{"text_format":"1","workbook":"xlsx","n_sheets":1,"sheets":["Sheet1"],"not_rendered":{"charts":0,"images":0,"macros":1,"external_links":0,"defined_names":1,"comments":0,"pivot_tables":0},"unopened":[],"bounds":{"document_bytes":16777216,"sheet_cells":100000,"rows_first":2000,"rows_last":500,"rows_between":2000,"halvings":0,"cell_chars":16384,"cell_head_chars":4096},"cells_cut":0,"cells_raw":0,"read":"whole","date_system":"1900"}

{"sheet":"Sheet1","index":0,"n_rows":315,"n_cols":17,"rows_kept":315,"cut":false,"hidden":false,"merged":[]}
["無断転載を禁ずる　（国立医薬品食品衛生研究所）"]
["ref_ID","PMID","Animal/Plant\n動物/植物","Species\n種名","Techniques\n用いた技術","Target genes\n標的遺伝子","Journal\n雑誌名","Title\nタイトル","Year\n年","Vol/pages\n巻・号・ページ","Authors\n著者","Affiliations\n所属機関（国）","PMID","DOI","Abstract \n抄録 ","species2","Abstract (Jan)\n日本語抄録"]
[1,30787936,"plant","apple; pear","CRISPR;Cas9;","phytoene desaturase; terminal flower 1","Frontiers in plant science","Efficient Targeted Mutagenesis in Apple and First Time Edition of Pear Using the  CRISPR-Cas9 System.",2019,"10:40","[Charrier A et al.]","INRA, Agrocampus-Ouest, Universite d'Angers, Beaucouze, France.",30787936,"10.3389/fpls.2019.00040 ","Targeted genome engineering has emerged as an alternative to classical plant breeding and transgenic methods to improve crop plants. Among other methods (zinc finger nucleases or TAL effector nucleases) the CRISPR-Cas system proved to be the most effective, convenient and least expensive method. In this study, we optimized the conditions of application of this system on apple and explored its  feasibility on pear. As a proof of concept, we chose to knock-out the Phytoene Desaturase (PDS) and Terminal Flower 1 (TFL1) genes. To improve the edition efficiency, two different single guide RNAs (gRNAs) were associated to the Cas9 nuclease for each target gene. These gRNAs were placed under the control of the U3 and U6 apple promoters. Characteristic albino phenotype was obtained for 85% of the apple transgenic lines targeted in MdPDS gene. Early flowering was observed in 93% of the apple transgenic lines targeted in MdTFL1.1 gene and 9% of the pear transgenic lines targeted in PcTFL1.1. Sequencing of the target zones in apple and pear CRISPR-PDS and CRISPR-TFL1.1 transgenic lines showed that the two  gRNAs induced mutations but at variable frequencies. In most cases, Cas9 nuclease cut the DNA in the twenty targeted base pairs near the protospacer adjacent motif and insertions were more frequent than deletions or substitutions. The most frequent edition profile of PDS as well as TFL1.1 genes was chimeric biallelic. Analysis of a sample of potential off-target sequences of the CRISPR-TFL1.1 construct indicated the absence of edition in cases of three mismatches. In addition, transient transformation with the CRISPR-PDS construct produced two T-DNA free edited apple lines. Our overall results indicate that, despite the frequent occurrence of chimerism, the CRISPR-Cas 9 system is a powerful and precise method to induce targeted mutagenesis in the first generation of apple and pear transgenic lines.","apple; pear","ターゲットゲノムエンジニアリングは、作物植物を改善するための古典的な植物育種およびトランスジェニック方法の代替として浮上しています。他の方法（亜鉛フィンガーヌクレアーゼまたはTALエフェクターヌクレアーゼ）の中で、CRISPR-Casシステムが最も効果的で便利で最も安価な方法であることが証明されました。この研究では、このシステムをリンゴに適用する条件を最適化し、梨での実現可能性を調査しました。概念の証明として、フィトエンデサチュラーゼ（PDS）およびターミナルフラワー1（TFL1）遺伝子をノックアウトすることを選択しました。編集効率を向上させるために、2つの異なるシングルガイドRNA（gRNA）を各ターゲット遺伝子のCas9ヌクレアーゼに関連付けました。これらのgRNAは、U3およびU6アップルプロモーターの制御下に置かれました。特徴的なアルビノ表現型は、MdPDS遺伝子を標的とするリンゴトランスジェニック系統の85％で得られました。MdTFL1.1遺伝子を標的とするリンゴトランスジェニック系統の93％およびPcTFL1.1を標的とする洋ナシトランスジェニック系統の9％で早期開花が観察された。リンゴとナシのCRISPR-PDSおよびCRISPR-TFL1.1トランスジェニック系統の標的ゾーンの配列決定は、2つのgRNAが変異を誘発したが、頻度は変動することを示した。ほとんどの場合、Cas9ヌクレアーゼは、プロトスペーサーに隣接するモチーフの近くの20のターゲット塩基ペアでDNAを切断し、挿入は削除または置換よりも頻繁でした。PDSおよびTFL1.1遺伝子の最も頻繁なエディションのプロファイルは、キメラ2対立遺伝子でした。CRISPR-TFL1.1コンストラクトの潜在的なオフターゲット配列のサンプルの分析は、3つのミスマッチの場合にエディションがないことを示しました。さらに、CRISPR-PDSコンストラクトによる一時的な変換により、2つのT-DNAフリー編集アップルラインが生成されました。私たちの全体的な結果は、キメラ現象が頻繁に発生するにもかかわらず、CRISPR-Cas 9システムは、第一世代のリンゴとナシのトランスジェニック系統で標的突然変異誘発を誘導するための強力で正確な方法であることを示しています。"]
[2,31143243,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyltransferase (HCT); Golgi-localized nucleotide sugar transporter2 (GONST2)","Biotechnology for biofuels","A screening method to identify efficient sgRNAs in Arabidopsis, used in conjunction with cell-specific lignin reduction.",2019,"12:130","[Liang Y et al.]","Joint BioEnergy Institute, Emeryville, CA USA.",31143243,"10.1186/s13068-019-1467-y ","Background: Single guide RNA (sgRNA) selection is important for the efficiency of CRISPR/Cas9-mediated genome editing. However, in plants, the rules governing selection are not well established. Results: We developed a facile transient assay to screen sgRNA efficiency. We then used it to test top-performing bioinformatically predicted sgRNAs for two different Arabidopsis genes. In our assay, these sgRNAs had vastly different editing efficiencies, and these efficiencies were replicated in stably transformed Arabidopsis lines. One of the  genes, hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyltransferase (HCT),  is an essential gene, required for lignin biosynthesis. Previously, HCT function  has been studied using gene silencing. Here, to avoid the negative growth effects that are due to the loss of HCT activity in xylem vessels, we used a fiber-specific promoter to drive CAS9 expression. Two independent transgenic lines showed the expected lignin decrease. Successful editing was confirmed via the observation of mutations at the HCT target loci, as well as an approximately  90% decrease in HCT activity. Histochemical analysis and a normal growth phenotype support the fiber-specific knockout of HCT. For the targeting of the second gene, Golgi-localized nucleotide sugar transporter2 (GONST2), a highly efficient sgRNA drastically increased the rate of germline editing in T1 generation. Conclusions: This screening method is widely applicable, and the selection and use of efficient sgRNAs will accelerate the process of expanding germplasm for both molecular breeding and research. In addition, this, to the best of our knowledge, is the first application of constrained genome editing to  obtain chimeric plants of essential genes, thereby providing a dominant method to avoid lethal growth phenotypes.","Arabidopsis","背景：シングルガイドRNA（sgRNA）の選択は、CRISPR / Cas9を介したゲノム編集の効率にとって重要です。しかし、植物では、選択を管理する規則は十分に確立されていません。結果：sgRNAの効率をスクリーニングするための簡単な一過性アッセイを開発しました。次に、それを使用して、2つの異なるシロイヌナズナ遺伝子の最高性能の生物情報学的に予測されたsgRNAをテストしました。私たちのアッセイでは、これらのsgRNAの編集効率は大きく異なり、これらの効率は安定して形質転換されたアラビドプシス系統で再現されました。遺伝子の1つであるヒドロキシシンナモイル-CoAシキメート/キネートヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ（HCT）は、リグニン生合成に必要な必須遺伝子です。以前は、HCT機能は遺伝子サイレンシングを使用して研究されてきました。ここでは、キシレム血管でのHCT活性の喪失に起因する負の成長効果を回避するために、ファイバー固有のプロモーターを使用してCAS9の発現を促進しました。2つの独立したトランスジェニック系統は、予想されるリグニンの減少を示しました。編集の成功は、HCTターゲット遺伝子座での変異の観察、およびHCT活性の約90％の減少によって確認されました。組織化学的分析と正常な成長表現型は、HCTの繊維特異的ノックアウトをサポートします。2番目の遺伝子であるゴルジ体に局在するヌクレオチド糖トランスポーター2（GONST2）を標的とする場合、非常に効率的なsgRNAにより、T1世代の生殖細胞系列編集の速度が大幅に増加しました。結論：このスクリーニング方法は広く適用可能であり、効率的なsgRNAの選択と使用は、分子育種と研究の両方のために生殖質を拡大するプロセスを加速します。さらに、これは、私たちの知る限りでは、必須遺伝子のキメラ植物を取得するための制約付きゲノム編集の最初のアプリケーションであり、それによって致命的な成長表現型を回避するための優勢な方法を提供します。"]
[3,31684863,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","PDX1.2","BMC plant biology","Clarification of the dispensability of PDX1.2 for Arabidopsis viability using CRISPR/Cas9.",2019,"19(1):464","[Dell'Aglio E et al.]","University of Geneva, Geneva, Switzerland.",31684863,"10.1186/s12870-019-2071-9 ","BACKGROUND: PDX1.2 has recently been shown to be a regulator of vitamin B6 biosynthesis in plants and is implicated in biotic and abiotic stress resistance. PDX1.2 expression is strongly and rapidly induced by heat stress. Interestingly,  PDX1.2 is restricted to eudicota, wherein it behaves as a non-catalytic pseudoenzyme and is suggested to provide an adaptive advantage to this clade. A first report on an Arabidopsis insertion mutant claims that PDX1.2 is indispensable for viability, being essential for embryogenesis. However, a later  study using an independent insertion allele suggests that knockout mutants of pdx1.2 are viable. Therefore, the essentiality of PDX1.2 for Arabidopsis viability is a matter of debate. Given the important implications of PDX1.2 in stress responses, it is imperative to clarify if it is essential for plant viability. RESULTS: We have studied the previously reported insertion alleles of  PDX1.2, one of which is claimed to be essential for embryogenesis (pdx1.2-1), whereas the other is viable (pdx1.2-2). Our study shows that pdx1.2-1 carries multiple T-DNA insertions, but the T-DNA insertion in PDX1.2 is not responsible for the loss of embryogenesis. By contrast, the pdx1.2-2 allele is an overexpressor of PDX1.2 under standard growth conditions and not a null allele as previously reported. Nonetheless, upregulation of PDX1.2 expression under heat stress is impaired in this mutant line. In wild type Arabidopsis, studies of PDX1.2-YFP fusion proteins show that the protein is enhanced under heat stress conditions. To clarify if PDX1.2 is essential for Arabidopsis viability, we generated several independent mutant lines using the CRISPR-Cas9 gene editing technology. All of these lines are viable and behave similar to wild type under standard growth conditions. Reciprocal crosses of a subset of the CRISPR lines with pdx1.2-1 recovers viability of the latter line and demonstrates that knocking out the functionality of PDX1.2 does not impair embryogenesis. CONCLUSIONS: Gene editing reveals that PDX1.2 is dispensable for Arabidopsis viability and resolves conflicting reports in the literature on its function.","Arabidopsis","背景：PDX1.2は最近、植物におけるビタミンB6生合成の調節因子であることが示され、生物的および非生物的ストレス耐性に関係しています。PDX1.2の発現は、熱ストレスによって強力かつ迅速に誘導されます。興味深いことに、PDX1.2はeudicotaに限定されており、非触媒疑似酵素として動作し、このクレードに適応的な利点を提供することが示唆されています。アラビドプシス挿入変異体に関する最初の報告は、PDX1.2が生存に不可欠であり、胚形成に不可欠であると主張しています。ただし、独立した挿入対立遺伝子を使用した後の研究では、pdx1.2のノックアウト変異体が実行可能であることが示唆されています。したがって、アラビドプシスの生存能力に対するPDX1.2の本質は議論の余地があります。ストレス応答におけるPDX1.2の重要な意味を考えると、それが植物の生存に不可欠であるかどうかを明確にすることが不可欠です。結果：以前に報告されたPDX1.2の挿入対立遺伝子を研究しました。そのうちの1つは胚形成に必須であると主張されており（pdx1.2-1）、もう1つは実行可能です（pdx1.2-2）。私たちの研究は、pdx1.2-1が複数のT-DNA挿入を持っていることを示していますが、PDX1.2へのT-DNA挿入は胚形成の喪失の原因ではありません。対照的に、pdx1.2-2対立遺伝子は、標準的な増殖条件下でPDX1.2の過剰発現体であり、以前に報告されたヌル対立遺伝子ではありません。それにもかかわらず、熱ストレス下でのPDX1.2発現のアップレギュレーションは、この変異株では損なわれています。野生型アラビドプシスでは、PDX1.2-YFP融合タンパク質の研究により、タンパク質が熱ストレス条件下で増強されることが示されています。PDX1.2がArabidopsisの生存に不可欠であるかどうかを明らかにするために、CRISPR-Cas9遺伝子編集技術を使用していくつかの独立した変異株を生成しました。これらの系統はすべて実行可能であり、標準的な成長条件下で野生型と同様に動作します。CRISPRラインのサブセットとpdx1.2-1の相互交配は、後者のラインの生存率を回復し、PDX1.2の機能をノックアウトしても胚発生が損なわれないことを示しています。結論：遺伝子編集により、PDX1.2はアラビドプシスの生存に不可欠であり、その機能に関する文献の矛盾する報告を解決することが明らかになりました。"]
[4,30739798,"plant","Arabidopsis","RdDM;siRNA;","diverse RdDM proteins that are capable of targeting methylation and silencing in Arabidopsis when tethered to an artificial zinc finger (ZF-RdDM)?","Cell","Co-targeting RNA Polymerases IV and V Promotes Efficient De Novo DNA Methylation  in Arabidopsis.",2019,"176(5):1068-1082.e19","[Gallego-Bartolome J et al.]","University of California at Los Angeles, Los Angeles, CA, USA.",30739798,"10.1016/j.cell.2019.01.029 ","The RNA-directed DNA methylation (RdDM) pathway in plants controls gene expression via cytosine DNA methylation. The ability to manipulate RdDM would shed light on the mechanisms and applications of DNA methylation to control gene  expression. Here, we identified diverse RdDM proteins that are capable of targeting methylation and silencing in Arabidopsis when tethered to an artificial zinc finger (ZF-RdDM). We studied their order of action within the RdDM pathway by testing their ability to target methylation in different mutants. We also evaluated ectopic siRNA biogenesis, RNA polymerase V (Pol V) recruitment, targeted DNA methylation, and gene-expression changes at thousands of ZF-RdDM targets. We found that co-targeting both arms of the RdDM pathway, siRNA biogenesis and Pol V recruitment, dramatically enhanced targeted methylation. This work defines how RdDM components establish DNA methylation and enables new strategies for epigenetic gene regulation via targeted DNA methylation.","Arabidopsis","植物のRNA指向性DNAメチル化（RdDM）経路は、シトシンDNAメチル化を介して遺伝子発現を制御します。RdDMを操作する能力は、遺伝子発現を制御するためのDNAメチル化のメカニズムと応用に光を当てるでしょう。ここでは、人工亜鉛フィンガー（ZF-RdDM）につながれたときに、アラビドプシスのメチル化とサイレンシングをターゲットにできる多様なRdDMタンパク質を特定しました。さまざまな変異体のメチル化を標的とする能力をテストすることにより、RdDM経路内での作用の順序を研究しました。また、異所性siRNA生合成、RNAポリメラーゼV（Pol V）の動員、標的DNAメチル化、および数千のZF-RdDM標的における遺伝子発現の変化を評価しました。RdDM経路の両アーム、siRNA生合成、およびPol Vリクルートメントを同時ターゲットにすると、ターゲットのメチル化が劇的に強化されることがわかりました。この作業は、RdDMコンポーネントがDNAメチル化を確立する方法を定義し、ターゲットDNAメチル化を介したエピジェネティックな遺伝子調節の新しい戦略を可能にします。"]
[5,31666960,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","AP1; SVP; TFL1","Horticulture research","Targeted deletion of floral development genes in Arabidopsis with CRISPR/Cas9 using the RNA endoribonuclease Csy4 processing system.",2019,"6:99","[Liu Y et al.]","Beijing Forestry University, Beijing, China.",31666960,"10.1038/s41438-019-0179-6 ","The formation of flowers in higher plants is controlled by complex gene regulatory networks. The study of floral development in Arabidopsis is promoted and maintained by transposon-tagged mutant lines. In this study, we report a CRISPR/Cas9 genome-editing system based on RNA endoribonuclease Csy4 processing to induce high-efficiency and inheritable targeted deletion of transcription factors involved in floral development in Arabidopsis. Using AP1, SVP, and TFL1 as the target genes, multisite and multiple-gene mutations were achieved with a tandemly arrayed Csy4-sgRNA architecture to express multiplexed sgRNAs from a single transcript driven by the Pol II promoter in transgenic lines. Targeted deletions of chromosomal fragments between the first exon and second exon in either one or three genes were generated by using a single binary vector. Interestingly, the efficiency of site-targeted deletion was comparable to that of indel mutation with the multiplexed sgRNAs. DNA sequencing analysis of RT-PCR products showed that targeted deletions of AP1 and TFL1 could lead to frameshift  mutations and introduce premature stop codons to disrupt the open-reading frames  of the target genes. In addition, no RT-PCR amplified product was acquired after  SVP-targeted deletion. Furthermore, the targeted deletions resulted in abnormal floral development in the mutant lines compared to that of wild-type plants. AP1  and SVP mutations increased plant branching significantly, while TFL1 mutant plants displayed a change from indeterminate to determinate inflorescences. Thus, our results demonstrate that CRISPR/Cas9 with the RNA endoribonuclease Csy4 processing system is an efficient tool to study floral development and improve floral traits rapidly and simply.","Arabidopsis","高等植物の花の形成は、複雑な遺伝子調節ネットワークによって制御されています。アラビドプシスの花の発達の研究は、トランスポゾンタグ付き変異株によって促進され、維持されています。この研究では、RNAエンドリボヌクレアーゼCsy4プロセッシングに基づくCRISPR / Cas9ゲノム編集システムを報告し、アラビドプシスの花の発達に関与する転写因子の高効率で継承可能な標的欠失を誘導します。AP1、SVP、およびTFL1をターゲット遺伝子として使用して、マルチサイトおよび複数遺伝子の変異を、タンデムに配列されたCsy4-sgRNAアーキテクチャで実現し、トランスジェニック系統のPolIIプロモーターによって駆動される単一の転写産物から多重化sgRNAを発現させました。1つまたは3つの遺伝子の最初のエキソンと2番目のエキソンの間の染色体フラグメントのターゲットを絞った削除は、単一のバイナリベクトルを使用して生成されました。興味深いことに、サイトをターゲットとした削除の効率は、多重化されたsgRNAを使用したインデル変異の効率と同等でした。RT-PCR製品のDNAシーケンス分析は、AP1とTFL1のターゲットを絞った削除がフレームシフトの突然変異を引き起こし、ターゲット遺伝子のオープンリーディングフレームを破壊するために時期尚早の停止コドンを導入する可能性があることを示しました。さらに、SVPを対象とした削除後、RT-PCR増幅産物は取得されませんでした。さらに、標的とされた欠失は、野生型植物のそれと比較して、突然変異系統において異常な花の発達をもたらした。AP1およびSVP変異は植物の分岐を有意に増加させましたが、TFL1変異植物は不確定な花序から確定的な花序への変化を示しました。したがって、我々の結果は、RNAエンドリボヌクレアーゼCsy4プロセッシングシステムを備えたCRISPR / Cas9が、花の発達を研究し、花の形質を迅速かつ簡単に改善するための効率的なツールであることを示しています。"]
[6,31159296,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","DPA4 (Development-Related PcG Target in the APEX4); SOD7 (Suppressor of da1-1)","International journal of molecular sciences","Genome Editing to Integrate Seed Size and Abiotic Stress Tolerance Traits in Arabidopsis Reveals a Role for DPA4 and SOD7 in the Regulation of Inflorescence Architecture.",2019,"20(11)","[Chen S et al.]","Linyi University, Linyi, China.",31159296,"10.3390/ijms20112695 ","Both seed size and abiotic stress tolerance are important agronomic traits in crops. In Arabidopsis, two closely related transcription repressors DPA4 (Development-Related PcG Target in the APEX4)/NGAL3 and SOD7 (Suppressor of da1-1)/NGAL2 (NGATHA-like protein) function redundantly to regulate seed size, which was increased in the dpa4 sod7 double mutants. Whereas ABA-induced transcription repressors (AITRs) are involved in the regulation of ABA signaling  and abiotic stress tolerance, Arabidopsis aitr2 aitr5 aitr6 (aitr256) triple mutant showed enhanced tolerance to drought and salt. Here we performed CRISPR/Cas9 genome editing to disrupt DPA4 and SOD7 in aitr256 mutant, trying to  integrate seed size and abiotic stress tolerance traits in Arabidopsis, and also  to examine whether DPA4 and SOD7 may regulate other aspects of plant growth and development. Indeed, seed size was increased in the dpa4 sod7 aitr256 quintuple mutants, and enhanced tolerance to drought was observed in the mutants. In addition, we found that shoot branching was affected in the dpa4 sod7 aitr256 mutants. The mutant plants failed to produce secondary branches, and flowers/siliques were distributed irregularly on the main stems of the plants. Floral organ number and fertility were also affected in the dpa4 sod7 aitr256 mutant plants. To examine if these phenotypes were dependent on loss-of-function  of AITRs, dpa4 sod7 double mutants were generated in Col wild type background, and we found that the dpa4 sod7 mutant plants showed a phenotype similar to the dpa4 sod7 aitr256 quintuple mutants. Taken together, our results indicate that the integration of seed size and abiotic stress tolerance traits by CRISPR/Cas9 editing was successful, and our results also revealed a role of DPA4 and SOD7 in  the regulation of inflorescence architecture in Arabidopsis.","Arabidopsis","種子のサイズと非生物的ストレス耐性の両方が、作物の重要な農業特性です。アラビドプシスでは、2つの密接に関連する転写抑制因子DPA4（APEX4の開発関連PcGターゲット）/ NGAL3およびSOD7（da1-1の抑制因子）/ NGAL2（NGATHA様タンパク質）が重複して機能し、種子サイズを調節します。 dpa4sod7二重変異体。ABA誘導転写抑制因子（AITR）がABAシグナル伝達と非生物的ストレス耐性の調節に関与しているのに対し、Arabidopsis aitr2 aitr5 aitr6（aitr256）三重変異体は干ばつと塩に対する耐性の強化を示しました。ここでは、CRISPR / Cas9ゲノム編集を実行して、aitr256変異体のDPA4とSOD7を破壊し、アラビドプシスの種子サイズと非生物的ストレス耐性特性を統合し、DPA4とSOD7が植物の成長と発達の他の側面を調節するかどうかを調べました。確かに、種子のサイズはdpa4 sod7 aitr256五重変異体で増加し、干ばつに対する耐性の強化が変異体で観察されました。さらに、シュートの分岐がdpa4 sod7aitr256変異体で影響を受けることを発見しました。突然変異植物は二次枝を作ることができず、花/長角果は植物の主茎に不規則に分布していた。花器官の数と肥沃度もdpa4sod7aitr256変異植物で影響を受けました。これらの表現型がAITRの機能喪失に依存しているかどうかを調べるために、Col野生型バックグラウンドでdpa4 sod7二重変異体が生成され、dpa4sod7変異体植物がdpa4sod7aitr256五重変異体と同様の表現型を示すことがわかりました。まとめると、我々の結果は、CRISPR / Cas9編集による種子サイズと非生物的ストレス耐性特性の統合が成功したことを示しており、我々の結果は、アラビドプシスの花序構造の調節におけるDPA4とSOD7の役割も明らかにしました。"]
[7,30928533,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","wuschel-related homeobox 11-3; wox12-3","Journal of genetics and genomics = Yi chuan xue bao","Control of de novo root regeneration efficiency by developmental status of Arabidopsis leaf explants.",2019,"46(3):133-140","[Pan J et al.]","Shanghai Institute of Plant Physiology and Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China.",30928533,"10.1016/j.jgg.2019.03.001 ","De novo root regeneration (DNRR) has wide applications in agriculture such as those related to cutting technology. Detached Arabidopsis thaliana leaf explants  can regenerate adventitious roots without added hormones. The regenerative ability is highly dependent on the developmental status of the leaf. An immature  leaf has a higher regenerative ability, while a mature leaf is difficult to regenerate. Using RNA-Seq analysis, we showed that the expression levels of many  genes, including those in the auxin network, changed during leaf maturation. Particularly, the expression levels of many YUCCA (YUC) genes in the auxin biosynthesis pathway are responsive to leaf maturation. Overexpression of YUC1 in the yuc-1D dominant mutant rescued the rooting defects caused by leaf maturation. In addition, YUC4 expression levels were also affected by circadian rhythms. The  regenerative ability was reduced in both immature and mature mutant leaf explants from the new wuschel-related homeobox 11-3 (wox11-3) and wox12-3 mutant alleles created by the CRISPR/Cas9 method. Overall, the transcriptome and genetic data, together with the auxin concentration analysis, indicate that the ability to upregulate auxin levels upon detachment may be reduced during leaf maturation. Thus, multiple developmental and environmental signals may converge to control auxin accumulation, which affects the efficiency of the WOX11/12-mediated DNRR from leaf explants.","Arabidopsis","デノボルートリジェネレーション（DNRR）は、切断技術に関連するものなど、農業で幅広い用途があります。切り離されたArabidopsisthalianaの葉の外植片は、ホルモンを追加しなくても不定根を再生できます。再生能力は、葉の発達状態に大きく依存します。未熟な葉は再生能力が高く、成熟した葉は再生が困難です。RNA-Seq分析を使用して、オーキシンネットワーク内の遺伝子を含む多くの遺伝子の発現レベルが葉の成熟中に変化することを示しました。特に、オーキシン生合成経路における多くのYUCCA（YUC）遺伝子の発現レベルは、葉の成熟に反応します。yuc-1D優性突然変異体におけるYUC1の過剰発現は、葉の成熟によって引き起こされた発根欠陥を救済しました。さらに、YUC4の発現レベルもサーカディアンリズムの影響を受けました。再生能力は、CRISPR / Cas9メソッドによって作成された新しいwuschel関連ホメオボックス11-3（wox11-3）およびwox12-3変異対立遺伝子からの未成熟および成熟変異葉外植片の両方で低下しました。全体として、トランスクリプトームと遺伝子データは、オーキシン濃度分析とともに、剥離時にオーキシンレベルをアップレギュレートする能力が葉の成熟中に低下する可能性があることを示しています。したがって、複数の発生および環境信号が収束してオーキシンの蓄積を制御する可能性があり、これは葉の外植片からのWOX11 / 12を介したDNRRの効率に影響を及ぼします。"]
