CHARACTERISTICS OF THE ENTEROAGGREGATIVE SHIGA TOXIN/VEROTOXIN-PRODUCING ESCHERICHIA COLI O104:H4 STRAIN CAUSING THE OUTBREAK OF HAEMOLYTIC URAEMIC SYNDROME IN GERMANY, MAY TO JUNE 2011
Eurosurveillance, Volume 16, Issue 24, 16 June 2011
http://www.eurosurveillance.org/ViewArticle.aspx?ArticleId=19889
（食品安全情報2011年13号（2011/6/29）収載）
要旨
2011年5〜6月にドイツで溶血性尿毒症症候群と出血性下痢症の大規模アウトブレイクを起こした大腸菌株は、腸管凝集性大腸菌（enteroaggregative E. coli）に特徴的な病原性に志賀毒素産生能が加わったまれな組み合わせを有している。今回、国内および諸外国間で情報や菌株の迅速な交換が行われたことにより、アウトブレイク株の過去におけるヒト臨床での出現についてすみやかに評価することが可能であった。臨床検体中のアウトブレイク株を検出する簡易な診断スクリーニングツール、および食品中のアウトブレイク株の検出のための新規リアルタイムPCR法について以下に記載する。
背景
2011年5月23日、ドイツのロベルト・コッホ研究所（RKI：Robert Koch Institute）から欧州早期警告・対応システム（EWRS：Early Warning Response System）を通じて、志賀毒素産生性大腸菌（STEC：Shiga toxin-producing Escherichia coli）により溶血性尿毒症症候群（HUS：haemolytic uraemic syndrome）および出血性下痢症の患者数が増加しており、疑い患者が5月の第2週以降30人以上報告されているとの最初の通知があった。同日、デンマーク国立血清学研究所（SSI：Statens Serum Institut）内にある大腸菌とクレブシエラ菌のリファレンスと研究に関する世界保健機関協力センター（WHO CC：World Health Organization Collaborating Centre）は、この通知を受けて、デンマークの地域病院からなる大腸菌ネットワークに警告を発した。翌24日、Hvidovre大学病院から、志賀毒素／ベロ毒素産生性大腸菌（STEC/VTEC）感染症と診断されたドイツ人患者1人の報告があり、SSIに分離株が送付された。WHO CCとRKIは、この最初の分離株が血清型O104:H4で、志賀毒素（Stx）／ベロ毒素（VT）産生性であることを明らかにした。その後の数日間に、その他の地域病院からの照会により、ドイツのアウトブレイク株がデンマークの複数の患者からも検出された。これらの情報は、欧州疾病予防管理センター（ECDC）の食品および水由来疾患サーベイランスネットワーク（FWD：Food- and Waterborne Diseases and Zoonoses）が提供する疫学情報共有システム（EPIS：Epidemic Intelligence Information System）の緊急問合せネットワーク（UIN：Urgent Inquiry Network）に掲載され、またFWD、欧州連合大腸菌リファレンス検査機関（EU-RL：European Union Reference Laboratory for E. coli）、公衆衛生関連もしくは食品安全関連のリファレンス検査機関からなる2つのネットワーク、食品由来感染症グローバルネットワーク（GFN：Global Food-borne Infections Network）、WHO食品安全プログラム、WHO欧州地域事務局、および米国疾病予防管理センター（US CDC）の食品由来疾患サーベイランスのための分子生物学的サブタイピングネットワーク（PulseNet）に電子メールが送付された。
デンマークで分離されたアウトブレイク株のうち8株について性状を確認した後、WHO CCはローマのEU-RLにアウトブレイク指標株（index strain）とO104抗原の参照株を送付した。EU-RLは2株を5月31日に受領し、血清型O104:H4の大腸菌株の検出のためにEU-RLが開発した新しいリアルタイムPCR法により陽性結果を得た。
アウトブレイク株
