2.0 x 50 mm, 3 μm 等がある。

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