[8,30415491,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","NAC transcription factor (ANAC092)","Journal of integrative plant biology","Arabidopsis ANAC092 regulates auxin-mediated root development by binding to the ARF8 and PIN4 promoters.",2019,"61(9):1015-1031","[Xi D et al.]","Fudan University, Shanghai, China.",30415491,"10.1111/jipb.12735 ","Auxin is an important plant hormone that is essential for growth and development  due to its effects on organogenesis, morphogenesis, tropisms, and apical dominance. The functional diversity of auxin highlights the importance of its biosynthesis, transport, and associated responses. In this study, we show that a  NAC transcription factor, ANAC092 (also named AtNAC2 and ORESARA1), known to positively regulate leaf senescence and contribute to abiotic stress responses, also affects primary root development. Plants overexpressing ANAC092 had altered  root meristem lengths and shorter primary roots compared with the wild-type control. Additionally, expression of the proANAC092::GUS was strongly induced by  indole-3-acetic acid. Quantitative real-time RT-PCR (qRT-PCR) analysis revealed that the YUCCA2, PIN, and ARF expression levels were downregulated in ANAC092-overexpressing plants. Moreover, yeast one-hybrid and chromatin immunoprecipitation assays confirmed that ANAC092 binds to the promoters of AUXIN RESPONSE FACTOR 8 (ARF8) and PIN-FORMED 4 (PIN4). Furthermore, a dual-luciferase  assay indicated that ANAC092 decreases ARF8 and PIN4 promoter activities. We also applied a CRISPR/Cas9 system to mutate ANAC092. The roots of three of the analyzed mutants were longer than normal. Collectively, our findings indicate that ANAC092 negatively affects root development by controlling the auxin pathway.","Arabidopsis","オーキシンは、器官形成、形態形成、向性、頂芽優勢に影響を与えるため、成長と発達に不​​可欠な重要な植物ホルモンです。オーキシンの機能的多様性は、その生合成、輸送、および関連する応答の重要性を強調しています。この研究では、葉の老化を積極的に調節し、非生物的ストレス応答に寄与することが知られているNAC転写因子ANAC092（AtNAC2およびORESARA1とも呼ばれる）も一次根の発達に影響を与えることを示します。ANAC092を過剰発現する植物は、野生型コントロールと比較して、根のメリステムの長さが変化し、一次根が短くなりました。さらに、proANAC092 :: GUSの発現はインドール-3-酢酸によって強く誘導されました。定量的リアルタイムRT-PCR（qRT-PCR）分析により、YUCCA2、PIN、およびARFの発現レベルがANAC092過剰発現植物でダウンレギュレートされていることが明らかになりました。さらに、酵母ワンハイブリッドおよびクロマチン免疫沈降アッセイにより、ANAC092がAUXIN RESPONSE FACTOR 8（ARF8）およびPIN-FORMED 4（PIN4）のプロモーターに結合することが確認されました。さらに、デュアルルシフェラーゼアッセイは、ANAC092がARF8およびPIN4プロモーター活性を低下させることを示しました。また、ANAC092を変異させるためにCRISPR / Cas9システムを適用しました。分析された突然変異体のうちの3つの根は通常より長かった。まとめると、我々の発見は、ANAC092がオーキシン経路を制御することによって根の発達に悪影響を与えることを示しています。"]
[9,31392536,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","green fluorescent protein","Molecular biology reports","CRISPR/Cas9-mediated gfp gene inactivation in Arabidopsis suspension cells.",2019,"46(6):5735-5743","[Permyakova NV  et al.]","Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia.",31392536,"10.1007/s11033-019-05007-y ","Targeted genome editing using CRISPR/Cas9 is a promising technology successfully  verified in various plant species; however, it has hardly been used in plant cell suspension cultures. Here, we describe a successful knockout of a green fluorescent protein (gfp) reporter gene in Arabidopsis cell culture. We transformed seven transgenic suspension cell lines carrying one to three gfp gene copies with a binary vector containing genes coding for Cas9 and guide RNAs targeting the gfp gene. We detected the site-specific mutations by restriction analysis of a gfp amplicon. DNA sequencing of the PCR products confirmed high diversity of insertion-deletion mutations in the cell lines after the editing. We also analyzed gfp mRNA expression by real-time PCR and observed a decrease in gfp transcription after the target site modification. We can conclude that the CRISPR/Cas9 system can be successfully used for introducing site-specific mutations into the genome of cultured suspension cells of Arabidopsis.","Arabidopsis","CRISPR / Cas9を使用したターゲットゲノム編集は、さまざまな植物種で成功裏に検証された有望な技術です。しかし、それは植物細胞浮遊培養ではほとんど使用されていません。ここでは、Arabidopsis細胞培養における緑色蛍光タンパク質（gfp）レポーター遺伝子のノックアウトの成功について説明します。1〜3個のgfp遺伝子コピーを持つ7つのトランスジェニック浮遊細胞株を、Cas9をコードする遺伝子とgfp遺伝子を標的とするガイドRNAを含むバイナリーベクターで形質転換しました。gfpアンプリコンの制限分析により、部位特異的変異を検出しました。PCR産物のDNA配列決定により、編集後の細胞株における挿入-欠失変異の多様性が確認されました。また、リアルタイムPCRによってgfp mRNAの発現を分析し、標的部位の修飾後のgfp転写の減少を観察しました。CRISPR / Cas9システムは、アラビドプシスの培養浮遊細胞のゲノムに部位特異的変異を導入するために首尾よく使用できると結論付けることができます。"]
[10,30508598,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","orosomucoid(orm)1; orm2","Molecular plant","A Plant Immune Receptor Degraded by Selective Autophagy.",2019,"12(1):113-123","[Yang F et al.]","University of Nebraska, Lincoln, NE, USA.",30508598,"10.1016/j.molp.2018.11.011 ","Plants recycle non-activated immune receptors to maintain a functional immune system. The Arabidopsis immune receptor kinase FLAGELLIN-SENSING 2 (FLS2) recognizes bacterial flagellin. However, the molecular mechanisms by which non-activated FLS2 and other non-activated plant PRRs are recycled remain not well understood. Here, we provide evidence showing that Arabidopsis orosomucoid (ORM) proteins, which have been known to be negative regulators of sphingolipid biosynthesis, act as selective autophagy receptors to mediate the degradation of  FLS2. Arabidopsis plants overexpressing ORM1 or ORM2 have undetectable or greatly diminished FLS2 accumulation, nearly lack FLS2 signaling, and are more susceptible to the bacterial pathogen Pseudomonas syringae. On the other hand, ORM1/2 RNAi plants and orm1 or orm2 mutants generated by the CRISPR/Cas9-mediated gene editing have increased FLS2 accumulation and enhanced FLS2 signaling, and are more resistant to P. syringae. ORM proteins interact with FLS2 and the autophagy-related protein ATG8. Interestingly, overexpression of ORM1 or ORM2 in  autophagy-defective mutants showed FLS2 abundance that is comparable to that in wild-type plants. Moreover, FLS2 levels were not decreased in Arabidopsis plants  overexpressing ORM1/2 derivatives that do not interact with ATG8. Taken together, these results suggest that selective autophagy functions in maintaining the homeostasis of a plant immune receptor and that beyond sphingolipid metabolic regulation ORM proteins can also act as selective autophagy receptors.","Arabidopsis","植物は、機能的な免疫システムを維持するために、非活性化免疫受容体をリサイクルします。シロイヌナズナの免疫受容体キナーゼであるFLAGELLIN-SENSING2（FLS2）は、細菌のフラジェリンを認識します。ただし、非活性化FLS2およびその他の非活性化植物PRRがリサイクルされる分子メカニズムは十分に理解されていないままです。ここでは、スフィンゴ脂質生合成の負の調節因子であることが知られているシロイヌナズナオロソムコイド（ORM）タンパク質が、FLS2の分解を仲介する選択的オートファジー受容体として機能することを示す証拠を提供します。ORM1またはORM2を過剰発現するアラビドプシス植物は、FLS2の蓄積が検出できないか大幅に減少し、FLS2シグナル伝達をほとんど欠いており、細菌性病原体Pseudomonassyringaeの影響を受けやすくなっています。一方、CRISPR / Cas9を介した遺伝子編集によって生成されたORM1 / 2 RNAi植物とorm1またはorm2変異体は、FLS2の蓄積を増加させ、FLS2シグナル伝達を強化し、P。syringaeに対してより耐性があります。ORMタンパク質は、FLS2およびオートファジー関連タンパク質ATG8と相互作用します。興味深いことに、オートファジー欠損変異体におけるORM1またはORM2の過剰発現は、野生型植物に匹敵するFLS2の存在量を示しました。さらに、FLS2レベルは、ATG8と相互作用しないORM1 / 2誘導体を過剰発現するアラビドプシス植物では減少しませんでした。まとめると、これらの結果は、選択的オートファジーが植物免疫受容体の恒常性を維持するのに機能し、スフィンゴ脂質代謝調節を超えて、ORMタンパク質が選択的オートファジー受容体としても機能できることを示唆している。"]
[11,30760722,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","specific loci, including the FWA promoter, triggering a developmental phenotype, and the SUPERMAN promoter","Nature communications","Site-specific manipulation of Arabidopsis loci using CRISPR-Cas9 SunTag systems.",2019,"10(1):729","[Papikian A et al.]","University of California, Los Angeles, CA, USA.",30760722,"10.1038/s41467-019-08736-7 ","Understanding genomic functions requires site-specific manipulation of loci via efficient protein effector targeting systems. However, few approaches for targeted manipulation of the epigenome are available in plants. Here, we adapt the dCas9-SunTag system to engineer targeted gene activation and DNA methylation  in Arabidopsis. We demonstrate that a dCas9-SunTag system utilizing the transcriptional activator VP64 drives robust and specific activation of several loci, including protein coding genes and transposable elements, in diverse chromatin contexts. In addition, we present a CRISPR-based methylation targeting  system for plants, utilizing a SunTag system with the catalytic domain of the Nicotiana tabacum DRM methyltransferase, which efficiently targets DNA methylation to specific loci, including the FWA promoter, triggering a developmental phenotype, and the SUPERMAN promoter. These SunTag systems represent valuable tools for the site-specific manipulation of plant epigenomes.","Arabidopsis","ゲノム機能を理解するには、効率的なタンパク質エフェクターターゲティングシステムを介した部位特異的な遺伝子座の操作が必要です。ただし、エピゲノムのターゲットを絞った操作のためのいくつかのアプローチは、植物で利用可能です。ここでは、dCas9-SunTagシステムを適応させて、アラビドプシスの標的遺伝子の活性化とDNAメチル化を設計します。転写活性化因子VP64を利用するdCas9-SunTagシステムが、多様なクロマチンの状況において、タンパク質コーディング遺伝子や転移因子を含むいくつかの遺伝子座の強力で特異的な活性化を促進することを示します。さらに、Nicotiana tabacum DRMメチルトランスフェラーゼの触媒ドメインを備えたSunTagシステムを利用した、植物用のCRISPRベースのメチル化ターゲティングシステムを紹介します。これは、FWAプロモーターを含む特定の遺伝子座にDNAメチル化を効率的にターゲティングし、発生表現型をトリガーします。 SUPERMANプロモーター。これらのSunTagシステムは、植物エピゲノムの部位特異的操作のための貴重なツールです。"]
[12,30778165,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","a nuclear locus that enhances sensitivity to the selection agent used for isolation of transplastomic events","Nature plants","High-efficiency generation of fertile transplastomic Arabidopsis plants.",2019,"5(3):282-289","[Ruf S et al.]","Max-Planck-Institut fur Molekulare Pflanzenphysiologie, Potsdam, Germany.",30778165,"10.1038/s41477-019-0359-2 ","The development of technologies for the stable genetic transformation of plastid  (chloroplast) genomes has been a boon to both basic and applied research. However, extension of the transplastomic technology to major crops and model plants has proven extremely challenging, and the species range of plastid transformation is still very much limited in that most species currently remain recalcitrant to plastid genome engineering. Here, we report an efficient plastid  transformation technology for the model plant Arabidopsis thaliana that relies on root-derived microcalli as a source tissue for biolistic transformation. The method produces fertile transplastomic plants at high frequency when combined with a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9)-generated knockout allele of a nuclear locus that enhances sensitivity to the selection agent used for isolation of transplastomic events. Our work makes the model organism of plant biology amenable to routine engineering of the plastid genome, facilitates the combination of plastid engineering with the power of Arabidopsis nuclear genetics, and informs the future development of plastid transformation protocols  for other recalcitrant species.","Arabidopsis","プラスチド（クロロプラスト）ゲノムの安定した遺伝子変換のための技術の開発は、基礎研究と応用研究の両方に恩恵をもたらしてきました。しかし、トランスプラストミック技術を主要な作物やモデル植物に拡張することは非常に困難であることが証明されており、プラスチド変換の種の範囲は、ほとんどの種が現在プラスチドゲノム工学に抵抗し続けているという点で依然として非常に限られています。ここでは、微粒子銃の形質転換のソース組織として根由来のマイクロカルスに依存するモデル植物シロイヌナズナの効率的な色素体形質転換技術を報告します。この方法は、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）-CRISPR関連タンパク質9（Cas9）によって生成された核遺伝子座のノックアウト対立遺伝子と組み合わせると、肥沃なトランスプラストミック植物を高頻度で生成します。トランスプラストミックイベント。私たちの仕事は、植物生物学のモデル生物をプラスチドゲノムの日常的なエンジニアリングに適したものにし、プラスチドエンジニアリングとアラビドプシス核遺伝学の力との組み合わせを容易にし、他の扱いにくい種のためのプラスチド変換プロトコルの将来の開発を知らせます。"]
[13,30585636,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","N REQUIREMENT  GENE 1 (NRG1A; NRG1B )","New phytologist","Differential regulation of TNL-mediated immune signaling by redundant helper CNLs.",2019,"222(2):938-953","[Wu Z et al.]","University of British Columbia, Vancouver, BC, Canada.",30585636,"10.1111/nph.15665 ","Higher plants utilize nucleotide-binding leucine-rich repeat domain proteins (NLRs) as intracellular immune receptors to recognize pathogen-derived effectors  and trigger a robust defense. The Activated Disease Resistance 1 (ADR1) family of coiled-coil NLRs (CNLs) have evolved as helper NLRs that function downstream of many TIR-type sensor NLRs (TNLs). Close homologs of ADR1s form the N REQUIREMENT  GENE 1 (NRG1) family in Arabidopsis, the function of which is unclear. Through CRISPR/Cas9 gene editing methods, we discovered that the tandemly repeated NRG1A  and NRG1B are functionally redundant and operate downstream of TNLs with differential strengths. Interestingly, ADR1s and NRG1s function in two distinct parallel pathways contributing to TNL-specific immunity. Synergistic effects on basal and TNL-mediated defense were detected among ADR1s and NRG1s. An intact P-loop of NRG1s is not required for mediating signals from sensor TNLs, whereas auto-active NRG1A exhibits autoimmunity. Importantly, NRG1s localize to the cytosol and endomembrane network regardless of the presence of effectors, suggesting a cytosolic activation mechanism. Taken together, different sensor TNLs differentially use two groups of helper NLRs, ADR1s and NRG1s, to transduce  downstream defense signals.","Arabidopsis","高等植物は、細胞内免疫受容体としてヌクレオチド結合ロイシンリッチリピートドメインタンパク質（NLR）を利用して、病原体由来のエフェクターを認識し、強力な防御を引き起こします。コイル状コイルNLR（CNL）のActivated Disease Resistance 1（ADR1）ファミリーは、多くのTIRタイプセンサーNLR（TNL）の下流で機能するヘルパーNLRとして進化してきました。ADR1の密接な同族体は、アラビドプシスのN REQUIREMENT GENE 1（NRG1）ファミリーを形成しますが、その機能は不明です。CRISPR / Cas9遺伝子編集法を通じて、タンデムに繰り返されるNRG1AとNRG1Bは機能的に冗長であり、強度の異なるTNLの下流で動作することを発見しました。興味深いことに、ADR1とNRG1は、TNL特異的免疫に寄与する2つの異なる並行経路で機能します。ADR1とNRG1の間で、基礎防御とTNLを介した防御に対する相乗効果が検出されました。センサーTNLからの信号を仲介するために、NRG1の完全なPループは必要ありませんが、自動アクティブNRG1Aは自己免疫を示します。重要なことに、NRG1は、エフェクターの存在に関係なく、サイトゾルと膜内ネットワークに局在し、サイトゾルの活性化メカニズムを示唆しています。まとめると、異なるセンサーTNLは、2つのグループのヘルパーNLR、ADR1とNRG1を差別的に使用して、下流の防御信号を変換します。"]
[14,30784179,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","eIF4E","Plant biotechnology journal","Mimicking natural polymorphism in eIF4E by CRISPR-Cas9 base editing is associated with resistance to potyviruses.",2019,"17(9):1736-1750","[Bastet A et al.]","GAFL, INRA, Montfavet, France.",30784179,"10.1111/pbi.13096 ","In many crop species, natural variation in eIF4E proteins confers resistance to potyviruses. Gene editing offers new opportunities to transfer genetic resistance to crops that seem to lack natural eIF4E alleles. However, because eIF4E are physiologically important proteins, any introduced modification for virus resistance must not bring adverse phenotype effects. In this study, we assessed the role of amino acid substitutions encoded by a Pisum sativum eIF4E virus-resistance allele (W69L, T80D S81D, S84A, G114R and N176K) by introducing them independently into the Arabidopsis thaliana eIF4E1 gene, a susceptibility factor to the Clover yellow vein virus (ClYVV). Results show that most mutations  were sufficient to prevent ClYVV accumulation in plants without affecting plant growth. In addition, two of these engineered resistance alleles can be combined with a loss-of-function eIFiso4E to expand the resistance spectrum to other potyviruses. Finally, we use CRISPR-nCas9-cytidine deaminase technology to convert the Arabidopsis eIF4E1 susceptibility allele into a resistance allele by  introducing the N176K mutation with a single-point mutation through C-to-G base editing to generate resistant plants. This study shows how combining knowledge on pathogen susceptibility factors with precise genome-editing technologies offers a feasible solution for engineering transgene-free genetic resistance in plants, even across species barriers.","Arabidopsis","多くの作物種では、eIF4Eタンパク質の自然変動がポチウイルスに対する耐性をもたらします。遺伝子編集は、天然のeIF4E対立遺伝子を欠いているように見える作物に遺伝的耐性を移す新しい機会を提供します。ただし、eIF4Eは生理学的に重要なタンパク質であるため、ウイルス耐性に導入された変更によって表現型に悪影響が及ぶことはありません。この研究では、Pisum sativum eIF4Eウイルス耐性対立遺伝子（W69L、T80D S81D、S84A、G114R、およびN176K）によってコードされるアミノ酸置換の役割を、それらを独立してArabidopsisthalianaeIF4E1遺伝子に導入することによって評価しました。クローバー黄色静脈ウイルス（ClYVV）。結果は、ほとんどの変異が、植物の成長に影響を与えることなく、植物におけるClYVVの蓄積を防ぐのに十分であることを示しています。さらに、これらの操作された耐性対立遺伝子のうちの2つを、機能喪失eIFiso4Eと組み合わせて、耐性スペクトルを他のポチウイルスに拡大することができます。最後に、CRISPR-nCas9-cytidine deaminaseテクノロジーを使用して、C-to-G塩基編集により、単一点突然変異を伴うN176K突然変異を導入して耐性植物を生成することにより、シロイヌナズナeIF4E1感受性対立遺伝子を耐性対立遺伝子に変換します。この研究は、病原体感受性因子に関する知識と正確なゲノム編集技術を組み合わせることで、種の壁を越えても、植物におけるトランスジーンフリーの遺伝的耐性を操作するための実行可能なソリューションを提供する方法を示しています。"]
[15,31381206,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cpf1;","three kinds of DNA ATPase complexes","Plant journal","In planta gene targeting can be enhanced by the use of CRISPR/Cas12a.",2019,"100(5):1083-1094","[Wolter F et al.]","Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany.",31381206,"10.1111/tpj.14488 ","The controlled change of plant genomes by homologous recombination (HR) is still  difficult to achieve. We previously developed the in planta gene targeting (ipGT) technology which depends on the simultaneous activation of the target locus by a  double-strand break and the excision of the target vector. Whereas the use of SpCas9 resulted in low ipGT frequencies in Arabidopsis, we were recently able to  improve the efficiency by using egg cell-specific expression of the potent but less broadly applicable SaCas9 nuclease. In this study, we now tested whether we  could improve ipGT further, by either performing it in cells with enhanced intrachromosomal HR efficiencies or by the use of Cas12a, a different kind of CRISPR/Cas nuclease with an alternative cutting mechanism. We could show before that plants possess three kinds of DNA ATPase complexes, which all lead to instabilities of homologous genomic repeats if lost by mutation. As these proteins act in independent pathways, we tested ipGT in double mutants in which intrachromosomal HR is enhanced 20-80-fold. However, we were not able to obtain higher ipGT frequencies, indicating that mechanisms for gene targeting (GT) and chromosomal repeat-induced HR differ. However, using LbCas12a, the GT frequencies were higher than with SaCas9, despite a lower non-homologous end-joining (NHEJ) induction efficiency, demonstrating the particular suitability of Cas12a to induce HR. As SaCas9 has substantial restrictions due to its longer GC rich PAM sequence, the use of LbCas12a with its AT-rich PAM broadens the range of ipGT drastically, particularly when targeting in CG-deserts like promoters and introns.","Arabidopsis","相同組換え（HR）による植物ゲノムの制御された変化は、まだ達成が困難です。我々は以前に、二本鎖切断による標的遺伝子座の同時活性化と標的ベクターの切除に依存する植物内遺伝子標的化（ipGT）技術を開発した。SpCas9を使用すると、アラビドプシスのipGT頻度が低くなりましたが、最近、強力であるがあまり広く適用されないSaCas9ヌクレアーゼの卵細胞特異的発現を使用することで効率を改善することができました。この研究では、染色体内HR効率が向上した細胞で実行するか、代替の切断メカニズムを備えた別の種類のCRISPR / CasヌクレアーゼであるCas12aを使用することにより、ipGTをさらに改善できるかどうかをテストしました。植物が3種類のDNAATPase複合体を持っていることを以前に示すことができました。これらはすべて、突然変異によって失われると、相同なゲノムリピートの不安定性につながります。これらのタンパク質は独立した経路で作用するため、染色体内HRが20〜80倍に増強された二重変異体でipGTをテストしました。ただし、より高いipGT頻度を取得することはできませんでした。これは、遺伝子ターゲティング（GT）と染色体反復誘発HRのメカニズムが異なることを示しています。ただし、LbCas12aを使用すると、非相同末端結合（NHEJ）誘導効率が低いにもかかわらず、GT周波数はSaCas9よりも高く、HRを誘導するCas12aの特定の適合性を示しています。SaCas9はGCリッチなPAMシーケンスが長いためにかなりの制限があるため、ATリッチなPAMとともにLbCas12aを使用すると、特にプロモーターやイントロンなどのCG砂漠をターゲットにする場合に、ipGTの範囲が大幅に広がります。"]