PCR法によると、デンマークでの分離株は腸管凝集性（enteroaggregative）大腸菌（EAggEC）に特徴的なaggR遺伝子が陽性であった。詳細な解析から、アウトブレイク株（デンマークの患者から分離された最初の8株）はsigA、sepA、pic、aatA、aaiC、aap、およびaggAの各遺伝子も陽性であった。aggA遺伝子はAAF/Iアドヘシン（adhesin）の主要成分をコードしている。AAF/Iは、バイオフィルム形成やヒト赤血球凝集の強い活性を示す線毛性オルガネラである。WHO CCでの予備的試験において、分離株は、0.45%グルコースを添加したダルベッコ最小必須培地（DMEM）中で中程度から高度のバイオフィルム形成能を持つというEAggEC株に典型的な特徴を示した。アウトブレイク株は、ラクトース陽性、ソルビトール発酵性およびβグルクロニダーゼ陽性の典型的な大腸菌であった。さらに、アウトブレイク株は、尿路性敗血症患者から分離した腸管外病原性大腸菌の80%で検出されるアエロバクチン（aerobactin）受容体遺伝子iutAが陽性であり、STEC関連アドヘシン（saa）およびサブチラーゼ様細胞毒素（subAB）は陰性であった。
これらのデータを総合すると、アウトブレイク株は、Stx/VTをコードするバクテリオファージを取り込んだ典型的なEAggEC株であることがわかった。新しいプロトコルを用いたstx/vtx遺伝子サブタイピングにより、アウトブレイク株のStx/VTをコードする遺伝子はstx2a/vtx2aであることが明らかになった。
染色体上のA/E（attaching/effacing）病原性領域が陰性のSTEC/VTEC株での予想外の高病原性が以上の結果から説明できる可能性がある。典型的なeae陽性STEC/VTEC株と同様の効率で感染患者の腸粘膜に定着することが、腸管凝集接着性の表現型の発現により可能になったと考えられる。HUSの原因となる典型的なSTEC/VTECは通常、成人より小児で重症の症状を起こすのに対して、今回の株は小児ではなく成人でより重症の症状を起こす傾向があるが、これも腸管への接着の機構が異なることにより説明できる可能性がある。今回のEAggEC分離株が示す腸管への接着および定着の性質に対する感受性が成人と小児とで異なっているかもしれない。この点を解明するにはそれに特化した研究が必要であり、今回のアウトブレイクでの成人と小児のHUS発生率の違いは、単に暴露頻度の違いを反映しているだけであるという可能性を排除することはできない。
アウトブレイク株のスクリーニング
臨床検体を、基質特異性拡張型βラクタマーゼ（ESBL）産生菌検出用の市販の寒天プレート（例えばトリプトン胆汁酸Xグルクロニド（TBX）培地）に播くことにより、アウトブレイク株のコロニーをほぼ選択的に得ることができる。アウトブレイク指標株（現在のところ1株のみ検査済み）は、セフィキシム・亜テルル酸ナトリウム添加ソルビトール・マッコンキー寒天培地（CT-SMAC）上でも37、41.5、44℃できわめて良好な増殖を示し、赤色のコロニーを生じた。
臨床検体の迅速スクリーニングとして、一次および二次検査機関において、スライドグラス上での生菌の凝集試験にK9抗血清を使用することができる。その理由は、血清群O104のO抗原がK9莢膜抗原と同一であるからである。K9抗血清はSSIのウエブサイトに記載されており、SSI Diagnostica（デンマーク）より入手できる。SSIでは、大腸菌O104の存在を示すK9抗血清によるすべての陽性結果は、従来法によるOおよびH抗原の血清型の決定、stx2a/vtx2a遺伝子の存在、およびeae遺伝子の欠損によって再確認されている。アウトブレイク株はまた、stx2/vtx2遺伝子を標的とするPCRやRT-PCR、および市販のStx/VT検出キットなどによっても検出可能である。この場合も、eae遺伝子陰性および血清群O104を確認しなければならない。
食品検体は、緩衝ペプトン水培地（Buffered Peptone Water、検体25 gにつき225 ml使用）で、37±1℃、18?24時間の増菌培養を行うべきである。増菌後の培養液の1 mlよりDNAを抽出、精製し、リアルタイムPCR法によりstx/vtx遺伝子の検査を行う（ISO/TS 13136:2011(E)法）。
stx/vtx遺伝子が陽性の検体については、eae遺伝子の結果にかかわらず、O104関連遺伝子（wzxO104）を検出するリアルタイムPCRを行い、これが陽性の結果になった場合は、増菌後の培養液を2種類の寒天プレート、(i) マッコンキー寒天培地、TBX培地、または大腸菌分離に適したその他の培地、および(ii)抗生物質を添加したより選択性のある培地に播く。出現したコロニーのうちstx/vtx遺伝子陽性のコロニーについて、O104抗原関連遺伝子wzxO104、およびH4鞭毛抗原をコードするfliCH4遺伝子の有無を調べる。PCRアッセイのポジティブコントロールとしてRKIから供与されたアウトブレイク株のDNAはローマのIstituto Superiore di Sanita（ISS）から入手できる。
血清型O104:H4
stx2/vtx2陽性の大腸菌O104:H4に関しては散発例が数例報告されている。これらには、2001年のドイツのHUS患者からの2株、2004年のフランスの1株（EUのサーベイランスネットワークEnter-netからのデータ、臨床情報はなし）、2005年の韓国のHUS患者からの1株、2009年のグルジア共和国のHUS患者からの2株（米国CDC PulseNet経由の未発表データ）および2010年のフィンランドの合併症を伴わない下痢症患者からの1株（EPISを通じてFWDに報告すみ）が含まれる。2001年のドイツ、2010年のフィンランド、および2009年のグルジア共和国の株は、EAggECおよびSTEC/VTECの両者の特徴を有していた。