[16,31034471,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","DRE2","PLoS genetics","Canonical cytosolic iron-sulfur cluster assembly and non-canonical functions of DRE2 in Arabidopsis.",2019,"15(4):e1008094","[Wang X  et al.]","Peking University, Beijing, China.",31034471,"10.1371/journal.pgen.1008094 ","As a component of the Cytosolic Iron-sulfur cluster Assembly (CIA) pathway, DRE2  is essential in organisms from yeast to mammals. However, the roles of DRE2 remain incompletely understood largely due to the lack of viable dre2 mutants. In this study, we successfully created hypomorphic dre2 mutants using the CRISPR/Cas9 technology. Like other CIA pathway mutants, the dre2 mutants have accumulation of DNA lesions and show constitutive DNA damage response. In addition, the dre2 mutants exhibit DNA hypermethylation at hundreds of loci. The  mutant forms of DRE2 in the dre2 mutants, which bear deletions in the linker region of DRE2, lost interaction with GRXS17 but have stronger interaction with NBP35, resulting in the CIA-related defects of dre2. Interestingly, we find that  DRE2 is also involved in auxin response that may be independent of its CIA role.  DRE2 localizes in both the cytoplasm and the nucleus and nuclear DRE2 associates  with euchromatin. Furthermore, DRE2 directly associates with multiple auxin responsive genes and maintains their normal expression. Our study highlights the  importance of the linker region of DRE2 in coordinating CIA-related protein interactions and identifies the canonical and non-canonical roles of DRE2 in maintaining genome stability, epigenomic patterns, and auxin response.","Arabidopsis","細胞質ゾルの鉄-硫黄クラスターアセンブリ（CIA）経路の構成要素として、DRE2は酵母から哺乳類までの生物に不可欠です。ただし、DRE2の役割は、主に実行可能なdre2変異体がないため、完全には理解されていないままです。この研究では、CRISPR / Cas9テクノロジーを使用してhypomorphicdre2変異体を作成することに成功しました。他のCIA経路変異体と同様に、dre2変異体はDNA損傷の蓄積があり、構成的なDNA損傷応答を示します。さらに、dre2変異体は、数百の遺伝子座でDNAメチル化を示します。DRE2のリンカー領域に欠失があるdre2変異体のDRE2の変異型は、GRXS17との相互作用を失いましたが、NBP35との相互作用が強く、dre2のCIA関連の欠陥が生じました。興味深いことに、DRE2は、CIAの役割とは独立している可能性のあるオーキシン応答にも関与していることがわかりました。DRE2は細胞質と核の両方に局在し、核のDRE2はユークロマチンと結合します。さらに、DRE2は複数のオーキシン応答性遺伝子と直接結合し、それらの正常な発現を維持します。私たちの研究は、CIA関連のタンパク質相互作用の調整におけるDRE2のリンカー領域の重要性を強調し、ゲノムの安定性、エピゲノムパターン、およびオーキシン応答の維持におけるDRE2の標準的および非標準的な役割を特定します。"]
[17,31545795,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","AITR","PloS one","Integration of a FT expression cassette into CRISPR/Cas9 construct enables fast generation and easy identification of transgene-free mutants in Arabidopsis.",2019,"14(9):e0218583","[Cheng Y et al.]","Northeast Normal University, Changchun, Jilin, China.",31545795,"10.1371/journal.pone.0218583 ","The CRISPR/Cas9 genome editing technique has been widely used to generate transgene-free mutants in different plant species. Several different methods including fluorescence marker-assisted visual screen of transgene-free mutants and programmed self-elimination of CRISPR/Cas9 construct have been used to increase the efficiency of genome edited transgene-free mutant isolation, but the overall time length required to obtain transgene-free mutants has remained unchanged in these methods. We report here a method for fast generation and easy  identification of transgene-free mutants in Arabidopsis. By generating and using  a single FT expression cassette-containing CRISPR/Cas9 construct, we targeted two sites of the AITR1 gene. We obtained many early bolting plants in T1 generation,  and found that about two thirds of these plants have detectable mutations. We then analyzed T2 generations of two representative lines of genome edited early bolting T1 plants, and identified plants without early bolting phenotype, i.e., transgene-free plants, for both lines. Further more, aitr1 homozygous mutants were successful obtained for both lines from these transgene-free plants. Taken together, these results suggest that the method described here enables fast generation, and at the mean time, easy identification of transgene-free mutants in plants.","Arabidopsis","CRISPR / Cas9ゲノム編集技術は、さまざまな植物種で導入遺伝子を含まない変異体を生成するために広く使用されています。トランスジーンフリー変異体の蛍光マーカー支援視覚スクリーニングおよびCRISPR / Cas9コンストラクトのプログラムされた自己除去を含むいくつかの異なる方法が、ゲノム編集されたトランスジーンフリー変異体単離の効率を高めるために使用されてきたが、トランスジーンを取得するために必要な全体の時間これらの方法では、遊離変異体は変化していません。ここでは、シロイヌナズナの導入遺伝子を含まない変異体を迅速に生成し、簡単に同定する方法を報告します。CRISPR / Cas9コンストラクトを含む単一のFT発現カセットを生成して使用することにより、AITR1遺伝子の2つの部位をターゲットにしました。T1世代で多くの初期のボルト締め植物を入手し、これらの植物の約3分の2に検出可能な変異があることを発見しました。次に、ゲノム編集された初期のボルト締めT1植物の2つの代表的な系統のT2世代を分析し、両方の系統について、初期のボルト締め表現型のない植物、つまり導入遺伝子を含まない植物を特定しました。さらに、aitr1ホモ接合変異体は、これらの導入遺伝子を含まない植物からの両方の系統で首尾よく得られた。まとめると、これらの結果は、ここで説明する方法が高速生成を可能にし、同時に、植物のトランスジーンフリー変異体の容易な同定を可能にすることを示唆しています。"]
[18,30625150,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;"," ","PloS one","Optimization of T-DNA architecture for Cas9-mediated mutagenesis in Arabidopsis.",2019,"14(1):e0204778","[Castel B  et al.]","Sainsbury Laboratory, Norwich, UK.",30625150,"10.1371/journal.pone.0204778 ","Bacterial CRISPR systems have been widely adopted to create operator-specified site-specific nucleases. Such nuclease action commonly results in loss-of-function alleles, facilitating functional analysis of genes and gene families We conducted a systematic comparison of components and T-DNA architectures for CRISPR-mediated gene editing in Arabidopsis, testing multiple promoters, terminators, sgRNA backbones and Cas9 alleles. We identified a T-DNA architecture that usually results in stable (i.e. homozygous) mutations in the first generation after transformation. Notably, the transcription of sgRNA and Cas9 in head-to-head divergent orientation usually resulted in highly active lines. Our Arabidopsis data may prove useful for optimization of CRISPR methods in other plants.","Arabidopsis","細菌のCRISPRシステムは、オペレーターが指定した部位特異的ヌクレアーゼを作成するために広く採用されています。このようなヌクレアーゼ作用は一般に機能喪失対立遺伝子をもたらし、遺伝子および遺伝子ファミリーの機能分析を容易にします。アラビドプシスにおけるCRISPRを介した遺伝子編集のためのコンポーネントおよびT-DNAアーキテクチャの体系的な比較を実施し、複数のプロモーター、ターミネーター、sgRNAバックボーンをテストしました。およびCas9対立遺伝子。通常、変換後の第1世代で安定した（つまりホモ接合の）変異をもたらすT-DNAアーキテクチャを特定しました。特に、sgRNAとCas9の頭から頭への発散方向での転写は、通常、非常に活発な系統をもたらしました。私たちのArabidopsisデータは、他のプラントでのCRISPRメソッドの最適化に役立つ可能性があります。"]
[19,31147630,"plant","Arabidopsis","CRISPR;Cas9;","abscisic acid (ABA)-responsive element binding protein 1 (AREB1)","Scientific reports","Improved drought stress tolerance in Arabidopsis by CRISPR/dCas9 fusion with a Histone AcetylTransferase.",2019,"9(1):8080","[Roca Paixao JF et al.]","Embrapa Genetic Resources and Biotechnology, Brasilia, DF, Brazil",31147630,"10.1038/s41598-019-44571-y ","Drought episodes decrease plant growth and productivity, which in turn cause high economic losses. Plants naturally sense and respond to water stress by activating specific signalling pathways leading to physiological and developmental adaptations. Genetically engineering genes that belong to these pathways might improve the drought tolerance of plants. The abscisic acid (ABA)-responsive element binding protein 1/ABRE binding factor (AREB1/ABF2) is a key positive regulator of the drought stress response. We investigated whether the CRISPR activation (CRISPRa) system that targets AREB1 might contribute to improve drought stress tolerance in Arabidopsis. Arabidopsis histone acetyltransferase 1  (AtHAT1) promotes gene expression activation by switching chromatin to a relaxed  state. Stable transgenic plants expressing chimeric dCas9(HAT) were first generated. Then, we showed that the CRISPRa dCas9(HAT) mechanism increased the promoter activity controlling the beta-glucuronidase (GUS) reporter gene. To activate the endogenous promoter of AREB1, the CRISPRa dCas9(HAT) system was set  up, and resultant plants showed a dwarf phenotype. Our qRT-PCR experiments indicated that both AREB1 and RD29A, a gene positively regulated by AREB1, exhibited higher gene expression than the control plants. The plants generated here showed higher chlorophyll content and faster stomatal aperture under water deficit, in addition to a better survival rate after drought stress. Altogether,  we report that CRISPRa dCas9(HAT) is a valuable biotechnological tool to improve  drought stress tolerance through the positive regulation of AREB1.","Arabidopsis","干ばつのエピソードは植物の成長と生産性を低下させ、それがひいては大きな経済的損失を引き起こします。植物は、生理学的および発達的適応につながる特定のシグナル伝達経路を活性化することにより、水ストレスを自然に感知して応答します。これらの経路に属する遺伝子を遺伝子操作すると、植物の干ばつ耐性が向上する可能性があります。アブシジン酸（ABA）応答性エレメント結合タンパク質1 / ABRE結合因子（AREB1 / ABF2）は、干ばつストレス応答の重要な正の調節因子です。AREB1をターゲットとするCRISPRアクティベーション（CRISPRa）システムが、アラビドプシスの干ばつストレス耐性の改善に寄与するかどうかを調査しました。アラビドプシスヒストンアセチルトランスフェラーゼ1（AtHAT1）は、クロマチンを弛緩状態に切り替えることにより、遺伝子発現の活性化を促進します。キメラdCas9（HAT）を発現する安定したトランスジェニック植物が最初に生成されました。次に、CRISPRa dCas9（HAT）メカニズムがベータグルクロニダーゼ（GUS）レポーター遺伝子を制御するプロモーター活性を増加させることを示しました。AREB1の内因性プロモーターを活性化するために、CRISPRa dCas9（HAT）システムがセットアップされ、得られた植物は矮性表現型を示しました。私たちのqRT-PCR実験は、AREB1とAREB1によって正に調節される遺伝子であるRD29Aの両方が、対照植物よりも高い遺伝子発現を示したことを示しました。ここで生成された植物は、干ばつストレス後のより良い生存率に加えて、水不足下でより高いクロロフィル含有量とより速い気孔開口を示しました。まとめると、CRISPRa dCas9（HAT）は、AREB1の積極的な規制を通じて、干ばつストレス耐性を改善するための貴重なバイオテクノロジーツールであることを報告します。"]
[20,31762012,"plant","Arabidopsis thaliana","CRISPR;Cas9;","CBF2","American journal of botany","Genetic and physiological mechanisms of freezing tolerance in locally adapted populations of a winter annual.",2019,null,"[Sanderson BJ  et al.]","Purdue University, West Lafayette, IN, USA.",31762012,"10.1002/ajb2.1385 ","PREMISE: Despite myriad examples of local adaptation, the phenotypes and genetic  variants underlying such adaptive differentiation are seldom known. Recent work on freezing tolerance and local adaptation in ecotypes of Arabidopsis thaliana from Italy and Sweden provides an essential foundation for uncovering the genotype-phenotype-fitness map for an adaptive response to a key environmental stress. METHODS: We examined the consequences of a naturally occurring loss-of-function (LOF) mutation in an Italian allele of the gene that encodes the transcription factor CBF2, which underlies a major freezing-tolerance locus. We used four lines with a Swedish genetic background, each containing a LOF CBF2 allele. Two lines had introgression segments containing the Italian CBF2 allele,  and two contained deletions created using CRISPR-Cas9. We used a growth chamber experiment to quantify freezing tolerance and gene expression before and after cold acclimation. RESULTS: Freezing tolerance was lower in the Italian (11%) compared to the Swedish (72%) ecotype, and all four experimental CBF2 LOF lines had reduced freezing tolerance compared to the Swedish ecotype. Differential expression analyses identified 10 genes for which all CBF2 LOF lines, and the IT  ecotype had similar patterns of reduced cold responsive expression compared to the SW ecotype. CONCLUSIONS: We identified 10 genes that are at least partially regulated by CBF2 that may contribute to the differences in cold-acclimated freezing tolerance between the Italian and Swedish ecotypes. These results provide novel insight into the molecular and physiological mechanisms connecting  a naturally occurring sequence polymorphism to an adaptive response to freezing conditions.","Arabidopsis","前提：局所適応の無数の例にもかかわらず、そのような適応分化の根底にある表現型と遺伝的変異はめったに知られていません。イタリアとスウェーデンのArabidopsisthalianaのエコタイプにおける耐凍性と局所適応に関する最近の研究は、主要な環境ストレスへの適応応答のための遺伝子型-表現型-適合性マップを明らかにするための重要な基盤を提供します。方法：主要な耐凍性遺伝子座の根底にある転写因子CBF2をコードする遺伝子のイタリアの対立遺伝子に自然に発生する機能喪失（LOF）変異の結果を調べました。スウェーデンの遺伝的背景を持つ4つのラインを使用し、それぞれにLOFCBF2対立遺伝子が含まれています。2つの行には、イタリアのCBF2対立遺伝子を含む侵入セグメントがあり、2つの行には、CRISPR-Cas9を使用して作成された削除が含まれていました。低温順化前後の耐凍性と遺伝子発現を定量化するために、成長チャンバー実験を使用しました。結果：耐凍性は、スウェーデン（72％）エコタイプと比較してイタリア（11％）で低く、4つの実験的CBF2 LOFラインはすべて、スウェーデンエコタイプと比較して耐凍性が低下していました。差次的発現分析により、すべてのCBF2 LOF系統とITエコタイプが、SWエコタイプと比較して同様のパターンの低温応答性発現の低下を示した10個の遺伝子が特定されました。結論：イタリアとスウェーデンのエコタイプ間の低温順化凍結耐性の違いに寄与する可能性のある、CBF2によって少なくとも部分的に調節されている10個の遺伝子を特定しました。これらの結果は、自然に発生する配列多型を凍結条件への適応応答に結び付ける分子的および生理学的メカニズムへの新しい洞察を提供します。"]
[21,31585004,"plant","Arabidopsis thaliana","CRISPR;Cas9;","SMALL AUXIN UP RNA SAUR41 subfamily genes (SAUR40; SAUR41; SAUR71; SAUR72)","Annals of botany","The SAUR41 subfamily of SMALL AUXIN UP RNA genes is abscisic acid-inducible to modulate cell expansion and salt tolerance in Arabidopsis thaliana seedlings.",2019,null,"[Qiu T et al.]","Zhejiang University, Hangzhou, China.",31585004,"10.1093/aob/mcz160 ","BACKGROUND AND AIMS: Most primary auxin response genes are classified into three  families: AUX/IAAs, GH3s, and SAURs. Few studies have been conducted on Arabidopsis SAURs, possibly due to genetic redundancy among different subfamily members. Data mining on Arabidopsis transcriptional profiles indicates that the SAUR41 subfamily members of SMALL AUXIN UP RNA genes are, strikingly, induced by  an inhibitory phytohormone, abscisic acid. We aimed to reveal the physiological roles of Arabidopsis SAUR41 subfamily genes containing SAUR40, SAUR41, SAUR71, and SAUR72. METHODS: Transcriptional responses of Arabidopsis SAUR41s to phytohormones were determined by quantitative real-time PCR. Knock out of SAUR41s was carried out with the CRISPR/Cas9 (Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR Associated Protein 9) genome editing technique. The saur41/40/71/72 quadruple mutants, the SAUR41 overexpression lines and the wild-type were subjected to ultra-structure observation, transcriptome analysis,  and physiological characterization. KEY RESULTS: Transcription of Arabidopsis SAUR41 subfamily genes is activated by ABA but not by gibberellic acids and brassinosteroids. Quadruple mutations in saur41/40/71/72 led to reduced cell expansion/elongation in cotyledons and hypocotyls, opposite to the SAUR41 overexpression; however, irregular arrangement of cell size and shape was observed in both cases. The quadruple mutants had increased transcription of calcium homeostasis/signaling genes in seedling shoots, and the SAUR41 overexpression lines had decreased transcription of iron homeostasis genes in roots and increased ABA biosynthesis in shoots. Notably, both the quadruple mutants and the SAUR41 overexpression lines were hypersensitive to salt stress during seedling establishment, whereas specific expression of SAUR41 under the ABA-responsive RD29A (Responsive to Desiccation 29A) promoter in the quadruple mutants rescued the inhibitory effect of salt stress. CONCLUSIONS: The SAUR41 subfamily genes of Arabidopsis are ABA-inducible to modulate cell expansion, ion  homeostasis and salt tolerance. Our work may provide new candidate genes for improvement of plant abiotic stress tolerance.","Arabidopsis","背景と目的：ほとんどの主要なオーキシン応答遺伝子は、AUX / IAA、GH3、およびSAURの3つのファミリーに分類されます。シロイヌナズナのSAURについては、おそらく異なる亜科のメンバー間の遺伝的冗長性のために、ほとんど研究が行われていません。アラビドプシスの転写プロファイルに関するデータマイニングは、SMALL AUXIN UP RNA遺伝子のSAUR41サブファミリーメンバーが、驚くべきことに、抑制性植物ホルモンであるアブシジン酸によって誘導されることを示しています。SAUR40、SAUR41、SAUR71、およびSAUR72を含むシロイヌナズナSAUR41サブファミリー遺伝子の生理学的役割を明らかにすることを目的としました。方法：植物ホルモンに対するArabidopsis SAUR41の転写応答は、定量的リアルタイムPCRによって決定されました。SAUR41のノックアウトは、CRISPR / Cas9（Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats / CRISPR Associated Protein 9）ゲノム編集技術を使用して実行されました。saur41 / 40/71/72四重変異体、SAUR41過剰発現系統、および野生型を、超構造観察、トランスクリプトーム分析、および生理学的特性評価に供しました。主な結果：Arabidopsis SAUR41サブファミリー遺伝子の転写は、ABAによって活性化されますが、ジベレリン酸やブラシノステロイドによっては活性化されません。saur41 / 40/71/72の4重変異は、SAUR41の過剰発現とは反対に、子葉および低子葉の細胞増殖/伸長の低下をもたらしました。ただし、どちらの場合もセルのサイズと形状の不規則な配置が観察されました。4重変異体は、実生のシュートでカルシウム恒常性/シグナル伝達遺伝子の転写が増加し、SAUR41過剰発現株は、根の鉄ホメオスタシス遺伝子の転写が減少し、シュートのABA生合成が増加しました。特に、4重変異体とSAUR41過剰発現系統の両方が実生樹立中の塩ストレスに対して過敏であったのに対し、4重変異体におけるABA応答性RD29A（乾燥に応答29A）プロモーター下でのSAUR41の特異的発現は塩ストレスの抑制効果を救った。結論：ArabidopsisのSAUR41サブファミリー遺伝子は、細胞増殖、イオン恒常性、耐塩性を調節するためにABA誘導性です。私たちの仕事は、植物の非生物的ストレス耐性を改善するための新しい候補遺伝子を提供するかもしれません。"]
[22,31297160,"plant","Arabidopsis thaliana","CRISPR;Cas9;","beta-ketoacyl-ACP synthase I (KASI)","Biotechnology for biofuels","Enhancing oil production in Arabidopsis through expression of a ketoacyl-ACP synthase domain of the PUFA synthase from Thraustochytrium.",2019,"12:172","[Xie X et al.]","University of Saskatchewan, Saskatoon, SK, Canada.",31297160,"10.1186/s13068-019-1514-8 ","Background: Plant seed oil is an important bioresource for human food and animal  feed, as well as industrial bioproducts. Therefore, increasing oil content in seeds has been one of the primary targets in the breeding programs of oilseed crops. Thraustochytrium is a marine protist that can produce a high level of very long-chain polyunsaturated fatty acids (VLCPUFAs) using a PUFA synthase, a polyketide synthase-like fatty acid synthase with multiple catalytic domains. Our previous study showed that a KS domain from the synthase could complement an Escherichia coli mutant defective in beta-ketoacyl-ACP synthase I (FabB) and increase the total fatty acid production. In this study, this KS domain from the  PUFA synthase was further functionally analyzed in Arabidopsis thaliana for the capacity of oil production. Results: The plastidial expression of the KS domain could complement the defective phenotypes of a KASI knockout mutant generated by  CRISPR/Cas9. Seed-specific expression of the domain in wild-type Arabidopsis significantly increased seed weight and seed oil, and altered the unsaturation level of fatty acids in seeds, as well as promoted seed germination and early seedling growth. Conclusions: The condensation process of fatty acid biosynthesis in plants is a limiting step, and overexpression of the KS domain from a PUFA synthase of microbial origin offers a new strategy to increase oil production in  oilseed plants.","Arabidopsis","背景：植物種子油は、人間の食物や動物の飼料、そして工業用バイオ製品にとって重要な生物資源です。したがって、種子中の油分を増やすことは、油糧種子作物の育種プログラムにおける主要な目標の1つでした。Thraustochytriumは、複数の触媒ドメインを持つポリケチドシンターゼ様脂肪酸シンターゼであるPUFAシンターゼを使用して、高レベルの非常に長鎖のポリ不飽和​​脂肪酸（VLCPUFA）を生成できる海洋プロティストです。私たちの以前の研究は、シンターゼからのKSドメインが、ベータ-ケトアシル-ACPシンターゼI（FabB）に欠陥のあるEscherichia coli変異体を補完し、総脂肪酸産生を増加させる可能性があることを示しました。この研究では、PUFAシンターゼからのこのKSドメインを、Arabidopsisthalianaで石油生産能力についてさらに機能的に分析しました。結果：KSドメインのプラスチド発現は、CRISPR / Cas9によって生成されたKASIノックアウト変異体の欠陥のある表現型を補完する可能性があります。野生型シロイヌナズナにおけるドメインの種子特異的発現は、種子重量と種子油を有意に増加させ、種子中の脂肪酸の不飽和レベルを変化させ、種子の発芽と初期の実生の成長を促進しました。結論：植物における脂肪酸生合成の凝縮プロセスは制限的なステップであり、微生物起源のPUFAシンターゼからのKSドメインの過剰発現は、油糧種子植物における油生産を増加させるための新しい戦略を提供します。"]
[23,31829135,"plant","Arabidopsis thaliana","CRISPR;","Col-0; BKN-1; BKN2","BMC plant biology","Investigations into a putative role for the novel BRASSIKIN pseudokinases in compatible pollen-stigma interactions in Arabidopsis thaliana.",2019,"19(1):549","[Doucet J et al.]","University of Toronto, Toronto, Canada.",31829135,"10.1186/s12870-019-2160-9 ","BACKGROUND: In the Brassicaceae, the early stages of compatible pollen-stigma interactions are tightly controlled with early checkpoints regulating pollen adhesion, hydration and germination, and pollen tube entry into the stigmatic surface. However, the early signalling events in the stigma which trigger these compatible interactions remain unknown. RESULTS: A set of stigma-expressed pseudokinase genes, termed BRASSIKINs (BKNs), were identified and found to be present in only core Brassicaceae genomes. In Arabidopsis thaliana Col-0, BKN1 displayed stigma-specific expression while the BKN2 gene was expressed in other tissues as well. CRISPR deletion mutations were generated for the two tandemly linked BKNs, and very mild hydration defects were observed for wild-type Col-0 pollen when placed on the bkn1/2 mutant stigmas. In further analyses, the predominant transcript for the stigma-specific BKN1 was found to have a premature stop codon in the Col-0 ecotype, but a survey of the 1001 Arabidopsis genomes uncovered three ecotypes that encoded a full-length BKN1 protein. Furthermore, phylogenetic analyses identified intact BKN1 orthologues in the closely related outcrossing Arabidopsis species, A. lyrata and A. halleri. Finally, the BKN pseudokinases were found to be plasma-membrane localized through the dual lipid modification of myristoylation and palmitoylation, and this localization would be consistent with a role in signaling complexes. CONCLUSION: In this study, we have characterized the novel Brassicaceae-specific family of BKN pseudokinase genes, and examined the function of BKN1 and BKN2 in the context of pollen-stigma interactions in A. thaliana Col-0. Additionally, premature stop codons were identified in the predicted stigma specific BKN1 gene in a number of the 1001 A.  thaliana ecotype genomes, and this was in contrast to the out-crossing Arabidopsis species which carried intact copies of BKN1. Thus, understanding the  function of BKN1 in other Brassicaceae species will be a key direction for future studies.","Arabidopsis","背景：Brassicaceaeでは、互換性のある花粉-柱頭相互作用の初期段階は、花粉の付着、水和と発芽、および柱頭表面への花粉管の侵入を調節する初期のチェックポイントで厳密に制御されます。ただし、これらの互換性のある相互作用をトリガーするスティグマの初期のシグナリングイベントは不明なままです。結果：BRASSIKIN（BKN）と呼ばれる、柱頭で発現したシュードキナーゼ遺伝子のセットが特定され、コアのBrassicaceaeゲノムにのみ存在することがわかりました。Arabidopsis thaliana Col-0では、BKN1は柱頭特異的発現を示し、BKN2遺伝子は他の組織でも発現していました。CRISPR欠失変異は、2つのタンデムにリンクされたBKNに対して生成され、bkn1 / 2変異体の柱頭に配置された場合、野生型Col-0花粉に対して非常に軽度の水和欠陥が観察されました。さらなる分析では、柱頭特異的BKN1の主要な転写産物は、Col-0エコタイプに時期尚早の停止コドンを持っていることがわかりましたが、1001アラビドプシスゲノムの調査により、完全長BKN1タンパク質をコードする3つのエコタイプが明らかになりました。さらに、系統発生分析により、密接に関連する異系交配種であるA.lyrataおよびA.halleriで無傷のBKN1オーソログが特定されました。最後に、BKNシュードキナーゼは、ミリストイル化とパルミトイル化の二重脂質修飾によって血漿膜に局在化することが見出され、この局在化は、シグナル伝達複合体における役割と一致するであろう。結論：この研究では、BKNシュードキナーゼ遺伝子の新規Brassicaceae特異的ファミリーの特性を明らかにし、A。thalianaCol-0における花粉-柱頭相互作用の文脈でBKN1およびBKN2の機能を調べました。さらに、1001 A. thalianaエコタイプゲノムの多くで予測された柱頭特異的BKN1遺伝子で時期尚早の停止コドンが同定され、これはBKN1の無傷のコピーを保有する交差するアラビドプシス種とは対照的でした。したがって、他のBrassicaceae種におけるBKN1の機能を理解することは、将来の研究の重要な方向性となるでしょう。"]
[24,31113822,"plant","Arabidopsis thaliana","CRISPR;Cas9;","zerzaust homolog","G3","Asymmetric Redundancy of ZERZAUST and ZERZAUST HOMOLOG in Different Accessions of Arabidopsis thaliana.",2019,"9(7):2245-2252","[Vaddepalli P  et al.]","Wageningen University, Wageningen, the Netherlands.",31113822,"10.1534/g3.119.400211 ","Divergence among duplicate genes is one of the important sources of evolutionary  innovation. But, the contribution of duplicate divergence to variation in Arabidopsis accessions is sparsely known. Recently, we studied the role of a cell wall localized protein, ZERZAUST (ZET), in Landsberg erecta (Ler) accession, lack of which results in aberrant plant morphology. Here, we present the study of ZET  in Columbia (Col) accession, which not only showed differential expression patterns in comparison to Ler, but also revealed its close homolog, ZERZAUST HOMOLOG (ZETH) Although, genetic analysis implied redundancy, expression analysis revealed divergence, with ZETH showing minimal expression in both Col and Ler In  addition, ZETH shows relatively higher expression levels in Col compared to Ler Our data also reveal compensatory up-regulation of ZETH in Col, but not in Ler, implying it is perhaps dispensable in Ler However, a novel CRISPR/Cas9-induced zeth allele confirmed that ZETH has residual activity in Ler Finally, the synergistic interaction of the receptor-like kinase gene, ERECTA with ZET in ameliorating morphological defects suggests crucial role of modifiers on plant phenotype. The results provide genetic evidence for accession-specific differences in compensation mechanism and asymmetric gene contribution. Thus, our work reveals a novel example for how weakly expressed homologs contribute to diversity among accessions.","Arabidopsis","重複する遺伝子間の相違は、進化的革新の重要な源の1つです。しかし、Arabidopsisアクセッションの変動に対する重複した発散の寄与はまばらに知られています。最近、Landsberg erecta（Ler）アクセッションにおける細胞壁局在タンパク質、ZERZAUST（ZET）の役割を研究しましたが、その欠如は異常な植物形態をもたらします。ここでは、コロンビア（Col）アクセッションにおけるZETの研究を紹介します。これは、Lerと比較して異なる発現パターンを示しただけでなく、その類似体であるZERZAUST HOMOLOG（ZETH）も明らかにしました。遺伝子分析は冗長性を意味しますが、発現分析は相違を明らかにしました。 、ZETHはColとLerの両方で最小限の発現を示していますさらに、ZETHはLerと比較してColで比較的高い発現レベルを示しています私たちのデータはまた、ColではZETHの代償的なアップレギュレーションを示していますが、Lerではそうではなく、おそらくLerでは不要であることを示唆していますしかし、新規のCRISPR / Cas9誘導zeth対立遺伝子は、ZETHがLerに残存活性を有することを確認しました。最後に、形態学的欠陥の改善における受容体様キナーゼ遺伝子、ERECTAとZETの相乗的相互作用は、植物表現型に対する修飾因子の重要な役割を示唆します。結果は、補償メカニズムと非対称遺伝子寄与におけるアクセッション固有の違いの遺伝的証拠を提供します。したがって、私たちの仕事は、弱く発現されたホモログがアクセッション間の多様性にどのように寄与するかについての新しい例を明らかにします。"]
[25,31450868,"plant","Arabidopsis thaliana","CRISPR;Cas9;","281 targets","International journal of molecular sciences","Comprehensive Analysis of CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis in Arabidopsis thaliana by Genome-wide Sequencing.",2019,"20(17)","[Xu W et al.]","China Agricultural University, Beijing, China.",31450868,"10.3390/ijms20174125 ","The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein (Cas) system has been widely applied in functional genomics research and plant breeding. In contrast to the off-target studies of mammalian cells, there is little evidence for the common occurrence of off-target sites in plants and a great need exists for accurate detection of editing sites. Here, we summarized the precision of CRISPR/Cas9-mediated mutations for 281 targets and found that there is a preference for single nucleotide deletions/insertions and longer deletions starting from 40 nt upstream or ending at 30 nt downstream of the cleavage site, which suggested the candidate sequences for editing sites detection by whole-genome sequencing (WGS). We analyzed the on-/off-target sites of 6 CRISPR/Cas9-mediated Arabidopsis plants by the optimized method. The results showed that the on-target editing frequency ranged from 38.1% to 100%, and one off target at a frequency of 9.8%-97.3% cannot be prevented by increasing the specificity or reducing the expression level of the Cas9 enzyme. These results indicated that designing guide RNA with high specificity may be the preferred factor to avoid the off-target events, and it is necessary to predict or detect off-target sites by WGS-based methods for preventing off targets caused by genome differences in different individuals.","Arabidopsis","クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質（Cas）システムは、機能ゲノミクス研究および植物育種に広く適用されています。哺乳類細胞のオフターゲット研究とは対照的に、植物におけるオフターゲット部位の一般的な発生の証拠はほとんどなく、編集部位の正確な検出に対する大きな必要性が存在します。ここでは、281ターゲットのCRISPR / Cas9を介した変異の精度を要約し、単一ヌクレオチドの欠失/挿入と、切断部位の40nt上流から30nt下流で終わるより長い欠失が優先されることを発見しました。全ゲノムシーケンシング（WGS）による編集部位検出の候補配列。最適化された方法により、6つのCRISPR / Cas9を介したArabidopsis植物のオン/オフターゲットサイトを分析しました。その結果、オンターゲット編集の頻度は38.1％から100％の範囲であり、Cas9酵素の特異性を高めたり、発現レベルを下げたりしても、9.8％〜97.3％の頻度で1つのオフターゲットを防ぐことはできません。これらの結果は、特異性の高いガイドRNAを設計することがオフターゲットイベントを回避するための好ましい要因である可能性があり、異なるゲノムの違いによって引き起こされるオフターゲットを防止するためのWGSベースの方法によってオフターゲットサイトを予測または検出する必要があることを示しました。個人。"]
[26,29958083,"plant","Arabidopsis thaliana","CRISPR;Cas9;","immune-associated nucleotide-binding gene (ian9)","Molecular plant-microbe interactions","The IMMUNE-ASSOCIATED NUCLEOTIDE-BINDING 9 Protein Is a Regulator of Basal Immunity in Arabidopsis thaliana.",2019,"32(1):65-75","[Wang Y et al.]","Shanghai Institutes of Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China.",29958083,"10.1094/MPMI-03-18-0062-R ","A robust regulation of plant immune responses requires a multitude of positive and negative regulators that act in concert. The immune-associated nucleotide-binding (IAN) gene family members are associated with immunity in different organisms, although no characterization of their function has been carried out to date in plants. In this work, we analyzed the expression patterns  of IAN genes and found that IAN9 is repressed upon pathogen infection or treatment with immune elicitors. IAN9 encodes a plasma membrane-localized protein that genetically behaves as a negative regulator of immunity. A novel ian9 mutant generated by CRISPR/Cas9 shows increased resistance to Pseudomonas syringae, while transgenic plants overexpressing IAN9 show a slight increase in susceptibility. In vivo immunoprecipitation of IAN9-green fluorescent protein followed by mass spectrometry analysis revealed that IAN9 associates with a previously uncharacterized C3HC4-type RING-finger domain-containing protein that  we named IAN9-associated protein 1 (IAP1), which also acts as a negative regulator of basal immunity. Interestingly, neither ian9 or iap1 mutant plants show any obvious developmental phenotype, suggesting that they display enhanced inducible immunity rather than constitutive immune responses. Because both IAN9 and IAP1 have orthologs in important crop species, they could be suitable targets to generate plants more resistant to diseases caused by bacterial pathogens without yield penalty.","Arabidopsis","植物の免疫応答を強力に調節するには、協調して作用する多数の正および負の調節因子が必要です。免疫関連ヌクレオチド結合（IAN）遺伝子ファミリーのメンバーは、さまざまな生物の免疫に関連していますが、植物ではこれまでそれらの機能の特性評価は行われていません。この研究では、IAN遺伝子の発現パターンを分析し、病原体感染または免疫誘発剤による治療でIAN9が抑制されることを発見しました。IAN9は、免疫の負の調節因子として遺伝的に振る舞う原形質膜局在タンパク質をコードします。CRISPR / Cas9によって生成された新しいian9変異体は、Pseudomonas syringaeに対する耐性の増加を示しますが、IAN9を過剰発現するトランスジェニック植物は感受性のわずかな増加を示します。IAN9-緑色蛍光タンパク質のinvivo免疫沈降とそれに続く質量分析により、IAN9は、これまで特徴付けられていなかったC3HC4タイプのRING-fingerドメイン含有タンパク質と結合し、IAN9関連タンパク質1（IAP1）と名付けられました。基礎免疫の調節因子。興味深いことに、ian9またはiap1変異体植物はいずれも明らかな発達表現型を示さず、構成的免疫応答ではなく、増強された誘導性免疫を示すことを示唆しています。IAN9とIAP1はどちらも重要な作物種にオルソログを持っているため、収量を犠牲にすることなく、細菌性病原体によって引き起こされる疾患に対してより耐性のある植物を生成するための適切なターゲットとなります。"]
[27,31198958,"plant","Arabidopsis thaliana","CRISPR;Cas9;","protospacer-adjacent motif","Plant & cell physiology","Developing Heritable Mutations in Arabidopsis thaliana Using a Modified CRISPR/Cas9 Toolkit Comprising PAM-Altered Cas9 Variants and gRNAs.",2019,"60(10):2255-2262","[Yamamoto A et al.]","Kumamoto University, Kumamoto, Japan.",31198958,"10.1093/pcp/pcz118 ","Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9), comprising an RNA-guided DNA endonuclease and a programmable guide RNA (gRNA), is currently recognized to be a powerful genome-editing tool and is widely used in biological science. Despite the usefulness of the system, a protospacer-adjacent motif (PAM) immediately downstream of the target sequence needs to be taken into account in the design of the gRNA, a requirement which limits the flexibility of the CRISPR-based genome-editing system. To overcome this limitation, a Cas9 isolated from Streptococcus pyogenes, namely SpCas9, engineered to develop several variants of  Cas9 nuclease, has been generated. SpCas9 recognizes the NGG sequence as the PAM, whereas its variants are capable of interacting with different PAMs. Despite the  potential advantage of the Cas9 variants, their functionalities have not previously been tested in the widely used model plant, Arabidopsis thaliana. Here, we developed a plant-specific vector series harboring SpCas9-VQR (NGAN or NGNG) or SpCas9-EQR (NGAG) and evaluated their functionalities. These modified Cas9 nucleases efficiently introduced mutations into the CLV3 and AS1 target genes using gRNAs that were compatible with atypical PAMs. Furthermore, the generated mutations were passed on to their offspring. This study illustrated the usefulness of the SpCas9 variants because the ability to generate heritable mutations will be of great benefit in molecular genetic analyses. A greater number of potential SpCas9-variant-recognition sites in these genes are predicted, compared with those of conventional SpCas9. These results demonstrated the usefulness of the SpCas9 variants for genome editing in the field of plant science research.","Arabidopsis","RNAガイドDNAエンドヌクレアーゼとプログラム可能なガイドRNA（gRNA）を含む、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9（Cas9）は、現在、強力なゲノム編集ツールとして認識されており、広く使用されています。生物科学で。システムの有用性にもかかわらず、ターゲット配列のすぐ下流にあるプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）は、CRISPRベースのゲノム編集システムの柔軟性を制限する要件であるgRNAの設計で考慮する必要があります。この制限を克服するために、Streptococcus pyogenesから分離されたCas9、すなわち、Cas9ヌクレアーゼのいくつかの変異体を開発するように設計されたSpCas9が生成されました。SpCas9はNGGシーケンスをPAMとして認識しますが、そのバリアントはさまざまなPAMと相互作用することができます。Cas9バリアントの潜在的な利点にもかかわらず、それらの機能は、広く使用されているモデルプラントであるArabidopsisthalianaではこれまでテストされていません。ここでは、SpCas9-VQR（NGANまたはNGNG）またはSpCas9-EQR（NGAG）を含む植物固有のベクターシリーズを開発し、それらの機能を評価しました。これらの変更されたCas9ヌクレアーゼは、非定型PAMと互換性のあるgRNAを使用して、CLV3およびAS1ターゲット遺伝子に効率的に変異を導入しました。さらに、生成された突然変異は彼らの子孫に受け継がれました。この研究は、遺伝性変異を生成する能力が分子遺伝学的分析において非常に有益であるため、SpCas9変異体の有用性を示しました。従来のSpCas9と比較して、これらの遺伝子の潜在的なSpCas9バリアント認識サイトの数が多く予測されます。これらの結果は、植物科学研究の分野におけるゲノム編集のためのSpCas9変異体の有用性を実証しました。"]
[28,31768121,"plant","Arabidopsis thaliana","CRISPR;Cas9;","ELF3","Plant biotechnology","Monitoring single-cell bioluminescence of Arabidopsis leaves to quantitatively evaluate the efficiency of a transiently introduced CRISPR/Cas9 system targeting  the circadian clock gene ELF3.",2019,"36(3):187-193","[Kanesaka Y et al.]","Kyoto University, Japan.",31768121,"10.5511/plantbiotechnology.19.0531a ","The rapid assessment of gene function is crucial in biological research. The CRISPR/Cas9 system is widely used as a tool for targeted gene editing in many organisms including plants. Previously, we established a transient gene expression system for investigating cellular circadian rhythms in duckweed. In this system, circadian reporters and clock gene effectors-such as overexpressors, RNA interference (RNAi), and CRISPR/Cas9-were introduced into duckweed cells using a particle bombardment method. In the present study, we applied the CRISPR/Cas9 system at a single cell level to Arabidopsis thaliana, a model organism in plant biology. To evaluate the mutation induction efficiency of the system, we monitored single-cell bioluminescence after application of the CRISPR/Cas9 system targeting the ELF3 gene, which is essential for robust circadian rhythmicity. We evaluated the mutation induction efficiency by determining the proportion of cells with impaired circadian rhythms. Three single guide RNAs (sgRNAs) were designed, and the proportion of arrhythmic cells following their use ranged from 32 to 91%. A comparison of the mutation induction efficiencies of diploid and tetraploid Arabidopsis suggested that endoreduplication had a slight effect on efficiency. Taken together, our results  demonstrate that the transiently introduced CRISPR/Cas9 system is useful for rapidly assessing the physiological function of target genes in Arabidopsis cells.","Arabidopsis","遺伝子機能の迅速な評価は、生物学的研究において非常に重要です。CRISPR / Cas9システムは、植物を含む多くの生物で標的遺伝子編集のためのツールとして広く使用されています。以前、ウキクサの細胞概日リズムを調べるための一過性遺伝子発現システムを確立しました。このシステムでは、概日レポーターと時計遺伝子エフェクター（過剰発現体、RNA干渉（RNAi）、CRISPR / Cas9など）が、粒子衝撃法を使用してウキクサ細胞に導入されました。本研究では、CRISPR / Cas9システムを単一細胞レベルで植物生物学のモデル生物であるArabidopsisthalianaに適用しました。システムの突然変異誘発効率を評価するために、我々は、強力なサーカディアンリズムに不可欠であるELF3遺伝子を標的とするCRISPR / Cas9システムの適用後の単一細胞生物発光をモニターした。サーカディアンリズムが損なわれた細胞の割合を決定することにより、突然変異誘発効率を評価した。3つのシングルガイドRNA（sgRNA）が設計され、使用後の不整脈細胞の割合は32〜91％の範囲でした。二倍体と四倍体のアラビドプシスの突然変異誘発効率の比較は、内部複製が効率にわずかな影響を及ぼしたことを示唆した。まとめると、我々の結果は、一時的に導入されたCRISPR / Cas9システムがシロイヌナズナ細胞の標的遺伝子の生理学的機能を迅速に評価するのに役立つことを示しています。"]
[29,31275047,"plant","Arabidopsis thaliana","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;"," ","Plant biotechnology","pCYOs: Binary vectors for simple visible selection of transformants using an albino-cotyledon mutant in Arabidopsis thaliana.",2019,"36(1):39-42","[Yamatani H et al.]","Hiroshima University, Higashi-Hiroshima, Japan.",31275047,"10.5511/plantbiotechnology.18.1212a ","Several selection markers for the screening of transformants have been developed; however, simple and reliable methods are generally preferred. We have developed a novel visible selection system for the identification of transformants in Arabidopsis thaliana that does not require any special reagent and/or equipment except using the albino-cotyledon mutant cyo1. In this system, the pCYO vector carrying the CYO1 genomic fragment as a selection marker is introduced into the cyo1 mutant. Transformation is performed by the Agrobacterium-mediated floral dip method and resultant T1 seeds are sown in soil. Seedlings with green cotyledons,  not albino, are expected to be 'complemented' transformants with the transgene of interest. This system provides a very simple selection method that can be performed without any special equipment, reagent, sterile conditions, or UV illumination. We have constructed three vectors, (1) pCYO1, an empty vector; (2)  pCYO2, an overexpression vector carrying CaMV35S promoter; and (3) pCYO3, a vector for genome editing, carrying the CRISPR/Cas9 cassette. Example transformation experiments using these vectors, including genome editing, are shown.","Arabidopsis","形質転換体をスクリーニングするためのいくつかの選択マーカーが開発されています。ただし、一般的には単純で信頼性の高い方法が推奨されます。アルビノコチレドン変異体cyo1を使用する以外に特別な試薬や機器を必要としない、Arabidopsisthalianaの形質転換体を同定するための新しい可視選択システムを開発しました。このシステムでは、選択マーカーとしてCYO1ゲノムフラグメントを運ぶpCYOベクターがcyo1変異体に導入されます。形質転換はアグロバクテリウムを介したフローラルディップ法によって行われ、得られたT1種子は土壌に播種されます。アルビノではなく、緑色の子葉を持つ苗木は、目的の導入遺伝子を持つ「補完された」形質転換体であると予想されます。このシステムは、特別な機器、試薬、滅菌条件、またはUV照明なしで実行できる、非常に簡単な選択方法を提供します。3つのベクトルを作成しました。（1）pCYO1、空のベクトル。（2）CaMV35Sプロモーターを運ぶ過剰発現ベクターであるpCYO2。（3）CRISPR / Cas9カセットを搭載した、ゲノム編集用のベクターであるpCYO3。ゲノム編集を含む、これらのベクターを使用した変換実験の例が示されています。"]
[30,31562216,"plant","Arabidopsis thaliana","CRISPR;"," ","Plant cell","CRISPR-TSKO: A Technique for Efficient Mutagenesis in Specific Cell Types, Tissues, or Organs in Arabidopsis.",2019,"31(12):2868-2887","[Decaestecker W  et al.]","Ghent University, Ghent, Belgium.",31562216,"10.1105/tpc.19.00454 ","Detailed functional analyses of many fundamentally important plant genes via conventional loss-of-function approaches are impeded by the severe pleiotropic phenotypes resulting from these losses. In particular, mutations in genes that are required for basic cellular functions and/or reproduction often interfere with the generation of homozygous mutant plants, precluding further functional studies. To overcome this limitation, we devised a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-based tissue-specific knockout system, CRISPR-TSKO, enabling the generation of somatic mutations in particular plant cell types, tissues, and organs. In Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), CRISPR-TSKO mutations in essential genes caused well-defined, localized phenotypes in the root cap, stomatal lineage, or entire lateral roots. The modular cloning system developed in this study allows for the efficient selection, identification, and functional analysis of mutant lines directly in the first transgenic generation. The efficacy of CRISPR-TSKO opens avenues for discovering and analyzing gene functions in the spatial and temporal contexts of  plant life while avoiding the pleiotropic effects of system-wide losses of gene function.","Arabidopsis","従来の機能喪失アプローチによる多くの根本的に重要な植物遺伝子の詳細な機能分析は、これらの喪失に起因する重度の多面性表現型によって妨げられています。特に、基本的な細胞機能および/または再生に必要な遺伝子の変異は、ホモ接合変異体植物の生成を妨げることが多く、さらなる機能研究を妨げる。この制限を克服するために、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）ベースの組織固有ノックアウトシステムであるCRISPR-TSKOを考案し、特定の植物細胞タイプ、組織、および器官で体細胞変異を生成できるようにしました。シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）では、必須遺伝子のCRISPR-TSKO変異により、根冠、気孔系統、または側根全体に明確で局所的な表現型が生じました。この研究で開発されたモジュラークローニングシステムは、最初のトランスジェニック世代で直接変異株の効率的な選択、同定、および機能分析を可能にします。CRISPR-TSKOの有効性は、遺伝子機能のシステム全体の喪失による多面的影響を回避しながら、植物の生活の空間的および時間的コンテキストで遺伝子機能を発見および分析するための道を開きます。"]
[31,30760561,"plant","Arabidopsis thaliana","CRISPR;Cas9;","SPARTAN/ weak suppressor of smt3 (Wss1); WSS1A; TYROSYL-DNA PHOSPHODIESTERASE 1","Plant cell","The Protease WSS1A, the Endonuclease MUS81, and the Phosphodiesterase TDP1 Are Involved in Independent Pathways of DNA-protein Crosslink Repair in Plants.",2019,"31(4):775-790","[Enderle J  et al.]","Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany.",30760561,"10.1105/tpc.18.00824 ","DNA-protein crosslinks (DPCs) represent a severe threat to the genome integrity;  however, the main mechanisms of DPC repair were only recently elucidated in humans and yeast. Here we define the pathways for DPC repair in plants. Using CRISPR/Cas9, we could show that only one of two homologs of the universal repair  proteases SPARTAN/ weak suppressor of smt3 (Wss1), WSS1A, is essential for DPC repair in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana). WSS1A defective lines exhibit developmental defects and are hypersensitive to camptothecin (CPT) and cis-platin. Interestingly, the CRISPR/Cas9 mutants of TYROSYL-DNA PHOSPHODIESTERASE 1 (TDP1) are insensitive to CPT, and only the wss1A tdp1 double mutant reveals a higher sensitivity than the wss1A single mutant. This indicates  that TDP1 defines a minor backup pathway in the repair of DPCs. Moreover, we found that knock out of the endonuclease METHYL METHANESULFONATE AND UV SENSITIVE PROTEIN 81 (MUS81) results in a strong sensitivity to DPC-inducing agents. The fact that wss1A mus81 and tdp1 mus81 double mutants exhibit growth defects and an increase in dead cells in root meristems after CPT treatment demonstrates that there are three independent pathways for DPC repair in Arabidopsis. These pathways are defined by their different biochemical specificities, as main actors, the DNA endonuclease MUS81 and the protease WSS1A, and the phosphodiesterase TDP1 as backup.","Arabidopsis","DNA-タンパク質架橋（DPC）は、ゲノムの完全性に対する深刻な脅威です。ただし、DPC修復の主なメカニズムは、人間と酵母で最近解明されたばかりです。ここでは、植物におけるDPC修復の経路を定義します。CRISPR / Cas9を使用して、ユニバーサル修復プロテアーゼSPARTAN / smt3の弱いサプレッサー（Wss1）の2つのホモログのうちの1つ、WSS1Aのみが、アラビドプシス（Arabidopsisthaliana）のDPC修復に不可欠であることを示すことができました。WSS1A欠陥系統は発達障害を示し、カンプトテシン（CPT）およびシスプラチンに対して過敏です。興味深いことに、TYROSYL-DNA PHOSPHODIESTERASE 1（TDP1）のCRISPR / Cas9変異体はCPTに非感受性であり、wss1Atdp1二重変異体のみがwss1A単一変異体よりも高い感度を示します。これは、TDP1がDPCの修復におけるマイナーなバックアップ経路を定義していることを示しています。さらに、エンドヌクレアーゼMETHYL METHANESULFONATE AND UV SENSITIVE PROTEIN 81（MUS81）をノックアウトすると、DPC誘導剤に対して強い感受性が生じることがわかりました。wss1Amus81とtdp1mus81の二重変異体が、CPT処理後の根メリステムの成長欠陥と死細胞の増加を示すという事実は、アラビドプシスのDPC修復には3つの独立した経路があることを示しています。これらの経路は、主要なアクターとしての異なる生化学的特異性、DNAエンドヌクレアーゼMUS81とプロテアーゼWSS1A、およびバックアップとしてのホスホジエステラーゼTDP1によって定義されます。"]