グルジア共和国の株は以下の性質を持っていた。すなわち、血清型O104:H4、志賀毒素遺伝子サブタイプstx2a、eae陰性、haemolysin陰性、aatA陽性（EAggECのマーカー）、セフトリアキソン感受性（本アウトブレイク株と異なる）、ソルビトール・ラクトース・βグルクロニダーゼ陽性で、生化学的に大腸菌と一致し、2001年のドイツの株と同様、志賀毒素の産生量は低レベルであった（米国CDC PulseNetおよびグルジア共和国調査チームからの私信）。現時点では、フランスおよび韓国のO104:H4 STEC/VTEC株に関して詳細情報は得られていない。
概して、血清型O104:H4のEAggECについては知見が限定的である。agg3A遺伝子によってコードされるAAF/IIIアドヘシンを発現する原型株は55989株で、この株は、アフリカのヒト免疫不全ウイルス（HIV）感染患者での持続性下痢の原因としてEAggECを調査する過程で分離された。マリ共和国での小児の下痢症に関する最近の調査において、中程度から重度の下痢症の小児患者3人と健康な対照3人からStx/VT陰性のEAggEC O104:H4が検出された（未発表データ）。患者から分離されたEAggEC 3株は、PCR法でaggR、aatA、aaiC、aap、astA、sepA、pic、sigA、aggA、agg3Cおよびagg3Aの様々な組合せが陽性であった。
この血清型の株の多様性を明らかにするため、入手した大腸菌O104:H4株について、それらの病原性プロファイルにかかわらずPFGEプロファイルを比較した。制限酵素XbaIおよびBlnIを用いた PFGEタイピングから、O104:H4血清型株の多様性が示された（図）。XbaIを用いた場合では、2011年ドイツのアウトブレイク株（デンマーク、ドイツ、米国での分離株）とグルジア共和国の1株でプロファイルの>95%の類似性が認められた。>90%類似性の大規模クラスターには、ドイツのアウトブレイク株、2009年のグルジア共和国の2株、フィンランドの患者からの分離株（以上はすべてstx2a/vtx2a陽性のEAggEC）およびマリ共和国の患者からのstx/vtx陰性EAggECの3株が含まれた。stx/vtx陰性のEAggEC の5株は、アウトブレイク株とは大きく異なるプロファイルを示した（図）。デンマークで分離されたドイツのアウトブレイク関連11株は、相互に区別できないXbaI プロファイルを示した。ドイツで感染し米国で診断された患者からの1株は、BlnIプロファイルがわずかに異なっていた（図、プロファイルは米国CDC PulseNet提供）。
図：大腸菌O104各株のXbaIおよびBlnIによるPFGEプロファイル：2011年5〜6月にドイツで発生したHUSアウトブレイク関連4株との比較
EAggECの一般的な性質
EAggECは下痢原性大腸菌の1つの病原型（pathotype）で、腸管毒素原性大腸菌（ETEC：enterotoxigenic E. coli）とは異なり耐熱性または易熱性の毒素を分泌せず、HEp2培養細胞へ凝集性または積みレンガ構造様の特徴的な接着（AA）をする大腸菌と定義されている。この性質はほとんどの場合AAFアドヘシンの存在によるものであり、その発現はpAA と呼ばれる大きなサイズのEAggEC病原性プラスミド上のaggR遺伝子によって制御されている。EAggEC感染は通常、しばしば持続性となる水様性下痢の原因となる。疾患は病原体と宿主の複雑な相互作用により生じる。EAggECの場合、最初にAAFアドヘシン（特徴的な凝集パターン）により遠位回腸および結腸の上皮組織に接着し、続いてサイトカイン放出、粘膜毒性、腸分泌、および粘膜炎の誘発に代表される障害／分泌段階へと進行する。
EAggECは、発展途上国の幼児および小児における持続性下痢（>14日）の原因として最もよく知られている。モンゴル、インド、ブラジル、ナイジェリア、イスラエル、ベネズエラ、コンゴおよびその他多数の国における調査から、EAggECは幼児において発生率が極めて高い（しばしば最も高い）大腸菌病原型とされている。また、AIDS患者における病原体としてEAggECの重要性は増しており、現在ではAIDS患者集団での最も重要な腸内病原体の1つとなっている。
結論
2011年5〜6月にドイツで発生したHUSアウトブレイクの原因株の公衆衛生上の重要性について速やかで多元的な評価を行うにあたり、国内および国際的な公衆衛生および食品安全のネットワークを通じた、情報、分離株およびDNAフィンガープリントの迅速な交換が不可欠であった。種々の取組みが組合わさった結果、以下に示す主要な成果を得ることができた。
国立医薬品食品衛生研究所安全情報部