[32,31134349,"plant","Arabidopsis thaliana","CRISPR;","Protection of telomeres 1 (POT1c)","Plant cell reports","Recent emergence and extinction of the protection of telomeres 1c gene in Arabidopsis thaliana.",2019,"38(9):1081-1097","[Kobayashi CR et al.]","Texas A&M University, College Station, TX, USA.",31134349,"10.1007/s00299-019-02427-9 ","KEY MESSAGE: Duplicate POT1 genes must rapidly diverge or be inactivated. Protection of telomeres 1 (POT1) encodes a conserved telomere binding protein implicated in both chromosome end protection and telomere length maintenance. Most organisms harbor a single POT1 gene, but in the few lineages where the POT1  family has expanded, the duplicate genes have diversified. Arabidopsis thaliana bears three POT1-like loci, POT1a, POT1b and POT1c. POT1a retains the ancestral function of telomerase regulation, while POT1b is implicated in chromosome end protection. Here we examine the function and evolution of the third POT1 paralog, POT1c. POT1c is a new gene, unique to A. thaliana, and was derived from a duplication event involving the POT1a locus and a neighboring gene encoding ribosomal protein S17. The duplicate S17 locus (dS17) is highly conserved across  A. thaliana accessions, while POT1c is highly divergent, harboring multiple deletions within the gene body and two transposable elements within the promoter. The POT1c locus is transcribed at very low to non-detectable levels under standard growth conditions. In addition, no discernable molecular or developmental defects are associated with plants bearing a CRISPR mutation in the POT1c locus. However, forced expression of POT1c leads to decreased telomerase enzyme activity and shortened telomeres. Evolutionary reconstruction indicates that transposons invaded the POT1c promoter soon after the locus was formed, permanently silencing the gene. Altogether, these findings argue that POT1 dosage is critically important for viability and duplicate gene copies are retained only upon functional divergence.","Arabidopsis","重要なメッセージ：重複するPOT1遺伝子は、急速に分岐するか、不活性化される必要があります。テロメア1（POT1）の保護は、染色体末端保護とテロメア長の維持の両方に関与する保存されたテロメア結合タンパク質をコードします。ほとんどの生物は単一のPOT1遺伝子を持っていますが、POT1ファミリーが拡大したいくつかの系統では、重複する遺伝子が多様化しています。シロイヌナズナは、POT1のような3つの遺伝子座、POT1a、POT1b、POT1cを持っています。POT1aはテロメラーゼ調節の先祖の機能を保持し、POT1bは染色体末端保護に関与しています。ここでは、3番目のPOT1パラログであるPOT1cの機能と進化を調べます。POT1cは、A。thalianaに固有の新しい遺伝子であり、POT1a遺伝子座とリボソームタンパク質S17をコードする隣接遺伝子が関与する重複イベントに由来します。重複したS17遺伝子座（dS17）は、A。thalianaのアクセッション全体で高度に保存されていますが、POT1cは高度に分岐しており、遺伝子本体内に複数の欠失があり、プロモーター内に2つの転移因子があります。POT1c遺伝子座は、標準的な成長条件下で非常に低いレベルから検出不可能なレベルで転写されます。さらに、POT1c遺伝子座にCRISPR変異を持つ植物には、識別可能な分子的または発達上の欠陥はありません。ただし、POT1cの強制発現は、テロメラーゼ酵素活性の低下とテロメアの短縮につながります。進化的再構築は、遺伝子座が形成された直後にトランスポゾンがPOT1cプロモーターに侵入し、遺伝子を永久にサイレンシングしたことを示しています。まとめると、これらの調査結果は、POT1の投与量が生存率にとって非常に重要であり、重複した遺伝子コピーが機能の相違によってのみ保持されると主張しています。"]
[33,30963238,"plant","Arabidopsis thaliana","Cas9;","TPS5","Plant cell reports","The trehalose-6-phosphate synthase TPS5 negatively regulates ABA signaling in Arabidopsis thaliana.",2019,"38(8):869-882","[Tian L et al.]","Hunan Normal University, Changsha, Hunan, China.",30963238,"10.1007/s00299-019-02408-y ","KEY MESSAGE: The TPS5 negatively regulates ABA signaling by mediating ROS level and NR activity during seed germination and stomatal closure in Arabidopsis thaliana. Trehalose metabolism is important in plant growth and development and in abiotic stress response. Eleven TPS genes were identified in Arabidopsis, divided into Class I (TPS1-TPS4) and Class II (TPS5-TPS11). Although Class I has  been shown to have TPS activity, the function of most members of Class II remains enigmatic. Here, we characterized the biological function of the trehalose-6-phosphate synthase TPS5 in ABA signaling in Arabidopsis. TPS5 expression was induced by ABA and abiotic stress, and expression in epidermal and guard cells was dramatically increased after ABA treatment. Loss-of-function analysis revealed that tps5 mutants (tps5-1 and tps5-cas9) are more sensitive to  ABA during seed germination and ABA-mediated stomatal closure. Furthermore, the H2O2 level increased in the tps5-1 and tps5-cas9 mutants, which was consistent with the changes in the expression of RbohD and RbohF, key genes responsible for  H2O2 production. Further, TPS5 knockout reduced the amounts of trehalose and other soluble carbohydrates as well as nitrate reductase (NR) activity. In vitro, trehalose and other soluble carbohydrates promoted NR activity, which was blocked by the tricarboxylic acid cycle inhibitor iodoacetic acid. Thus, this study identified that TPS5 functions as a negative regulator of ABA signaling and is involved in altering the trehalose content and NR activity.","Arabidopsis","重要なメッセージ：TPS5は、Arabidopsisthalianaの種子発芽および気孔閉鎖中にROSレベルおよびNR活性を媒介することにより、ABAシグナル伝達を負に調節します。トレハロース代謝は、植物の成長と発達、および非生物的ストレス応答において重要です。11のTPS遺伝子がアラビドプシスで同定され、クラスI（TPS1-TPS4）とクラスII（TPS5-TPS11）に分けられました。クラスIにはTPSアクティビティがあることが示されていますが、クラスIIのほとんどのメンバーの機能は謎のままです。ここでは、シロイヌナズナのABAシグナル伝達におけるトレハロース-6-リン酸シンターゼTPS5の生物学的機能を特徴づけました。TPS5の発現はABAと非生物的ストレスによって誘発され、表皮細胞とガード細胞での発現はABA処理後に劇的に増加しました。機能喪失分析により、tps5変異体（tps5-1およびtps5-cas9）は、種子の発芽およびABAを介した気孔閉鎖時にABAに対してより感受性が高いことが明らかになりました。さらに、H2O2レベルはtps5-1およびtps5-cas9変異体で増加しました。これは、H2O2生成に関与する重要な遺伝子であるRbohDおよびRbohFの発現の変化と一致していました。さらに、TPS5ノックアウトは、トレハロースおよびその他の可溶性炭水化物の量、ならびに硝酸還元酵素（NR）活性を低下させました。インビトロでは、トレハロースおよび他の可溶性炭水化物がNR活性を促進し、これはトリカルボン酸回路阻害剤であるヨード酢酸によってブロックされました。したがって、この研究では、TPS5がABAシグナル伝達の負の調節因子として機能し、トレハロース含有量とNR活性の変化に関与していることが確認されました。"]
[34,30834637,"plant","Arabidopsis thaliana","CRISPR;Cas9;","plastidial phosphoglycerate kinase (pgkp1; pgkp2)","Plant journal","Pooled CRISPR/Cas9 reveals redundant roles of plastidial phosphoglycerate kinases in carbon fixation and metabolism.",2019,"98(6):1078-1089","[Li R et al.]","Fujian Agriculture and Forestry University,  Fuzhou, China.",30834637,"10.1111/tpj.14303 ","Phosphoglycerate kinase (PGK) is a highly conserved reversible enzyme that participates in both glycolysis and photosynthesis. In Arabidopsis thaliana, one  cytosolic PGK (PGKc) and two plastidial PGKs (PGKp) are known. It remains debatable whether the two PGKp isozymes are functionally redundant or specialized in plastidial carbon metabolism and fixation. Here, using a pooled clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) strategy, we found that plants with single mutations in pgkp1 or pgkp2 were not significantly affected, whereas a pgkp1pgkp2 double mutation was lethal due to retarded carbon fixation, suggesting that PGKp isozymes play redundant functional roles. Metabolomic analysis demonstrated that the sugar-deficient pgkp1pgkp2 double mutation was partially complemented by exogenous sugar, although respiration intermediates were not rescued. Chloroplast development was defective in pgkp1pgkp2, due to a deficiency in glycolysis-dependent galactoglycerolipid biosynthesis. Ectopic expression of a plastid targeting PGKc did not reverse the pgkp1pgkp2 double-mutant phenotypes. Therefore, PGKp1 and PGKp2 play redundant roles in carbon fixation and metabolism, whereas the molecular function of PGKc is more divergent. Our study demonstrated the functional conservation and divergence of glycolytic enzymes.","Arabidopsis","ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）は、解糖と光合成の両方に関与する高度に保存された可逆酵素です。Arabidopsis thalianaでは、1つのサイトゾルPGK（PGKc）と2つのプラスチドPGK（PGKp）が知られています。2つのPGKpアイソザイムが機能的に冗長であるか、色素体の炭素代謝と固定に特化しているかについては議論の余地があります。ここでは、プールされたクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9（Cas9）戦略を使用して、pgkp1またはpgkp2に単一の変異がある植物は有意な影響を受けなかったが、pgkp1pgkp2の二重変異は致命的であることがわかりました。炭素固定の遅延。PGKpアイソザイムが冗長な機能的役割を果たしていることを示唆しています。メタボロミクス分析は、呼吸中間体が救出されなかったものの、糖欠損pgkp1pgkp2二重変異が外因性糖によって部分的に補完されたことを示した。解糖依存性のガラクトグリセロ脂質生合成が不足しているため、葉緑体の発達はpgkp1pgkp2に欠陥がありました。PGKcを標的とするプラスチドの異所性発現は、pgkp1pgkp2二重変異表現型を逆転させなかった。したがって、PGKp1とPGKp2は炭素の固定と代謝において冗長な役割を果たしますが、PGKcの分子機能はより多様です。私たちの研究は、糖分解酵素の機能的保存と発散を実証しました。"]
[35,30900787,"plant","Arabidopsis thaliana","Cas9;","KU70","Plant journal","Efficient induction of heritable inversions in plant genomes using the CRISPR/Cas system.",2019,"98(4):577-589","[Schmidt C et al.]","Botanical Institute, Karlsruhe, Germany.",30900787,"10.1111/tpj.14322 ","During the evolution of plant genomes, sequence inversions occurred repeatedly making the respective regions inaccessible for meiotic recombination and thus for breeding. Therefore, it is important to develop technologies that allow the induction of inversions within chromosomes in a directed and efficient manner. Using the Cas9 nuclease from Staphylococcus aureus (SaCas9), we were able to obtain scarless heritable inversions with high efficiency in the model plant Arabidopsis thaliana. Via deep sequencing, we defined the patterns of junction formation in wild-type and in the non-homologous end-joining (NHEJ) mutant ku70-1. Surprisingly, in plants deficient of KU70, inversion induction is enhanced, indicating that KU70 is required for tethering the local broken ends together during repair. However, in contrast to wild-type, most junctions are formed by microhomology-mediated NHEJ and thus are imperfect with mainly deletions, making this approach unsuitable for practical applications. Using egg-cell-specific expression of Cas9, we were able to induce heritable inversions at different genomic loci and at intervals between 3 and 18 kb, in the percentage range, in the T1 generation. By screening individual lines, inversion frequencies of up to the 10% range were found in T2. Most of these inversions had scarless junctions and were without any sequence change within the inverted region, making the technology attractive for use in crop plants. Applying our approach, it should be possible to reverse natural inversions and induce artificial ones to break or fix linkages between traits at will.","Arabidopsis","植物ゲノムの進化の間に、配列の逆転が繰り返し起こり、減数分裂の組換え、したがって繁殖のためにそれぞれの領域にアクセスできなくなった。したがって、指示された効率的な方法で染色体内の反転の誘導を可能にする技術を開発することが重要です。Staphylococcus aureus（SaCas9）のCas9ヌクレアーゼを使用して、モデル植物Arabidopsisthalianaで傷のない遺伝性の反転を高効率で得ることができました。ディープシーケンシングを介して、野生型および非相同末端結合（NHEJ）変異体ku70-1における接合形成のパターンを定義しました。驚いたことに、KU70が不足している植物では、反転誘導が強化されており、修復中に局所的な壊れた端をつなぐためにKU70が必要であることを示しています。ただし、野生型とは対照的に、ほとんどの接合部はマイクロホモロジーを介したNHEJによって形成されるため、主に削除が不完全であるため、このアプローチは実際のアプリケーションには適していません。Cas9の卵細胞特異的発現を使用して、T1世代において、異なるゲノム遺伝子座で、パーセンテージ範囲で3〜18kbの間隔で遺伝性の反転を誘発することができました。個々のラインをスクリーニングすることにより、T2で最大10％の範囲の反転頻度が見つかりました。これらの反転のほとんどは傷のない接合部を持ち、反転領域内でシーケンスの変更がなかったため、この技術は作物植物での使用に魅力的です。私たちのアプローチを適用すると、自然の逆転を逆転させ、人工的な逆転を誘発して、形質間のつながりを自由に壊したり修正したりすることが可能であるはずです。"]
[36,30867333,"plant","Arabidopsis thaliana","CRISPR;Cas9;","MICRORNA167 (MIR167) ","Plant physiology","An Essential Role for miRNA167 in Maternal Control of Embryonic and Seed Development.",2019,"180(1):453-464","[Yao X  et al.]","Shanghai Normal University, Shanghai, China.",30867333,"10.1104/pp.19.00127 ","Maternal cells play a critical role in ensuring the normal development of embryos, endosperms, and seeds. Mutations that disrupt the maternal control of embryogenesis and seed development are difficult to identify. Here, we completely deleted four MICRORNA167 (MIR167) genes in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) using a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein9 (Cas9) genome-editing technology. We found that plants with a deletion of MIR167A phenocopied plants overexpressing miRNA167-resistant versions of Auxin Response Factor6 (ARF6) or ARF8, two miRNA167 targets. Both the mir167a mutant and the ARF overexpression lines were defective in anther dehiscence and ovule development. Serendipitously, we found that the mir167a (female symbol) x wild type (male symbol) crosses failed to produce normal embryos and endosperms, despite the findings that embryos with either mir167a(+/-) or mir167a(-/-) genotypes developed normally when mir167a(+/-) plants were self-pollinated, revealing a central role of MIR167A in  maternal control of seed development. The mir167a phenotype is 100% penetrant, providing a great genetic tool for studying the roles of miRNAs and auxin in maternal control. Moreover, we found that mir167a mutants flowered significantly  later than wild-type plants, a phenotype that was not observed in the ARF overexpression lines. We show that the reproductive defects of mir167a mutants were suppressed by a decrease of activities of ARF6, ARF8, or both. Our results clearly demonstrate that MIR167A is the predominant MIR167 member in regulating Arabidopsis reproduction and that MIR167A acts as a maternal gene that functions  largely through ARF6 and ARF8.","Arabidopsis","母体細胞は、胚、内胚葉、および種子の正常な発達を確保する上で重要な役割を果たします。母体の胚形成と種子の発達の制御を混乱させる変異を特定することは困難です。ここでは、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9（Cas9）ゲノム編集技術を使用して、シロイヌナズナ（Arabidopsisthaliana）の4つのMICRORNA167（MIR167）遺伝子を完全に削除しました。MIR167Aの欠失を持つ植物は、オーキシン応答因子6（ARF6）またはARF8のmiRNA167耐性バージョン（2つのmiRNA167ターゲット）を過剰発現する植物を表現型コピーすることがわかりました。mir167a変異体とARF過剰発現系統の両方が、葯の裂開と胚珠の発達に欠陥がありました。偶然にも、mir167a（+/-）またはmir167a（-/-）遺伝子型の胚が正常に発達したという発見にもかかわらず、mir167a（女性のシンボル）x​​野生型（男性のシンボル）の交配は正常な胚と内胚葉を生成できなかったことがわかりましたmir167a（+/-）植物が自家受粉したとき、種子の発達の母体制御におけるMIR167Aの中心的な役割が明らかになりました。mir167aの表現型は100％浸透性であり、母体の制御におけるmiRNAとオーキシンの役割を研究するための優れた遺伝的ツールを提供します。さらに、mir167a変異体は、野生型植物よりも有意に遅く開花することを発見しました。これは、ARF過剰発現系統では観察されなかった表現型です。我々は、mir167a変異体の生殖障害が、ARF6、ARF8、またはその両方の活性の低下によって抑制されたことを示しています。私たちの結果は、MIR167Aがアラビドプシスの繁殖を調節する主要なMIR167メンバーであり、MIR167Aが主にARF6とARF8を介して機能する母体遺伝子として機能することを明確に示しています。"]
[37,30723180,"plant","Arabidopsis thaliana","CRISPR;Cas9;","ABI5","Plant physiology","GOLDEN2-LIKE Transcription Factors Regulate WRKY40 Expression in Response to Abscisic Acid.",2019,"179(4):1844-1860","[Ahmad R et al.]","Northeast Normal University, Changchun, China.",30723180,"10.1104/pp.18.01466 ","Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) GARP (Golden2, ARR-B, Psr1) family transcription factors, GOLDEN2-LIKE1 and -2 (GLK1/2), function in different biological processes; however, whether and how these transcription factors modulate the response to abscisic acid (ABA) remain unknown. In this study, we used a glk1 glk2 double mutant to examine the role of GLK1/2 in the ABA response. The glk1 glk2 double mutant displayed ABA-hypersensitive phenotypes during seed germination and seedling development and an osmotic stress-resistant phenotype during seedling development. Genome-wide RNA sequencing analysis of the glk1 glk2 double mutant revealed that GLK1/2 regulate several ABA-responsive genes, including WRKY40, in the presence of ABA. Chromatin immunoprecipitation and gel retardation assays showed that GLK1/2 directly associate with the WRKY40 promoter via the recognition of a consensus sequence. Additionally, RNA sequencing analysis of the glk1 glk2 double mutant and wrky40 single mutant revealed that GLK1/2 and WRKY40 control a common set of downstream target genes in response to  ABA. Furthermore, results of a genetic interaction test showed that the glk1 glk2 wrky40 triple mutant displayed similar ABA hypersensitivity to the wrky40 single  mutant and the glk1 glk2 double mutant, while the glk1 glk2 wrky40 abi5-c (ABI5 CRISPR/Cas9 mutant) quadruple mutant displayed similar ABA hyposensitivity to the abi5-7 single mutant. Based on these results, we propose that the GLK1/2-WRKY40 transcription module plays a negative regulatory role in the ABA response.","Arabidopsis","シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）GARP（Golden2、ARR-B、Psr1）ファミリー転写因子、GOLDEN2-LIKE1および-2（GLK1 / 2）は、さまざまな生物学的プロセスで機能します。ただし、これらの転写因子がアブシジン酸（ABA）への応答を調節するかどうかとどのように調節するかは不明のままです。この研究では、glk1 glk2二重変異体を使用して、ABA応答におけるGLK1 / 2の役割を調べました。glk1 glk2二重変異体は、種子の発芽および苗の発達中にABA過敏性の表現型を示し、苗の発達中に浸透圧ストレス耐性の表現型を示した。glk1 glk2二重変異体のゲノムワイドRNAシーケンス分析により、GLK1 / 2がABAの存在下でWRKY40を含むいくつかのABA応答性遺伝子を調節することが明らかになりました。クロマチン免疫沈降およびゲル遅延アッセイは、GLK1 / 2がコンセンサス配列の認識を介してWRKY40プロモーターと直接関連することを示しました。さらに、glk1 glk2二重変異体とwrky40単一変異体のRNAシーケンス分析により、GLK1 / 2とWRKY40がABAに応答して下流の標的遺伝子の共通セットを制御することが明らかになりました。さらに、遺伝的相互作用試験の結果は、glk1 glk2wrky40トリプル変異体がwrky40シングル変異体およびglk1glk2ダブル変異体と同様のABA過敏症を示し、glk1 glk2 wrky40 abi5-c（ABI5 CRISPR / Cas9変異体）4重変異体が表示されることを示しましたabi5-7単一変異体と同様のABA過敏症。これらの結果に基づいて、GLK1 / 2-WRKY40転写モジュールがABA応答において負の調節的役割を果たしていることを提案します。"]
[38,31069543,"plant","Arabidopsis thaliana","CRISPR;","E6-like 1 (E6L1)","Plant reproduction","Identification of a role for an E6-like 1 gene in early pollen-stigma interactions in Arabidopsis thaliana.",2019,"32(3):307-322","[Doucet J et al.]","University of Toronto, Toronto, Canada.",31069543,"10.1007/s00497-019-00372-x ","KEY MESSAGE: We describe a function for a novel Arabidopsis gene, E6-like 1 (E6L1), that was identified as a highly expressed gene in the stigma and plays a  role in early post-pollination stages. In Arabidopsis, successful pollen-stigma interactions are dependent on rapid recognition of compatible pollen by the stigmatic papillae located on the surface of the pistil and the subsequent regulation of pollen hydration and germination, and followed by the growth of pollen tubes through the stigma surface. Here we have described the function of a novel gene, E6-like 1 (E6L1), that was identified through the analysis of transcriptome datasets, as one of highest expressed genes in the stigma, and furthermore, its expression was largely restricted to the stigma and trichomes. The first E6 gene was initially identified as a highly expressed gene during cotton fiber development, and related E6-like predicted proteins are found throughout the Angiosperms. To date, no orthologous genes have been assigned a biological function. Both the Arabidopsis E6L1 and cotton E6 proteins are predicted to be secreted, and this was confirmed using an E6L1:RFP fusion construct. To further investigate E6L1's function, one T-DNA and two independent  CRISPR-generated mutants were analyzed for compatible pollen-stigma interactions, and pollen hydration, pollen adhesion, and seed set were mildly impaired for the  e6l1 mutants. This work identifies E6L1 as a novel stigmatic factor that plays a  role during the early post-pollination stages in Arabidopsis.","Arabidopsis","重要なメッセージ：柱頭で高度に発現する遺伝子として同定され、受粉後の初期段階で役割を果たす新しいシロイヌナズナ遺伝子、E6様1（E6L1）の機能について説明します。アラビドプシスでは、花粉と柱頭の相互作用の成功は、ピスチルの表面にある柱頭乳頭による適合性花粉の迅速な認識と、それに続く花粉の水和と発芽の調節、および柱頭表面を通る花粉管の成長に依存しています。ここでは、トランスクリプトームデータセットの分析を通じて特定された新規遺伝子E6様1（E6L1）の機能を、柱頭で最も発現の高い遺伝子の1つとして説明しました。さらに、その発現は柱頭に大きく限定されていました。と毛状突起。最初のE6遺伝子は、綿繊維の発達中に高度に発現する遺伝子として最初に同定され、関連するE6のような予測されるタンパク質がAngiosperms全体に見られます。現在まで、オーソロガス遺伝子には生物学的機能が割り当てられていません。アラビドプシスE6L1と綿E6タンパク質の両方が分泌されると予測され、これはE6L1：RFP融合コンストラクトを使用して確認されました。E6L1の機能をさらに調査するために、1つのT-DNAと2つの独立したCRISPR生成変異体を分析して、互換性のある花粉と柱頭の相互作用を調べ、e6l1変異体では、花粉の水和、花粉の付着、種子のセットがわずかに損なわれました。この作品は、E6L1を、アラビドプシスの受精後の初期段階で役割を果たす新しい汚名因子として特定しています。"]
[39,31557222,"plant","Arabidopsis thaliana","CRISPR;Cas9;","flowering locus T; transcriptional activator VP64; H3K27 acetyltransferase p300; H3K9 methyltransferase KRYPTONITE","PloS one","CRISPR-based tools for targeted transcriptional and epigenetic regulation in plants.",2019,"14(9):e0222778","[Lee JE et al.]","Umea University, Umea, Sweden.",31557222,"10.1371/journal.pone.0222778 ","Programmable gene regulators that can modulate the activity of selected targets in trans are a useful tool for probing and manipulating gene function. CRISPR technology provides a convenient method for gene targeting that can also be adapted for multiplexing and other modifications to enable strong regulation by a range of different effectors. We generated a vector toolbox for CRISPR/dCas9-based targeted gene regulation in plants, modified with the previously described MS2 system to amplify the strength of regulation, and using  Golden Gate-based cloning to enable rapid vector assembly with a high degree of flexibility in the choice of promoters, effectors and targets. We tested the system using the floral regulator FLOWERING LOCUS T (FT) as a target and a range  of different effector domains including the transcriptional activator VP64, the H3K27 acetyltransferase p300 and the H3K9 methyltransferase KRYPTONITE. When transformed into Arabidopsis thaliana, several of the constructs caused altered flowering time phenotypes that were associated with changes in FT expression and/or epigenetic status, thus demonstrating the effectiveness of the system. The MS2-CRISPR/dCas9 system can be used to modulate transcriptional activity and epigenetic status of specific target genes in plants, and provides a versatile tool that can easily be used with different targets and types of regulation for a range of applications.","Arabidopsis","選択したターゲットの活動をトランスで変調できるプログラム可能な遺伝子レギュレーターは、遺伝子機能を調べて操作するための便利なツールです。CRISPRテクノロジーは、遺伝子ターゲティングに便利な方法を提供します。これは、さまざまなエフェクターによる強力な調節を可能にするために、多重化やその他の変更にも適用できます。植物におけるCRISPR / dCas9ベースの標的遺伝子調節用のベクターツールボックスを生成し、前述のMS2システムで修正して調節の強さを増幅し、ゴールデンゲートベースのクローニングを使用して高度な柔軟性を備えた迅速なベクターアセンブリを可能にしました。プロモーター、エフェクター、ターゲットの選択。フローラルレギュレーターFLOWERINGLOCUS T（FT）をターゲットとして使用し、転写活性化因子VP64、H3K27アセチルトランスフェラーゼp300、H3K9メチルトランスフェラーゼKRYPTONITEなどのさまざまなエフェクタードメインを使用してシステムをテストしました。シロイヌナズナに形質転換されると、いくつかの構築物は、FT発現および/または後成的状態の変化に関連する開花時期の表現型の変化を引き起こし、したがって、システムの有効性を実証しました。MS2-CRISPR / dCas9システムは、植物の特定の標的遺伝子の転写活性とエピジェネティックな状態を調節するために使用でき、さまざまな標的やさまざまな用途の調節の種類で簡単に使用できる多用途のツールを提供します。"]
[40,30582759,"plant","Arabidopsis; Nicotiana benthamiana","CRISPR;","nrg1; nrg2","New phytologist","Diverse NLR immune receptors activate defence via the RPW8-NLR NRG1.",2019,"222(2):966-980","[Castel B  et al.]","University of East Anglia, Norwich, UK.",30582759,"10.1111/nph.15659 ","Most land plant genomes carry genes that encode RPW8-NLR Resistance (R) proteins. Angiosperms carry two RPW8-NLR subclasses: ADR1 and NRG1. ADR1s act as 'helper' NLRs for multiple TIR- and CC-NLR R proteins in Arabidopsis. In angiosperm families, NRG1 co-occurs with TIR-NLR Resistance (R) genes. We tested whether NRG1 is required for signalling of multiple TIR-NLRs. Using CRISPR mutagenesis, we obtained an nrg1a-nrg1b double mutant in two Arabidopsis accessions, and an nrg1 mutant in Nicotiana benthamiana. These mutants are compromised in signalling of all TIR-NLRs tested, including WRR4A, WRR4B, RPP1, RPP2, RPP4 and the pairs RRS1/RPS4, RRS1B/RPS4B, CHS1/SOC3 and CHS3/CSA1. In Arabidopsis, NRG1 is required for the hypersensitive cell death response (HR) and full oomycete resistance, but not for salicylic acid induction or bacterial resistance. By contrast, nrg1 loss  of function does not compromise the CC-NLR R proteins RPS5 and MLA. RPM1 and RPS2 (CC-NLRs) function is slightly compromised in an nrg1 mutant. Thus, NRG1 is required for full TIR-NLR function and contributes to the signalling of some CC-NLRs. Some NRG1-dependent R proteins also signal partially via the NRG1 sister clade, ADR1. We propose that some NLRs signal via NRG1 only, some via ADR1 only and some via both or neither.","Arabidopsis; Nicotiana benthamiana","ほとんどの陸上植物ゲノムは、RPW8-NLR耐性（R）タンパク質をコードする遺伝子を持っています。Angiospermsは、ADR1とNRG1の2つのRPW8-NLRサブクラスを持っています。ADR1は、Arabidopsisの複数のTIRおよびCC-NLRRタンパク質の「ヘルパー」NLRとして機能します。血管精子ファミリーでは、NRG1はTIR-NLR耐性（R）遺伝子と共起します。複数のTIR-NLRのシグナリングにNRG1が必要かどうかをテストしました。CRISPR変異誘発を使用して、2つのシロイヌナズナ系統でnrg1a-nrg1b二重変異体を取得し、ニコチアナベンサミアナタバコでnrg1変異体を取得しました。これらの変異体は、WRR4A、WRR4B、RPP1、RPP2、RPP4、およびRRS1 / RPS4、RRS1B / RPS4B、CHS1 / SOC3、CHS3 / CSA1のペアを含む、テストされたすべてのTIR-NLRのシグナリングで危険にさらされています。アラビドプシスでは、NRG1は過敏性細胞死反応（HR）と完全な卵菌耐性に必要ですが、サリチル酸誘導や細菌耐性には必要ありません。対照的に、nrg1の機能喪失は、CC-NLRRタンパク質RPS5およびMLAを損なうことはありません。RPM1およびRPS2（CC-NLR）の機能は、nrg1変異体ではわずかに損なわれています。したがって、NRG1は完全なTIR-NLR機能に必要であり、一部のCC-NLRのシグナリングに寄与します。一部のNRG1依存性Rタンパク質は、NRG1姉妹クレードであるADR1を介して部分的にシグナルを伝達します。一部のNLRは、NRG1のみを介して、一部はADR1のみを介して、一部は両方を介して、またはどちらも経由せずに信号を送ることを提案します。"]
[41,31237422,"plant","Arabidopsis; rice","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;"," ","Current protocols in molecular biology","Targeted Transcriptional Activation in Plants Using a Potent Dead Cas9-Derived Synthetic Gene Activator.",2019,"127(1):e89","[Li Z et al.]","Sun Yat-sen University, Guangzhou, China.",31237422,"10.1002/cpmb.89 ","Genetic tools for specific perturbation of endogenous gene expression are highly  desirable for interrogation of plant gene functions and improvement of crop traits. Synthetic transcriptional activators derived from the CRISPR/Cas9 system  are emerging as powerful new tools for activating the endogenous expression of genes of interest in plants. These synthetic constructs, generated by tethering transcriptional activation domains to a nuclease-dead Cas9 (dCas9), can be directed to the promoters of endogenous target genes by single guide RNAs (sgRNAs) to activate transcription. Here, we provide a detailed protocol for targeted transcriptional activation in plants using a recently developed, highly  potent dCas9 gene activator construct referred to as dCas9-TV. This protocol covers selection of sgRNA targets, construction of sgRNA expression cassettes, and screening for an optimal sgRNA using a protoplast-based promoter-luciferase assay. Finally, the dCas9-TV gene activator coupled with the optimal sgRNA is delivered into plants via Agrobacterium-mediated transformation, thereby enabling robust upregulation of target gene expression in transgenic Arabidopsis and rice  plants. (c) 2019 by John Wiley & Sons, Inc.","Arabidopsis; rice","内因性遺伝子発現の特定の摂動のための遺伝的ツールは、植物の遺伝子機能の調査および作物の形質の改善のために非常に望ましい。CRISPR / Cas9システムに由来する合成転写活性化因子は、植物における目的の遺伝子の内因性発現を活性化するための強力な新しいツールとして浮上しています。転写活性化ドメインをヌクレアーゼ死のCas9（dCas9）につなぎとめることによって生成されたこれらの合成構築物は、転写を活性化する単一ガイドRNA（sgRNA）によって内因性標的遺伝子のプロモーターに向けることができます。ここでは、dCas9-TVと呼ばれる最近開発された非常に強力なdCas9遺伝子活性化因子コンストラクトを使用して、植物における標的転写活性化の詳細なプロトコルを提供します。このプロトコルは、sgRNAターゲットの選択、sgRNA発現カセットの構築、およびプロトプラストベースのプロモーター-ルシフェラーゼアッセイを使用した最適なsgRNAのスクリーニングをカバーしています。最後に、最適なsgRNAと結合したdCas9-TV遺伝子活性化因子は、アグロバクテリウムを介した形質転換を介して植物に送達され、それによってトランスジェニックアラビドプシスおよびイネ植物における標的遺伝子発現の強力なアップレギュレーションを可能にします。（c）2019 by John Wiley＆Sons、Inc。"]
[42,30531939,"plant","Arabidopsis; rice","Cas9;"," ","Nature plants","Genome editing in plants by engineered CRISPR-Cas9 recognizing NG PAM.",2019,"5(1):14-17","[Endo M et al.]","Institute of Agrobiological Sciences, National Agriculture and Food Research Organization, Tsukuba, Japan.",30531939,"10.1038/s41477-018-0321-8 ","Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) is widely used for genome editing and requires NGG as a protospacer adjacent motif (PAM). Here, we show that the engineered SpCas9 (SpCas9-NGv1) can efficiently mutagenize endogenous target sites with NG PAMs in the rice and Arabidopsis genomes. Furthermore, we demonstrate that the SpCas9-NGv1 nickase fused to cytidine deaminase mediates C-to-T substitutions near the 5' end of the target sequence.","Arabidopsis; rice","Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）はゲノム編集に広く使用されており、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）としてNGGが必要です。ここでは、操作されたSpCas9（SpCas9-NGv1）が、米およびアラビドプシスのゲノム内のNGPAMを使用して内因性の標的部位を効率的に変異誘発できることを示します。さらに、シチジンデアミナーゼに融合したSpCas9-NGv1ニッカーゼが、標的配列の5 '末端付近でCからTへの置換を媒介することを示します。"]
[43,30565255,"plant","Arabidopsis; rice","Cas9;","MTA; GL1-1; NAL1","New phytologist","Gene disruption through base editing-induced messenger RNA missplicing in plants.",2019,"222(2):1139-1148","[Li Z et al.]","Sun Yat-sen University, Guangzhou, China.",30565255,"10.1111/nph.15647 ","Gene knockout tools are highly desirable for basic and applied plant research. Here, we leverage the Cas9-derived cytosine base editor to introduce precise C-to-T mutations to disrupt the highly conserved intron donor site GT or acceptor site AG, thereby inducing messenger RNA (mRNA) missplicing and gene disruption. As proof of concept, we successfully obtained Arabidopsis null mutant of MTA gene in the T2 generation and rice double null mutant of GL1-1 and NAL1 genes in the T0 generation by this strategy. Elimination of the original intron donor site or  acceptor site could trigger aberrant splicing at a new specific exonic site, but  not at the closest GT or AG site, suggesting cryptic rules governing splice site  recognition. The strategy presented expands the applications of base editing technologies in plants by providing a new means for gene inactivation without generating DNA double-strand breaks, and it can potentially serve as a useful tool for studying the biology of mRNA splicing.","Arabidopsis; rice","遺伝子ノックアウトツールは、基礎および応用植物研究にとって非常に望ましいものです。ここでは、Cas9由来のシトシンベースエディターを活用して、正確なC-to-T変異を導入し、高度に保存されたイントロンドナーサイトGTまたはアクセプターサイトAGを破壊し、メッセンジャーRNA（mRNA）のミススプライシングと遺伝子破壊を引き起こします。概念実証として、この戦略により、T2世代のMTA遺伝子のシロイヌナズナヌル変異体とT0世代のGL1-1およびNAL1遺伝子のイネダブルヌル変異体の取得に成功しました。元のイントロンドナーサイトまたはアクセプターサイトを削除すると、新しい特定のエキソンサイトで異常なスプライシングがトリガーされる可能性がありますが、最も近いGTまたはAGサイトではトリガーされないため、スプライスサイトの認識を管理する不可解なルールが示唆されます。提示された戦略は、DNA二本鎖切断を生成せずに遺伝子不活性化の新しい手段を提供することにより、植物における塩基編集技術のアプリケーションを拡大し、mRNAスプライシングの生物学を研究するための有用なツールとして役立つ可能性があります。"]
[44,31620160,"plant","Arabidopsis; rice; tomato","CRISPR;Cas9;","DsRED","Frontiers in plant science","Identification of Transgene-Free CRISPR-Edited Plants of Rice, Tomato, and Arabidopsis by Monitoring DsRED Fluorescence in Dry Seeds.",2019,"10:1150","[Aliaga-Franco N et al.]","Instituto de Biologia Molecular y Celular de Plantas, Consejo Superior de Investigaciones Cientificas (CSIC)-Universidad Politecnica de Valencia, Valencia, Spain.",31620160,"10.3389/fpls.2019.01150 ","Efficient elimination of the editing machinery remains a challenge in plant biotechnology after genome editing to minimize the probability of off-target mutations, but it is also important to deliver end users with edited plants free  of foreign DNA. Using the modular cloning system Golden Braid, we have included a fluorescence-dependent transgene monitoring module to the genome-editing tool box. We have tested this approach in Solanum lycopersicum, Oryza sativa, and Arabidopsis thaliana. We demonstrate that DsRED fluorescence visualization works  efficiently in dry seeds as marker for the detection of the transgene in the three species allowing an efficient method for selecting transgene-free dry seeds. In the first generation of DsRED-free CRISPR/Cas9 null segregants, we detected gene editing of selected targets including homozygous mutants for the plant species tested. We demonstrate that this strategy allows rapid selection of transgene-free homozygous edited crop plants in a single generation after in vitro transformation.","Arabidopsis; rice; tomato","編集機構を効率的に排除することは、ゲノム編集後の植物バイオテクノロジーにおいて、オフターゲット変異の可能性を最小限に抑えるための課題ですが、外来DNAを含まない編集済み植物をエンドユーザーに提供することも重要です。モジュラークローニングシステムGoldenBraidを使用して、蛍光依存の導入遺伝子モニタリングモジュールをゲノム編集ツールボックスに含めました。このアプローチは、Solanum lycopersicum、Oryza sativa、およびArabidopsisthalianaでテストされています。DsRED蛍光可視化は、3種の導入遺伝子を検出するためのマーカーとして乾燥種子で効率的に機能し、導入遺伝子を含まない乾燥種子を選択するための効率的な方法を可能にすることを示します。DsREDフリーのCRISPR / Cas9 null分離体の第1世代では、テストした植物種のホモ接合変異体を含む、選択したターゲットの遺伝子編集を検出しました。この戦略により、invitroでの形質転換後の単一世代でトランスジーンフリーのホモ接合性編集作物植物を迅速に選択できることを示しています。"]
[45,30679374,"plant","Arabis alpina","CRISPR;Cas9;","floral integrator SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE 15 (SPL15","Science","A regulatory circuit conferring varied flowering response to cold in annual and perennial plants.",2019,"363(6425):409-412","[Hyun Y  et al.]","Max Planck Institute for Plant Breeding Research, Köln,  Germany.",30679374,"10.1126/science.aau8197 ","The reproductive strategies of plants are highly variable. Short-lived annuals flower abundantly soon after germination, whereas longer-lived perennials postpone and spatially restrict flowering. We used CRISPR/Cas9 and interspecies gene transfer to understand divergence in reproductive patterns between annual and perennial crucifers. We show that in perennial Arabis alpina, flowering in response to winter cold depends on the floral integrator SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE 15 (SPL15), whose activity is limited to older shoots and branches during cold exposure. In annuals, this regulatory system is conserved, but cold-induced flowering occurs in young shoots, without requirement for SPL15, through the photoperiodic pathway when plants return to warm. By reconstructing the annual response in perennials, we conclude that characteristic patterns of reproduction in annuals and perennials are conferred through variation in dependency on distinct flowering pathways acting in parallel.","Arabis alpina","植物の繁殖戦略は非常に多様です。短命の一年生植物は発芽後すぐに豊富に開花しますが、長命の一年生植物は開花を延期し、空間的に制限します。CRISPR / Cas9と種間遺伝子導入を使用して、年次および多年生のクルーシファー間の生殖パターンの相違を理解しました。多年生のArabisalpinaでは、冬の寒さに反応して開花するのは、花のインテグレーターであるSQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE 15（SPL15）に依存し、その活動は寒冷暴露中の古い芽や枝に限定されることを示します。一年生植物では、この規制システムは保存されていますが、植物が暖かくなると、光周性経路を介して、SPL15を必要とせずに、寒さによる開花が若い芽で発生します。ペレニアルの年次応答を再構築することにより、アニュアルとペレニアルの再現の特徴的なパターンは、並行して作用する別個の開花経路への依存性の変化を通じて与えられると結論付けます。"]
[46,31365876,"plant","barley","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","Qsd1","Cell reports","Genome-Edited Triple-Recessive Mutation Alters Seed Dormancy in Wheat.",2019,"28(5):1362-1369.e4","[Abe F et al.]","Institute of Crop Science, NARO, Tsukuba, Japan.",31365876,"10.1016/j.celrep.2019.06.090 ","Common wheat has three sets of sub-genomes, making mutations difficult to observe, especially for traits controlled by recessive genes. Here, we produced hexaploid wheat lines with loss of function of homeoalleles of Qsd1, which controls seed dormancy in barley, by Agrobacterium-mediated CRISPR/Cas9. Of the eight transformed wheat events produced, three independent events carrying multiple mutations in wheat Qsd1 homeoalleles were obtained. Notably, one line had mutations in every homeoallele. We crossed this plant with wild-type cultivar Fielder to generate a transgene-free triple-recessive mutant, as revealed by Mendelian segregation. The mutant showed a significantly longer seed dormancy period than wild-type, which may result in reduced pre-harvest sprouting of grains on spikes. PCR, southern blotting, and whole-genome shotgun sequencing revealed that this segregant lacked transgenes in its genomic sequence. This technique serves as a model for trait improvement in wheat, particularly for genetically recessive traits, based on locus information from diploid barley.","barley","一般的な小麦には3セットのサブゲノムがあり、特に劣性遺伝子によって制御される特性の場合、変異を観察するのが困難になります。ここでは、アグロバクテリウムを介したCRISPR / Cas9により、大麦の種子休眠を制御するQsd1のホメオアレルの機能を失った六倍体小麦系統を生産しました。生成された8つの変換された小麦イベントのうち、小麦Qsd1ホメオアレルに複数の変異を持つ3つの独立したイベントが得られました。特に、1つのラインはすべてのホメオアレルに突然変異がありました。メンデルの分離によって明らかにされたように、この植物を野生型の栽培品種フィールダーと交配させて、導入遺伝子を含まない三重劣性変異体を生成しました。突然変異体は、野生型よりも有意に長い種子休眠期間を示し、これにより、スパイクでの収穫前の穀物の発芽が減少する可能性があります。PCR、サザンブロッティング、および全ゲノムショットガンシーケンシングにより、この分離株はそのゲノム配列に導入遺伝子を欠いていることが明らかになりました。この手法は、二倍体大麦からの遺伝子座情報に基づいて、小麦の特性改善、特に遺伝的に劣性の特性のモデルとして機能します。"]
[47,30407538,"plant","barley","CRISPR;Cas9;","granule-bound starch synthase (Gbss1a); Protein Targeting to Starch 1 (ptst1)","Journal of experimental botany","Protein Targeting to Starch 1 is essential for starchy endosperm development in barley.",2019,"70(2):485-496","[Zhong Y et al.]","Aarhus University, Slagelse, Denmark.",30407538,"10.1093/jxb/ery398 ","Plant starch is the main energy contributor to the human diet. Its biosynthesis is catalyzed and regulated by co-ordinated actions of several enzymes. Recently,  a factor termed Protein Targeting to Starch 1 (PTST1) was identified as being required for correct granule-bound starch synthase (GBSS) localization and demonstrated to be crucial for amylose synthesis in Arabidopsis. However, the function of its homologous protein in storage tissues (e.g. endosperm) is unknown. We identified a PTST1 homolog in barley and it was found to contain a crucial coiled-coil domain and carbohydrate-binding module. We demonstrated the interaction between PTST1 and GBSS1 by fluorescence resonance energy transfer (FRET) in barley endosperm. By tagging PTST1 with the fluorophore mCherry, we observed that it is localized in the stroma of barley endosperm amyloplasts. PTST1 overexpression in endosperm increased endogenous gbss1a gene expression and amylose content. Gbss1a and ptst1 mutants were generated using clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-related protein 9 (Cas9)-based targeted mutagenesis. Homozygous gbss1a mutants showed a waxy phenotype. Grains of ptst1 mutants did not accumulate any starch. These grains dried out during the desiccation stage and were unable to germinate, suggesting that PTST1 is essential for development of starchy endosperm and viable grains.","barley","植物デンプンは、人間の食事に寄与する主なエネルギーです。その生合成は、いくつかの酵素の協調作用によって触媒され、調節されています。最近、デンプン1を標的とするタンパク質（PTST1）と呼ばれる因子が、顆粒結合デンプンシンターゼ（GBSS）の正しい局在化に必要であることが確認され、アラビドプシスでのアミロース合成に重要であることが実証されました。ただし、貯蔵組織（胚乳など）におけるその相同タンパク質の機能は不明です。オオムギでPTST1ホモログを同定したところ、重要なコイルドコイルドメインと炭水化物結合モジュールが含まれていることがわかりました。大麦内精子における蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）により、PTST1とGBSS1の間の相互作用を実証しました。PTST1にフルオロフォアmCherryをタグ付けすることにより、PTST1が大麦内胚葉アミロプラストのストロマに局在することを観察しました。胚乳におけるPTST1の過剰発現は、内因性のgbss1a遺伝子発現とアミロース含有量を増加させました。Gbss1aおよびptst1変異体は、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9（Cas9）ベースの標的変異誘発を使用して生成されました。ホモ接合性のgbss1a変異体は、ワックス状の表現型を示した。ptst1変異体の穀粒はデンプンを蓄積しませんでした。これらの粒子は乾燥段階で乾燥し、発芽することができませんでした。これは、PTST1がでんぷん質の内胚葉と生存可能な粒子の発達に不可欠であることを示唆しています。"]
[48,31357516,"plant","barley (Hordeum vulgare L.)","Cas9;","HvCKX1; HvCKX3","Cells","Knockout of the HvCKX1 or HvCKX3 Gene in Barley (Hordeum vulgare L.) by RNA-Guided Cas9 Nuclease Affects the Regulation of Cytokinin Metabolism and Root  Morphology.",2019,"8(8)","[Gasparis S et al.]","Plant Breeding and Acclimatization Institute-National Research Institute, Blonie, Poland.",31357516,"10.3390/cells8080782 ","Barley is among four of the most important cereal crops with respect to global production. Increasing barley yields to desired levels can be achieved by the genetic manipulation of cytokinin content. Cytokinins are plant hormones that regulate many developmental processes and have a strong influence on grain yield. Cytokinin homeostasis is regulated by members of several multigene families. CKX  genes encode the cytokinin oxidase/dehydrogenase enzyme, which catalyzes the irreversible degradation of cytokinin. Several recent studies have demonstrated that the RNAi-based silencing of CKX genes leads to increased grain yields in some crop species. To assess the possibility of increasing the grain yield of barley by knocking out CKX genes, we used an RNA-guided Cas9 system to generate ckx1 and ckx3 mutant lines with knockout mutations in the HvCKX1 and HvCKX3 genes, respectively. Homozygous, transgene-free mutant lines were subsequently selected and analyzed. A significant decrease in CKX enzyme activity was observed in the spikes of the ckx1 lines, while in the ckx3 lines, the activity remained at a similar level to that in the control plants. Despite these differences, no changes in grain yield were observed in either mutant line. In turn, differences  in CKX activity in the roots between the ckx1 and ckx3 mutants were reflected via root morphology. The decreased CKX activity in the ckx1 lines corresponded to greater root length, increased surface area, and greater numbers of root hairs, while the increased CKX activity in the ckx3 mutants gave the opposite results. RNA-seq analysis of the spike and root transcriptomes revealed an altered regulation of genes controlling cytokinin metabolism and signaling, as well as other genes that are important during seed development, such as those that encode nutrient transporters. The observed changes suggest that the knockout of a single CKX gene in barley may be not sufficient for disrupting cytokinin homeostasis or  increasing grain yields.","barley","大麦は、世界の生産に関して最も重要な穀物作物の4つです。大麦の収量を望ましいレベルまで増加させることは、サイトキニン含有量の遺伝子操作によって達成することができます。サイトカイニンは、多くの発達過程を調節し、穀物収量に強い影響を与える植物ホルモンです。サイトカイニンホメオスタシスは、いくつかの多遺伝子ファミリーのメンバーによって調節されています。CKX遺伝子は、サイトキニンの不可逆的分解を触媒するサイトキニンオキシダーゼ/デヒドロゲナーゼ酵素をコードします。最近のいくつかの研究では、CKX遺伝子のRNAiベースのサイレンシングが一部の作物種の穀物収量の増加につながることが示されています。CKX遺伝子をノックアウトすることによって大麦の穀物収量を増加させる可能性を評価するために、RNAガイドCas9システムを使用して、HvCKX1およびHvCKX3遺伝子にそれぞれノックアウト変異を持つckx1およびckx3変異株を生成しました。続いて、ホモ接合性のトランスジーンフリー変異株を選択して分析した。CKX酵素活性の有意な減少がckx1系統のスパイクで観察されたが、ckx3系統では、活性は対照植物と同様のレベルにとどまった。これらの違いにもかかわらず、どちらの変異株でも穀物収量の変化は観察されませんでした。次に、ckx1変異体とckx3変異体の間の根のCKX活性の違いは、根の形態を介して反映されました。ckx1系統でのCKX活性の低下は、根の長さの増加、表面積の増加、および根毛の数の増加に対応しましたが、ckx3変異体でのCKX活性の増加は、反対の結果をもたらしました。スパイクと根のトランスクリプトームのRNA-seq分析により、サイトカイニンの代謝とシグナル伝達を制御する遺伝子の調節の変化、および栄養素輸送体をコードする遺伝子など、種子の発達中に重要な他の遺伝子が明らかになりました。観察された変化は、オオムギの単一のCKX遺伝子のノックアウトは、サイトカイニンの恒常性を破壊したり、穀物の収量を増やしたりするのに十分ではない可能性があることを示唆しています。"]
[49,31645960,"plant","blueberry ","graft","FLOWERING LOCUS T (FT) ","Horticulture research","VcFT-induced mobile florigenic signals in transgenic and transgrafted blueberries.",2019,"6:105","[Song GQ et al.]","Michigan State University, East Lansing, MI USA.",31645960,"10.1038/s41438-019-0188-5 ","FLOWERING LOCUS T (FT) can promote early flowering in annual species, but such role has not been well demonstrated in woody species. We produced self and reciprocal grafts involving non-transgenic blueberry (NT) and transgenic blueberry (T) carrying a 35S-driven blueberry FT (VcFT-OX). We demonstrated that  the transgenic VcFT-OX rootstock promoted flowering of non-transgenic blueberry scions in the NT (scion):T (rootstock) grafts. We further analyzed RNA-Seq profiles and six groups of phytohormones in both NT:T and NT:NT plants. We observed content changes of several hormone metabolites, in a descending order, in the transgenic NT:T, non-transgenic NT:T, and non-transgenic NT:NT leaves. By  comparing differential expression transcripts (DETs) of these tissues in relative to their control, we found that the non-transgenic NT:T leaves had many DETs shared with the transgenic NT:T leaves, but very few with the transgenic NT:T roots. Interestingly, a number of these shared DETs belong to hormone pathway genes, concurring with the content changes of hormone metabolites in both transgenic and non-transgenic leaves of the NT:T plants. These results suggest that phytohormones induced by VcFT-OX in the transgenic leaves might serve as part of the signals that resulted in early flowering in both transgenic plants and the non-transgenic NT:T scions.","blueberry ","FLOWERING LOCUS T（FT）は、毎年恒例の種の早期開花を促進することができますが、そのような役割は木質種では十分に実証されていません。非トランスジェニックブルーベリー（NT）と35S駆動ブルーベリーFT（VcFT-OX）を運ぶトランスジェニックブルーベリー（T）を含む自己および相互移植片を作成しました。トランスジェニックVcFT-OXルートストックが、NT（scion）：T（ルートストック）グラフトで非トランスジェニックブルーベリー穂木の開花を促進することを実証しました。さらに、NT：TおよびNT：NT植物の両方でRNA-Seqプロファイルと6つのグループの植物ホルモンを分析しました。トランスジェニックNT：T、非トランスジェニックNT：T、および非トランスジェニックNT：NTの葉で、いくつかのホルモン代謝産物の含有量の変化を降順で観察しました。これらの組織の差次的発現転写物（DET）をそれらの対照と比較することにより、非トランスジェニックNT：T葉はトランスジェニックNT：T葉と共有される多くのDETを持っていたが、トランスジェニックNT：T根とはごくわずかであることがわかった。興味深いことに、これらの共有DETの多くはホルモン経路遺伝子に属しており、NT：T植物のトランスジェニック葉と非トランスジェニック葉の両方におけるホルモン代謝産物の含有量の変化と一致しています。これらの結果は、トランスジェニック葉においてVcFT-OXによって誘導される植物ホルモンが、トランスジェニック植物と非トランスジェニックNT：T穂木の両方で早期開花をもたらすシグナルの一部として役立つ可能性があることを示唆している。"]
[50,31320138,"plant","Brassica campestris","CRISPR;Cas9;","pectin methylesterase (BcPME37c)","Biochemical and biophysical research communications","BcPME37c is involved in pollen intine formation in Brassica campestris.",2019,"517(1):63-68","[Xiong X et al.]","Zhejiang University, Hangzhou, China.",31320138,"10.1016/j.bbrc.2019.07.009 ","Pollen wall development is one of the key processes of pollen development. Several pectin methylesterase (PME) genes participate in pollen germination and pollen tube growth. However, the relationship between PME genes and pollen intine formation remains unclear. In this study, we investigated the expression and subcellular localization of the PME gene BcPME37c in Brassica campestris. Furthermore, morphology and cytology methods were used to examine the phenotype of the CRISPR/Cas9 system-induced BcPME37c mutant. We found that BcPME37c is predominately expressed in mature stamen and located at the cell wall. BcPME37c mutation causes the abnormal thickening of the pollen intine of B. campestris. Our study indicated that BcPME37c is required for pollen intine formation in B. campestris.","Brassica","花粉壁の発達は、花粉発達の重要なプロセスの1つです。いくつかのペクチンメチルエステラーゼ（PME）遺伝子は、花粉の発芽と花粉管の成長に関与しています。ただし、PME遺伝子と花粉の内臓形成との関係は不明なままです。この研究では、BrassicacampestrisにおけるPME遺伝子BcPME37cの発現と細胞内局在を調査しました。さらに、形態学および細胞学の方法を使用して、CRISPR / Cas9システムによって誘導されるBcPME37c変異体の表現型を調べました。BcPME37cは主に成熟した雄しべで発現し、細胞壁に位置していることがわかりました。BcPME37c変異は、B。campestrisの花粉の内臓の異常な肥厚を引き起こします。私たちの研究は、BcPME37cがB.campestrisの花粉の内臓形成に必要であることを示しました。"]
[51,31129735,"plant","Brassica campestris","CRISPR;Cas9;","Bra003491; Bra007665; Bra014410","Molecular genetics and genomics","Efficient genome editing of Brassica campestris based on the CRISPR/Cas9 system.",2019,"294(5):1251-1261","[Xiong X et al.]","Zhejiang University, Hangzhou, China.",31129735,"10.1007/s00438-019-01564-w ","Conventional methods for gene function study in Brassica campestris have lots of  drawbacks, which greatly hinder the identification of important genes' functions  and molecular breeding. The clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is a versatile tool for genome editing that has been widely utilized in many plant species and has many advantages over conventional methods for gene function study. However, the application of CRISPR/Cas9 system in B. campestris remains unreported. The pectin-methylesterase genes Bra003491, Bra007665, and Bra014410 were selected as the targets of the CRISPR/Cas9 system. A single-targeting vector and a multitargeting vector were constructed. Different types of mutations were detected in T0 generation through Agrobacterium transformation. The mutation rate of the three designed sgRNA seeds varied from 20 to 56%. Although the majority of T0 mutants were chimeric, four homozygous mutants were identified. Transformation with the multitargeting vector generated one line with a large fragment deletion  and one line with mutations in two target genes. Mutations in Bra003491 were stable and inherited by T1 and T2 generations. Nine mutants which did not contain T-DNA insertions were also obtained. No mutations were detected in predicted potential off-target sites. Our work demonstrated that CRISPR/Cas9 system is efficient on single and multiplex genome editing without off-targeting in B. campestris and that the mutations are stable and inheritable. Our results may greatly facilitate gene functional studies and the molecular breeding of B. campestris and other plants.","Brassica","Brassica campestrisでの遺伝子機能研究の従来の方法には多くの欠点があり、重要な遺伝子の機能と分子育種の特定を大きく妨げます。クラスター化された、規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）およびCRISPR関連タンパク質9（CRISPR / Cas9）システムは、多くの植物種で広く利用されており、遺伝子機能の従来の方法に比べて多くの利点がある、ゲノム編集のための用途の広いツールです。調査。ただし、B。campestrisでのCRISPR / Cas9システムの適用は報告されていません。ペクチンメチルエステラーゼ遺伝子Bra003491、Bra007665、およびBra014410がCRISPR / Cas9システムのターゲットとして選択されました。シングルターゲティングベクターとマルチターゲティングベクターを構築した。Agrobacterium変換によるT0生成では、さまざまなタイプの変異が検出されました。設計された3つのsgRNAシードの突然変異率は20〜56％でした。T0変異体の大部分はキメラでしたが、4つのホモ接合変異体が同定されました。マルチターゲティングベクターを用いた形質転換により、2つの標的遺伝子に大きな断片の欠失を伴う1行と変異を伴う1行が生成されました。Bra003491の突然変異は安定しており、T1およびT2世代に受け継がれていました。T-DNA挿入を含まない9つの変異体も得られた。予測される潜在的なオフターゲットサイトで変異は検出されませんでした。私たちの研究は、CRISPR / Cas9システムが、B。campestrisでオフターゲティングすることなく、単一および多重のゲノム編集に効率的であり、変異が安定していて継承可能であることを示しました。私たちの結果は、遺伝子機能研究とB.campestrisおよび他の植物の分子育種を大いに促進するかもしれません。"]
[52,31284391,"plant","Brassica napus","CRISPR;Cas9;","M-locus protein kinase (BnaA3.MLPK; BnaC3.MLPK; BnaA4.MLPK; BnaC4.MLPK)","International journal of molecular sciences","Functional Analysis of M-Locus Protein Kinase Revealed a Novel Regulatory Mechanism of Self-Incompatibility in Brassica napus L.",2019,"20(13)","[Chen F et al.]","Huazhong Agricultural University, Wuhan, China.",31284391,"10.3390/ijms20133303 ","Self-incompatibility (SI) is a widespread mechanism in angiosperms that prevents  inbreeding by rejecting self-pollen. However, the regulation of the SI response in Brassica napus is not well understood. Here, we report that the M-locus protein kinase (MLPK) BnaMLPKs, the functional homolog of BrMLPKs in Brassica rapa, controls SI in B. napus. We identified four paralogue MLPK genes in B. napus, including BnaA3.MLPK, BnaC3.MLPK, BnaA4.MLPK, and BnaC4.MLPK. Two transcripts of BnaA3.MLPK, BnaA3.MLPKf1 and BnaA3.MLPKf2, were generated by alternative splicing. Tissue expression pattern analysis demonstrated that BnaA3.MLPK, especially BnaA3.MLPKf2, is highly expressed in reproductive organs,  particularly in stigmas. We subsequently created RNA-silencing lines and CRISPR/Cas9-induced quadruple mutants of BnaMLPKs in B. napus SI line S-70. Phenotypic analysis revealed that SI response is partially suppressed in RNA-silencing lines and is completely blocked in quadruple mutants. These results indicate the importance of BnaMLPKs in regulating the SI response of B. napus. We found that the expression of SI positive regulators S-locus receptor kinase (SRK) and Arm-Repeat Containing 1 (ARC1) are suppressed in bnmlpk mutant, whereas the self-compatibility (SC) element Glyoxalase I (GLO1) maintained a high expression  level. Overall, our findings reveal a new regulatory mechanism of MLPK in the SI  of B. napus.","brassica","自己不適合性（SI）は、被子植物に広く見られるメカニズムであり、自家花粉を拒絶することで近親交配を防ぎます。ただし、セイヨウアブラナのSI応答の規制はよく理解されていません。ここでは、セイヨウアブラナのBrMLPKの機能的ホモログであるM遺伝子座プロテインキナーゼ（MLPK）BnaMLPKがセイヨウアブラナのSIを制御していることを報告します。BnaA3.MLPK、BnaC3.MLPK、BnaA4.MLPK、およびBnaC4.MLPKを含む4つのパラログMLPK遺伝子をセイヨウアブラナで同定しました。BnaA3.MLPKの2つの転写産物、BnaA3.MLPKf1とBnaA3.MLPKf2は、選択的スプライシングによって生成されました。組織発現パターン分析は、BnaA3.MLPK、特にBnaA3.MLPKf2が生殖器官、特に柱頭で高度に発現していることを示しました。その後、B。napusSIラインS-70でBnaMLPKのRNAサイレンシングラインとCRISPR / Cas9誘導4重変異体を作成しました。表現型分析により、SI応答はRNAサイレンシングラインで部分的に抑制され、4重変異体では完全にブロックされることが明らかになりました。これらの結果は、セイヨウアブラナのSI応答の調節におけるBnaMLPKの重要性を示しています。自己適合性（SC）要素であるグリオキサラーゼI（GLO1）が高い発現を維持しているのに対し、SI陽性レギュレーターS-遺伝子座受容体キナーゼ（SRK）およびアームリピート含有1（ARC1）の発現はbnmlpk変異体で抑制されることがわかりました。レベル。全体として、私たちの調査結果は、B。napusのSIにおけるMLPKの新しい調節メカニズムを明らかにしています。"]
[53,31705705,"plant","Brassica napus","CRISPR;Cas9;","BnaA9.WRKY47","Plant biotechnology journal","Transcription factor BnaA9.WRKY47 contributes to the adaptation of Brassica napus to low boron stress by up-regulating the boric acid channel gene BnaA3.NIP5;1.",2019,null,"[Feng Y et al.]","Huazhong Agricultural University, Wuhan, China.",31705705,"10.1111/pbi.13288 ","Boron (B) deficiency is one of the major causes of growth inhibition and yield reduction in Brassica napus (B. napus). However, the molecular mechanisms of low  B adaptation in B. napus are largely unknown. Here, fifty-one BnaWRKY transcription factors were identified as responsive to B deficiency in B. napus,  in which BnaAn.WRKY26, BnaA9.WRKY47, BnaA1.WKRY53 and BnaCn.WRKY57 were tested in yeast one-hybrid assays and showed strong binding activity with conserved sequences containing a W box in the promoters of the B transport-related genes BnaNIP5;1s and BnaBOR1s. Green fluorescent protein fused to the target protein demonstrated the nuclear localization of BnaA9.WRKY47. CRISPR/Cas9-mediated knockout lines of BnaA9.WRKY47 in B. napus had increased sensitivity to low B and lower contents of B than wild-type plants. In contrast, overexpression of BnaA9.WRKY47 enhanced the adaptation to low B with higher B contents in tissues than in wild-type plants. Consistent with the phenotypic response and B accumulation in these transgenic lines, the transcription activity of BnaA3.NIP5;1, a B efficiency candidate gene, was decreased in the knockout lines  but was significantly increased in the overexpressing lines under low B conditions. Electrophoretic mobility shift assays, transient expression experiments in tobacco and in situ hybridizations showed that BnaA9.WRKY47 directly activated BnaA3.NIP5;1 expression through binding to the specific cis-element. Taken together, our findings support BnaWRKYs as new participants in response to low B, and BnaA9.WRKY47 contributes to the adaptation of B. napus to  B deficiency through up-regulating BnaA3.NIP5;1 expression to facilitate efficient B uptake.","brassica","Boron（B）の欠乏は、Brassica napus（B。napus）の成長阻害と収量低下の主な原因の1つです。ただし、B。napusの低B適応の分子メカニズムはほとんど知られていません。ここでは、51個のBnaWRKY転写因子が、B。napusのB欠乏に応答するものとして特定され、BnaAn.WRKY26、BnaA9.WRKY47、BnaA1.WKRY53、およびBnaCn.WRKY57が酵母ワンハイブリッドアッセイでテストされ、強い結合活性を示しました。 B輸送関連遺伝子BnaNIP5; 1sおよびBnaBOR1sのプロモーターにWボックスを含む保存された配列を持つ。標的タンパク質に融合した緑色蛍光タンパク質は、BnaA9.WRKY47の核内局在を示した。B.napusのBnaA9.WRKY47のCRISPR / Cas9を介したノックアウトラインは、野生型植物よりも低Bに対する感受性が高く、Bの含有量が低かった。対照的に、BnaA9.WRKY47の過剰発現は、野生型植物よりも組織内のB含有量が高い低Bへの適応を強化しました。これらのトランスジェニック系統における表現型応答およびB蓄積と一致して、B効率候補遺伝子であるBnaA3.NIP5; 1の転写活性は、ノックアウトラインでは減少したが、低B条件下では過剰発現系統で有意に増加した。電気泳動移動度シフトアッセイ、タバコでの一過性発現実験、およびin situハイブリダイゼーションは、BnaA9.WRKY47が特定のシスエレメントへの結合を介してBnaA3.NIP5; 1発現を直接活性化することを示しました。まとめると、私たちの調査結果は、低Bに対応する新しい参加者としてBnaWRKYをサポートし、BnaA9.WRKY47は、効率的なB取り込みを促進するために、BnaA3.NIP5; 1発現をアップレギュレートすることにより、B。napusのB欠乏への適応に貢献します。"]
[54,31548867,"plant","Brassica napus L.","CRISPR;Cas9;","lysophosphatidic acid  acyltransferase (Bnlpat2; Bnlpat5)","Biotechnology for biofuels","Effective editing for lysophosphatidic acid acyltransferase 2/5 in allotetraploid rapeseed (Brassica napus L.) using CRISPR-Cas9 system.",2019,"12:225","[Zhang K et al.]","Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, China.",31548867,"10.1186/s13068-019-1567-8 ","Background: Brassica napus is one of the most important oilseed crops, and can supply considerable amounts of edible oil as well as provide raw materials for the production of biodiesel in the biotechnology industry. Lysophosphatidic acid  acyltransferase (LPAT), a key enzyme in the Kennedy pathway, catalyses fatty acid chains into 3-phosphoglycerate and promotes further production of oil in the form of triacylglycerol. However, because B. napus is an allotetraploid with two subgenomes, the precise genes which involved in oil production remain unclear due to the intractability of efficiently knocking out all copies with high genetic redundancy. Therefore, a robust gene editing technology is necessary for gene function analysis. Results: An efficient gene editing technology was developed for the allotetraploid plant B. napus using the CRISPR-Cas9 system. Previous studies showed poor results in either on-target or off-target activity in B. napus. In the present study, four single-gRNAs and two multi-gRNAs were deliberately designed from the conserved coding regions of BnLPAT2 which has seven homologous genes, and BnLPAT5, which has four homologous genes. The mutation frequency was found to range from 17 to 68%, while no mutation was observed in the putative off-target sites. The seeds of the Bnlpat2/Bnlpat5 mutant were wizened and showed enlarged oil bodies, disrupted distribution of protein bodies and increased accumulation of starch in mature seeds. The oil content decreased, with an average decrease of 32% for Bnlpat2 lines and 29% for  Bnlpat5 lines in single-gRNA knockout lines, and a decline of 24% for Bnlpat2 mutant lines (i.e., g123) and 39% for Bnlpat2/Bnlpat5 double mutant lines (i.e.,  g134) in multi-gRNA knockout lines. Conclusions: Seven BnLPAT2 homologous genes and four BnLPAT5 homologous genes were cleaved completely using the CRISPR-Cas9 system, which indicated that it is effective for editing all homologous genes in  allotetraploid rapeseed, despite the relatively low sequence identities of both gene families. The size of the oil bodies increased significantly while the oil content decreased, confirming that BnLPAT2 and BnLPAT5 play a role in oil biosynthesis. The present study lays a foundation for further oil production improvement in oilseed crop species.","brassica","背景：Brassica napusは、最も重要な油糧種子作物の1つであり、かなりの量の食用油を供給できるだけでなく、バ​​イオテクノロジー業界でバイオディーゼルを生産するための原材料を提供することができます。ケネディ経路の重要な酵素であるリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ（LPAT）は、脂肪酸鎖を触媒して3-ホスホグリセリン酸にし、トリアシルグリセロールの形で油のさらなる生成を促進します。ただし、B。napusは2つのサブゲノムを持つ異質四倍体であるため、高い遺伝的冗長性ですべてのコピーを効率的にノックアウトすることは困難であるため、石油生産に関与する正確な遺伝子は不明なままです。したがって、遺伝子機能分析には堅牢な遺伝子編集技術が必要です。結果：CRISPR-Cas9システムを使用して、異質四倍体植物B.napus用に効率的な遺伝子編集技術が開発されました。以前の研究では、B。napusのオンターゲットまたはオフターゲットアクティビティの結果が不十分であることが示されていました。本研究では、7つの相同遺伝子を持つBnLPAT2と4つの相同遺伝子を持つBnLPAT5の保存されたコーディング領域から、4つのシングルgRNAと2つのマルチgRNAを意図的に設計しました。突然変異の頻度は17〜68％の範囲であることがわかりましたが、推定上のオフターゲット部位では突然変異は観察されませんでした。Bnlpat2 / Bnlpat5変異体の種子はワイズ化され、油体の肥大、タンパク質体の分布の乱れ、成熟種子におけるデンプンの蓄積の増加を示しました。オイル含有量は減少し、シングルgRNAノックアウトラインではBnlpat2ラインで平均32％、Bnlpat5ラインで29％減少し、Bnlpat2変異株（すなわちg123）では24％、Bnlpat2 / Bnlpat5では39％減少しました。マルチgRNAノックアウトラインの二重変異株（すなわち、g134）。結論：7つのBnLPAT2相同遺伝子と4つのBnLPAT5相同遺伝子は、CRISPR-Cas9システムを使用して完全に切断されました。これは、両方の遺伝子ファミリーの配列同一性が比較的低いにもかかわらず、異質四倍体菜種のすべての相同遺伝子の編集に有効であることを示しています。油体のサイズは大幅に増加し、油分は減少し、BnLPAT2とBnLPAT5が油の生合成に関与していることが確認されました。本研究は、油糧種子作物種におけるさらなる石油生産改善の基礎を築くものです。"]
[55,31373135,"plant","Brassica napus L.","CRISPR;Cas9;","BnaMAX1 homologs","Plant biotechnology journal","Knockout of two BnaMAX1 homologs by CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis improves plant architecture and increases yield in rapeseed (Brassica napus L.).",2019,null,"[Zheng M et al.]","Oil Crops Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences, Wuhan, China.",31373135,"10.1111/pbi.13228 ","Plant height and branch number are essential components of rapeseed plant architecture and are directly correlated with its yield. Presently, improvement of plant architecture is a major challenge in rapeseed breeding. In this study, we first verified that the two rapeseed BnaMAX1 genes had redundant functions resembling those of Arabidopsis MAX1, which regulates plant height and axillary bud outgrowth. Therefore, we designed two sgRNAs to edit these BnaMAX1 homologs using the CRISPR/Cas9 system. The T0 plants were edited very efficiently (56.30%-67.38%) at the BnaMAX1 target sites resulting in homozygous, heterozygous, bi-allelic and chimeric mutations. Transmission tests revealed that the mutations were passed on to the T1 and T2 progeny. We also obtained transgene-free lines created by the CRISPR/Cas9 editing, and no mutations were detected in potential off-target sites. Notably, simultaneous knockout of all four BnaMAX1 alleles resulted in semi-dwarf and increased branching phenotypes with more siliques, contributing to increased yield per plant relative to wild type. Therefore, these semi-dwarf and increased branching characteristics have the potential to help construct a rapeseed ideotype. Significantly, the editing resources obtained in our study provide desirable germplasm for further breeding  of high yield in rapeseed.","brassica","草丈と枝数は菜種植物の構造に不可欠な要素であり、その収量と直接相関しています。現在、菜種育種における植物構造の改善は大きな課題です。この研究では、最初に、2つの菜種BnaMAX1遺伝子が、草丈と腋芽の成長を調節するArabidopsisMAX1の機能に似た冗長な機能を持っていることを確認しました。したがって、CRISPR / Cas9システムを使用してこれらのBnaMAX1ホモログを編集するために2つのsgRNAを設計しました。T0植物は、BnaMAX1ターゲットサイトで非常に効率的に編集され（56.30％-67.38％）、ホモ接合、ヘテロ接合、バイアレリック、およびキメラの変異をもたらしました。伝達試験は、突然変異がT1とT2の子孫に受け継がれたことを明らかにしました。また、CRISPR / Cas9編集によって作成された導入遺伝子のない系統を取得しましたが、潜在的なオフターゲットサイトで変異は検出されませんでした。特に、4つすべてのBnaMAX1対立遺伝子を同時にノックアウトすると、半矮性になり、より多くのシリックを伴う分岐表現型が増加し、野生型と比較して植物あたりの収量が増加しました。したがって、これらの半矮性と増加した分岐特性は、菜種のイデオタイプを構築するのに役立つ可能性があります。重要なことに、私たちの研究で得られた編集リソースは、菜種の高収量のさらなる繁殖に望ましい生殖質を提供します。"]
[56,30980103,"plant","Brassica napus L.","CRISPR;Cas9;","indehiscent; alcatraz","TAG. Theoretical and applied genetics. Theoretische und angewandte Genetik","CRISPR/Cas9-mediated genome editing reveals differences in the contribution of INDEHISCENT homologues to pod shatter resistance in Brassica napus L.",2019,"132(7):2111-2123","[Zhai Y et al.]","Huazhong Agricultural University, Wuhan, China.",30980103,"10.1007/s00122-019-03341-0 ","The INDEHISCENT (IND) and ALCATRAZ (ALC) gene homologues have been reported to be essential for dehiscence of fruits in Brassica species. But their functions for pod shatter resistance in Brassica napus, an important oil crops, are not well understood. Here, we assessed the functions of these two genes in rapeseed using  CRISPR/Cas9 technology. The induced mutations were stably transmitted to successive generations, and a variety of homozygous mutants with loss-of-function alleles of the target genes were obtained for phenotyping. The results showed that the function of BnIND gene is essential for pod shatter and highly conserved in Brassica species, whereas the BnALC gene appears to have limited potential for rapeseed shatter resistance. The homoeologous copies of the BnIND gene have partially redundant roles in rapeseed pod shatter, with BnA03.IND exhibiting higher contributions than BnC03.IND. Analysis of data obtained from the gene expression and sequence variations of gene copies revealed that cis-regulatory divergences alter gene expression and underlie the functional differentiation of  BnIND homologues. Collectively, our results generate valuable resources for rapeseed breeding programs, and more importantly provide a strategy to improve polyploid crops.","brassica","INDEHISCENT（IND）およびALCATRAZ（ALC）遺伝子ホモログは、Brassica種の果実の裂開に不可欠であると報告されています。しかし、重要な石油作物であるBrassicanapusの鞘の粉砕抵抗に対するそれらの機能はよく理解されていません。ここでは、CRISPR / Cas9テクノロジーを使用して、菜種におけるこれら2つの遺伝子の機能を評価しました。誘発された突然変異は安定して次の世代に伝達され、標的遺伝子の機能喪失対立遺伝子を有する様々なホモ接合性突然変異体が表現型決定のために得られた。結果は、BnIND遺伝子の機能が鞘の粉砕に不可欠であり、Brassica種で高度に保存されているのに対し、BnALC遺伝子は菜種の粉砕耐性の可能性が限られていることを示しました。BnIND遺伝子の同祖コピーは、菜種のさやの粉砕において部分的に冗長な役割を果たし、BnA03.INDはBnC03.INDよりも高い寄与を示します。遺伝子発現と遺伝子コピーの配列変化から得られたデータの分析は、シス調節の相違が遺伝子発現を変化させ、BnINDホモログの機能的分化の根底にあることを明らかにした。まとめると、私たちの結果は、菜種育種プログラムのための貴重なリソースを生み出し、さらに重要なことに、倍数体作物を改善するための戦略を提供します。"]
[57,30729010,"plant","Brassica oleracea","CRISPR;Cas9;","phytoene desaturase gene (BoPDS); S-receptor kinase gene (BoSRK); male-sterility-associated gene (BoMS1)","Horticulture research","CRISPR/Cas9-mediated multiple gene editing in Brassica oleracea var. capitata using the endogenous tRNA-processing system.",2019,"6:20","[Ma C et al.]","Southwest University, Chongqing, China.",30729010,"10.1038/s41438-018-0107-1 ","Cabbage (Brassica oleracea var. capitata) is a biennial plant with strong self-incompatibility and an obligate requirement for prolonged vernalization by exposure to low temperatures to induce flowering. These characteristics significantly increase the difficulty of exploiting novel germplasm induced by physical or chemical mutagens. In this study, we report a CRISPR/Cas9 gene-editing system based on endogenous tRNA processing to induce high efficiency and inheritable mutagenesis in cabbage. Using the phytoene desaturase gene BoPDS, the S-receptor kinase gene BoSRK, and the male-sterility-associated gene BoMS1 as the target genes, multisite and multiple gene mutations were achieved using a construct with tandemly arrayed tRNA-sgRNA architecture to express multiple sgRNAs. The BoSRK3 gene mutation suppressed self-incompatibility completely, converting the self-incompatible line into a self-compatible line. In addition, the BoMS1 gene mutation produced a completely male-sterile mutant, which was highly cross compatible with its nonmutant isoline at the flowering stage as a result of a simultaneous BoSRK3 gene mutation, enabling the economic propagation  of the male-sterile line through bee-mediated cross-pollination. Interestingly, higher site mutation efficiency was detected when a guide sequence was inserted into a location in the tandemly arrayed tRNA-sgRNA architecture that was distal from the upstream Pol III promoter. In addition, mutation sites were also detected in the paralogous genes of the BoPDS and BoSRK genes that had fully consistent sequences or base mismatches but beyond the \"seed\" region in the spacer sequence compared with the target sgRNAs. Collectively, our results demonstrate that the CRISPR/Cas9 system, coupled with an endogenous tRNA-processing system, is an efficient tool to improve cabbage traits.","Brassica","キャベツ（Brassica oleraceavar。capitata）は、2年に一度の植物であり、強い自己不適合性があり、開花を誘発するために低温にさらされることによる長期のバーナリゼーションが義務付けられています。これらの特性は、物理的または化学的変異原によって誘発される新しい生殖質を利用することの難しさを大幅に増加させます。この研究では、キャベツに高効率で遺伝性の突然変異誘発を誘発する内因性tRNAプロセシングに基づくCRISPR / Cas9遺伝子編集システムを報告します。フィトエン不飽和化酵素遺伝子BoPDS、S受容体キナーゼ遺伝子BoSRK、および雄性不稔関連遺伝子BoMS1を標的遺伝子として使用し、複数のsgRNAを発現するタンデムに配列されたtRNA-sgRNAアーキテクチャを備えたコンストラクトを使用して、マルチサイトおよび複数の遺伝子変異を実現しました。 。BoSRK3遺伝子変異は、自己不適合性を完全に抑制し、自己不適合性系統を自己適合性系統に変換しました。さらに、BoMS1遺伝子変異は、完全に雄性不稔性の変異体を生成しました。これは、同時BoSRK3遺伝子変異の結果として、開花期にその非変異性イソリンと高度に交差適合性があり、蜂を介した雄性不稔性系統の経済的伝播を可能にしました。仲介された相互汚染。興味深いことに、上流のPol IIIプロモーターから遠位にあるタンデムに配列されたtRNA-sgRNAアーキテクチャーの位置にガイド配列が挿入された場合、より高い部位変異効率が検出されました。さらに、変異部位は、完全に一貫した配列または塩基のミスマッチを持っていたが、標的sgRNAと比較してスペーサー配列の「シード」領域を超えたBoPDSおよびBoSRK遺伝子のパラロガス遺伝子でも検出されました。まとめると、我々の結果は、内因性tRNAプロセッシングシステムと組み合わせたCRISPR / Cas9システムがキャベツの特性を改善するための効率的なツールであることを示しています。"]
[58,31637846,"plant","rapeseed (Brassica napus L.)","CRISPR;Cas9;","BnTT8","Plant biotechnology journal","Targeted mutagenesis of BnTT8 homologs controls yellow seed coat development for  effective oil production in Brassica napus L.",2019,null,"[Zhai Y  et al.]","Huazhong Agricultural University, Wuhan, China.",31637846,"10.1111/pbi.13281 ","Yellow seed is a desirable trait with great potential for improving seed quality  in Brassica crops. Unfortunately, no natural or induced yellow seed germplasms have been found in Brassica napus, an important oil crop, which likely reflects its genome complexity and the difficulty of the simultaneous random mutagenesis of multiple gene copies with functional redundancy. Here, we demonstrate the first application of CRISPR/Cas9 for creating yellow-seeded mutants in rapeseed.  The targeted mutations of the BnTT8 gene were stably transmitted to successive generations, and a range of homozygous mutants with loss-of-function alleles of the target genes were obtained for phenotyping. The yellow-seeded phenotype could be recovered only in targeted mutants of both BnTT8 functional copies, indicating that the redundant roles of BnA09.TT8 and BnC09.TT8b are vital for seed colour. The BnTT8 double mutants produced seeds with elevated seed oil and protein content and altered fatty acid (FA) composition without any serious defects in the yield-related traits, making it a valuable resource for rapeseed breeding programmes. Chemical staining and histological analysis showed that the targeted  mutations of BnTT8 completely blocked the proanthocyanidin (PA)-specific deposition in the seed coat. Further, transcriptomic profiling revealed that the  targeted mutations of BnTT8 resulted in the broad suppression of phenylpropanoid/flavonoid biosynthesis genes, which indicated a much more complex molecular mechanism underlying seed colour formation in rapeseed than in Arabidopsis and other Brassica species. In addition, gene expression analysis revealed the possible mechanism through which BnTT8 altered the oil content and fatty acid composition in seeds.","brassica","黄色い種子は、ブラッシカ作物の種子の品質を改善する大きな可能性を秘めた望ましい特性です。残念ながら、重要な油糧作物であるセイヨウアブラナには、天然または誘導された黄色の種子生殖質は見つかりませんでした。これは、ゲノムの複雑さと、機能的な冗長性を備えた複数の遺伝子コピーの同時ランダム突然変異誘発の難しさを反映している可能性があります。ここでは、菜種に黄色の種子の変異体を作成するためのCRISPR / Cas9の最初のアプリケーションを示します。BnTT8遺伝子の標的変異は、世代を超えて安定して伝達され、表現型解析のために、標的遺伝子の機能喪失型対立遺伝子を持つ一連のホモ接合変異体が得られました。黄色の種子の表現型は、両方のBnTT8機能コピーの標的変異体でのみ回復でき、BnA09.TT8とBnC09.TT8bの冗長な役割が種子の色に不可欠であることを示しています。BnTT8二重変異体は、種子油とタンパク質の含有量が高く、脂肪酸（FA）組成が変化した種子を生産しましたが、収量に関連する特性に重大な欠陥はなく、菜種育種プログラムの貴重なリソースとなっています。化学的染色および組織学的分析は、BnTT8の標的変異が種皮におけるプロアントシアニジン（PA）特異的沈着を完全にブロックしたことを示した。さらに、トランスクリプトームプロファイリングにより、BnTT8の標的変異がフェニルプロパノイド/フラボノイド生合成遺伝子の広範な抑制をもたらすことが明らかになりました。これは、アラビドプシスや他のブラッシカ種よりも菜種の種子の色形成の根底にあるはるかに複雑な分子メカニズムを示しています。さらに、遺伝子発現分析により、BnTT8が種子の油分と脂肪酸組成を変化させるメカニズムの可能性が明らかになりました。"]
[59,31272394,"plant","Camelina sativa","CRISPR;Cas9;","cruciferin c homologs","BMC plant biology","CRISPR/Cas9 editing of three CRUCIFERIN C homoeologues alters the seed protein profile in Camelina sativa.",2019,"19(1):292","[Lyzenga WJ et al.]","Agriculture and Agri-Food Canada, Saskatoon, SK, Canada.",31272394,"10.1186/s12870-019-1873-0 ","BACKGROUND: The oilseed Camelina sativa is grown for a range of applications, including for biofuel, biolubricants, and as a source of omega-3 fatty acids for  the aquaculture feed industry. The seed meal co-product is used as a source of protein for animal feed; however, the low value of the meal hinders profitability and more widespread application of camelina. The nutritional quality of the seed  meal is largely determined by the abundance of specific seed storage proteins and their amino acid composition. Manipulation of seed storage proteins has been shown to be an effective means for either adjustment of nutritional content of seeds or for enhancing accumulation of high-value recombinant proteins in seeds.  RESULTS: CRISPR/Cas9 gene editing technology was used to generate deletions in the first exon of the three homoeologous genes encoding the seed storage protein  CRUCIFERIN C (CsCRUC), creating an identical premature stop-codon in each and resulting in a CsCRUC knockout line. The mutant alleles were detected by applying a droplet digital PCR drop-off assay. The quantitative nature of this technique is particularly valuable when applied to polyploid species because it can accurately determine the number of mutated alleles in a gene family. Loss of CRUC protein did not alter total seed protein content; however, the abundance of other cruciferin isoforms and other seed storage proteins was altered. Consequently, seed amino acid content was significantly changed with an increase in the proportion of alanine, cysteine and proline, and decrease of isoleucine, tyrosine and valine. CsCRUC knockout seeds did not have changed total oil content, but the fatty acid profile was significantly altered with increased relative abundance of all saturated fatty acids. CONCLUSIONS: This study demonstrates the plasticity of the camelina seed proteome and establishes a CRUC-devoid line, providing a framework for modifying camelina seed protein composition. The results also illustrate a possible link between the composition of the seed proteome and fatty acid profile.","Camelina sativa","背景：油糧種子Camelina sativaは、バイオ燃料、バイオ潤滑剤、水産養殖飼料産業向けのオメガ3脂肪酸の供給源など、さまざまな用途で栽培されています。シードミールの副産物は、動物飼料のタンパク質源として使用されます。ただし、食事の価値が低いと、収益性が妨げられ、カメリナの普及が妨げられます。シードミールの栄養価は、主に特定の種子貯蔵タンパク質の量とそれらのアミノ酸組成によって決定されます。種子貯蔵タンパク質の操作は、種子の栄養含有量を調整するため、または種子中の高価値組換えタンパク質の蓄積を増強するための効果的な手段であることが示されている。結果：CRISPR / Cas9遺伝子編集技術を使用して、種子貯蔵タンパク質CRUCIFERIN C（CsCRUC）をコードする3つの同祖遺伝子の最初のエキソンに欠失を生成し、それぞれに同一の早期停止コドンを作成し、CsCRUCノックアウトラインを作成しました。変異対立遺伝子は、液滴デジタルPCRドロップオフアッセイを適用することによって検出されました。この手法の定量的性質は、遺伝子ファミリー内の変異した対立遺伝子の数を正確に決定できるため、倍数体種に適用する場合に特に価値があります。CRUCタンパク質の喪失は、総種子タンパク質含有量を変化させませんでした。ただし、他のクルシフェリンアイソフォームおよび他の種子貯蔵タンパク質の存在量が変更されました。その結果、アラニン、システイン、プロリンの比率が増加し、イソロイシン、チロシン、バリンが減少すると、種子のアミノ酸含有量が大幅に変化しました。CsCRUCノックアウトシードは総油含有量を変化させませんでしたが、すべての飽和脂肪酸の相対的な存在量が増加すると、脂肪酸プロファイルが大幅に変化しました。結論：この研究は、カメリナ種子プロテオームの可塑性を実証し、CRUC欠損ラインを確立し、カメリナ種子タンパク質組成を変更するためのフレームワークを提供します。結果はまた、種子プロテオームの組成と脂肪酸プロファイルとの間の可能な関連を示しています。"]
[60,30644027,"plant","carrot","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","DcPDS and DcMYB113-like","Molecular biotechnology","CRISPR/Cas9-Mediated Multiply Targeted Mutagenesis in Orange and Purple Carrot Plants.",2019,"61(3):191-199","[Xu ZS et al.]","Nanjing Agricultural University, Nanjing, China.",30644027,"10.1007/s12033-018-00150-6 ","The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) system has been successfully used for precise genome editing in  many plant species, including in carrot cells, very recently. However, no stable  gene-editing carrot plants were obtained with CRISPR/Cas9 system to date. In the  present study, four sgRNA expression cassettes, individually driven by four different promoters and assembled in a single CRISPR/Cas9 vector, were transformed into carrots using Agrobacterium-mediated genetic transformation. Four sites of DcPDS and DcMYB113-like genes were chosen as targets. Knockout of DcPDS in orange carrot 'Kurodagosun' resulted in the generation of albino carrot  plantlets, with about 35.3% editing efficiency. DcMYB113-like was also successfully edited in purple carrot 'Deep purple', resulting in purple depigmented carrot plants, with about 36.4% rate of mutation. Sequencing analyses showed that insertion, deletion, and substitution occurred in the target sites, generating heterozygous, biallelic, and chimeric mutations. The highest efficiency of mutagenesis was observed in the sites targeted by AtU6-29-driven sgRNAs in both DcPDS- and DcMYB113-like-knockout T0 plants, which always induced  double-strand breaks in the target sites. Our results proved that CRISPR/Cas9 system could be for generating stable gene-editing carrot plants.","carrot","クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）関連タンパク質9（Cas9）システムは、ごく最近、ニンジン細胞を含む多くの植物種で正確なゲノム編集に使用されています。しかし、これまでCRISPR / Cas9システムでは安定した遺伝子編集ニンジン植物は得られませんでした。本研究では、4つの異なるプロモーターによって個別に駆動され、単一のCRISPR / Cas9ベクターに組み立てられた4つのsgRNA発現カセットが、アグロバクテリウムを介した遺伝子形質転換を使用してニンジンに形質転換されました。DcPDSおよびDcMYB113様遺伝子の4つの部位が標的として選択されました。オレンジニンジン「クロダゴスン」でDcPDSをノックアウトすると、編集効率が約35.3％のアルビノニンジン苗木が生成されました。DcMYB113-likeは、紫色のニンジン「ディープパープル」でも正常に編集され、約36.4％の変異率で紫色の脱色したニンジン植物になりました。シーケンス分析では、挿入、削除、および置換がターゲットサイトで発生し、ヘテロ接合、2対立遺伝子、およびキメラの変異が生成されることが示されました。突然変異誘発の最高の効率は、DcPDSおよびDcMYB113のようなノックアウトT0植物の両方でAtU6-29駆動のsgRNAが標的とする部位で観察され、標的部位で常に二本鎖切断を誘発しました。私たちの結果は、CRISPR / Cas9システムが安定した遺伝子編集ニンジン植物を生成するためのものである可能性があることを証明しました。"]
[61,31213511,"plant","carrot","CRISPR;Cas9;","DcMYB7","Plant physiology","Changing Carrot Color: Insertions in DcMYB7 Alter the Regulation of Anthocyanin Biosynthesis and Modification.",2019,"181(1):195-207","[Xu ZS  et al.]","Nanjing Agricultural University, Nanjing, China.",31213511,"10.1104/pp.19.00523 ","The original domesticated carrots (Daucus carota) are thought to have been purple, accumulating large quantities of anthocyanins in their roots. A quantitative trait locus associated with anthocyanin pigmentation in purple carrot roots has been identified on chromosome 3 and includes two candidate genes, DcMYB6 and DcMYB7 Here, we characterized the functions of DcMYB6 and DcMYB7 in carrots. Overexpression of DcMYB7, but not DcMYB6, in the orange carrot 'Kurodagosun' led to anthocyanin accumulation in roots. Knockout of DcMYB7 in the solid purple (purple periderm, phloem, and xylem) carrot 'Deep Purple' using the  clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 system resulted in carrots with yellow roots. DcMYB7 could activate the expression of its DcbHLH3 partner, a homolog of  the anthocyanin-related apple (Malus x domestica) bHLH3, and structural genes in  the anthocyanin biosynthetic pathway. We determined that the promoter sequence of DcMYB7 in nonpurple carrots was interrupted either by DcMYB8, a nonfunctional tandem duplication of DcMYB7, or by two transposons, leading to the transcriptional inactivation of DcMYB7 in nonpurple carrot roots. As a result, nonpurple carrots fail to accumulate anthocyanins in their roots. Our study supports the hypothesis that another genetic factor suppresses DcMYB7 expression  in the phloem and xylem of purple peridermal carrot root tissues. DcMYB7 also regulated the glycosylation and acylation of anthocyanins by directly activating  DcUCGXT1 and DcSAT1 We reveal the genetic factors conditioning anthocyanin pigmentation in purple versus nonpurple carrot roots. Our results also provide insights into the mechanisms underlying anthocyanin glycosylation and acylation.","carrot","元の飼いならされたニンジン（Daucus carota）は紫色で、根に大量のアントシアニンを蓄積していたと考えられています。紫色のニンジンの根のアントシアニン色素沈着に関連する定量的形質遺伝子座が染色体3で同定され、2つの候補遺伝子、DcMYB6とDcMYB7が含まれています。ここでは、ニンジンのDcMYB6とDcMYB7の機能を特徴づけました。オレンジ色のニンジン「クロダゴスン」でのDcMYB6ではなくDcMYB7の過剰発現は、根にアントシアニンを蓄積させました。クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9システムを使用した無地の紫色（紫色の周皮、師部、および木部）ニンジン「ディープパープル」でのDcMYB7のノックアウトは、黄色の根を持つニンジンをもたらしました。DcMYB7は、そのDcbHLH3パートナー、アントシアニン関連リンゴ（Malus xdomestica）bHLH3のホモログ、およびアントシアニン生合成経路の構造遺伝子の発現を活性化する可能性があります。非紫色ニンジンのDcMYB7のプロモーター配列は、DcMYB7の非機能的タンデム重複であるDcMYB8によって、または2つのトランスポゾンによって中断され、非紫色ニンジンの根におけるDcMYB7の転写不活性化につながると判断しました。その結果、非紫色のニンジンは根にアントシアニンを蓄積することができません。私たちの研究は、別の遺伝的要因が紫色の周皮ニンジン根組織の師部と木部におけるDcMYB7の発現を抑制するという仮説を支持しています。DcMYB7は、DcUCGXT1とDcSAT1を直接活性化することにより、アントシアニンのグリコシル化とアシル化も制御しました。紫色と非紫色のニンジンの根のアントシアニン色素沈着を調整する遺伝的要因を明らかにします。私たちの結果はまた、アントシアニンのグリコシル化とアシル化の根底にあるメカニズムへの洞察を提供します。"]
[62,30019807,"plant","cassava","CRISPR;Cas9;","cap-binding protein-1 (ncbp-1; ncbp-2)","Plant biotechnology journal","Simultaneous CRISPR/Cas9-mediated editing of cassava eIF4E isoforms nCBP-1 and nCBP-2 reduces cassava brown streak disease symptom severity and incidence.",2019,"17(2):421-434","[Gomez MA et al.]","University of California, Berkeley, CA, USA.",30019807,"10.1111/pbi.12987 ","Cassava brown streak disease (CBSD) is a major constraint on cassava yields in East and Central Africa and threatens production in West Africa. CBSD is caused by two species of positive-sense RNA viruses belonging to the family Potyviridae, genus Ipomovirus: Cassava brown streak virus (CBSV) and Ugandan cassava brown streak virus (UCBSV). Diseases caused by the family Potyviridae require the interaction of viral genome-linked protein (VPg) and host eukaryotic translation  initiation factor 4E (eIF4E) isoforms. Cassava encodes five eIF4E proteins: eIF4E, eIF(iso)4E-1, eIF(iso)4E-2, novel cap-binding protein-1 (nCBP-1), and nCBP-2. Protein-protein interaction experiments consistently found that VPg proteins associate with cassava nCBPs. CRISPR/Cas9-mediated genome editing was employed to generate ncbp-1, ncbp-2, and ncbp-1/ncbp-2 mutants in cassava cultivar 60444. Challenge with CBSV showed that ncbp-1/ncbp-2 mutants displayed delayed and attenuated CBSD aerial symptoms, as well as reduced severity and incidence of storage root necrosis. Suppressed disease symptoms were correlated with reduced virus titre in storage roots relative to wild-type controls. Our results demonstrate the ability to modify multiple genes simultaneously in cassava to achieve tolerance to CBSD. Future studies will investigate the contribution of remaining eIF4E isoforms on CBSD and translate this knowledge into an optimized strategy for protecting cassava from disease.","cassava","カサバブラウンストリーク病（CBSD）は、東アフリカと中央アフリカのカサバ収量に対する主要な制約であり、西アフリカでの生産を脅かしています。CBSDは、ポティウイルス科に属する2種のプラス鎖RNAウイルス、イポモウイルス属によって引き起こされます。カサバブラウンストリークウイルス（CBSV）とウガンダンカサバブラウンストリークウイルス（UCBSV）です。Potyviridae科によって引き起こされる疾患は、ウイルスゲノム結合タンパク質（VPg）と宿主真核生物翻訳開始因子4E（eIF4E）アイソフォームの相互作用を必要とします。Cassavaは、eIF4E、eIF（iso）4E-1、eIF（iso）4E-2、新規キャップ結合タンパク質-1（nCBP-1）、およびnCBP-2の5つのeIF4Eタンパク質をエンコードします。タンパク質間相互作用実験は、VPgタンパク質がキャッサバnCBPと関連していることを一貫して発見しました。CRISPR / Cas9を介したゲノム編集を使用して、cassava品種60444でncbp-1、ncbp-2、およびncbp-1 / ncbp-2変異体を生成しました。CBSVでのチャレンジにより、ncbp-1 / ncbp-2変異体は遅延および減衰を示しました。 CBSDの空中症状、およびストレージルート壊死の重症度と発生率の低下。抑制された病気の症状は、野生型の対照と比較して、貯蔵根におけるウイルス力価の低下と相関していた。私たちの結果は、CBSDへの耐性を達成するためにcassavaで同時に複数の遺伝子を変更する能力を示しています。将来の研究では、CBSD上の残りのeIF4Eアイソフォームの寄与を調査し、この知識を、カッサバを病気から保護するための最適化された戦略に変換します。"]
[63,31263474,"plant","Catharanthus roseus","Agroinfiltration;","introns; luciferase and GUS genes","Frontiers in plant science","EASI Transformation: An Efficient Transient Expression Method for Analyzing Gene  Function in Catharanthus roseus Seedlings.",2019,"10:755","[Mortensen S et al.]","Northeastern University, Boston, MA, USA.",31263474,"10.3389/fpls.2019.00755 ","The Catharanthus roseus plant is the exclusive source of the valuable anticancer  terpenoid indole alkaloids, vinblastine (VB) and vincristine (VC). The recent availability of transcriptome and genome resources for C. roseus necessitates a fast and reliable method for studying gene function. In this study, we developed  an Agrobacterium-mediated transient expression method to enable the functional study of genes rapidly in planta, conserving the compartmentalization observed in the VB and VC pathway. We focused on (1) improving the transformation method (syringe versus vacuum agroinfiltration) and cultivation conditions (seedling age, Agrobacterium density, and time point of maximum transgene expression), (2)  improving transformation efficiency through the constitutive expression of the virulence genes and suppressing RNA silencing mechanisms, and (3) improving the vector design by incorporating introns, quantitative and qualitative reporter genes (luciferase and GUS genes), and accounting for transformation heterogeneity across the tissue using an internal control. Of all the parameters tested, vacuum infiltration of young seedlings (10-day-old, harvested 3 days post-infection) resulted in the strongest increase in transgene expression, at 18 - 57 fold higher than either vacuum or syringe infiltration of other seedling ages. Endowing the A. tumefaciens strain with the mutated VirGN54D or silencing suppressors within the same plasmid as the reporter gene further increased expression by 2 - 10 fold. For accurate measurement of promoter transactivation or activity, we included an internal control to normalize the differences in plant mass and transformation efficiency. Including the normalization gene (Renilla luciferase) on the same plasmid as the reporter gene (firefly luciferase) consistently yielded a high signal and a high correlation between RLUC and FLUC. As proof of principle, we applied this approach to investigate the regulation of the CroSTR1 promoter with the well-known activator ORCA3 and repressor ZCT1. Our method demonstrated the quantitative assessment of both the activation and repression of promoter activity in C. roseus. Our efficient Agrobacterium-mediated seedling infiltration (EASI) protocol allows highly efficient, reproducible, and homogenous transformation of C. roseus cotyledons and provides a timely tool for the community to rapidly assess the function of genes in planta, particularly for investigating how transcription factors regulate terpenoid indole alkaloid biosynthesis.","Catharanthus roseus","Catharanthus roseus植物は、貴重な抗癌性テルペノイドインドールアルカロイドであるビンブラスチン（VB）およびビンクリスチン（VC）の独占的な供給源です。C. roseusのトランスクリプトームとゲノムリソースの最近の利用可能性は、遺伝子機能を研究するための高速で信頼できる方法を必要とします。この研究では、アグロバクテリウムを介した一過性発現法を開発し、プランタ内の遺伝子の機能研究を迅速に可能にし、VBおよびVC経路で観察される区画化を保存しました。（1）形質転換法（シリンジ対真空アグロインフィルトレーション）と培養条件（苗齢、アグロバクテリウム密度、最大導入遺伝子発現の時点）の改善、（2）毒性遺伝子の構成的発現による形質転換効率の改善、およびRNAサイレンシングメカニズムを抑制し、（3）イントロン、定量的および定性的レポーター遺伝子（ルシフェラーゼおよびGUS遺伝子）を組み込み、内部コントロールを使用して組織全体の変換の不均一性を説明することにより、ベクターデザインを改善します。テストしたすべてのパラメーターの中で、若い実生（10日齢、感染後3日で収穫）の真空浸透は、導入遺伝子発現の最も強い増加をもたらし、他の実生年齢の真空または注射器浸透よりも18〜57倍高かった。 。A. tumefaciens株に変異VirGN54Dを与えるか、レポーター遺伝子と同じプラスミド内のサプレッサーをサイレンシングすると、発現がさらに2〜10倍増加しました。プロモーターのトランス活性化または活性を正確に測定するために、植物の質量と形質転換効率の違いを正規化するための内部コントロールを含めました。レポーター遺伝子（ホタルルシフェラーゼ）と同じプラスミドに正規化遺伝子（レニラルシフェラーゼ）を含めると、一貫して高いシグナルとRLUCとFLUCの間に高い相関関係が得られました。原理の証明として、このアプローチを適用して、よく知られているアクチベーターORCA3とリプレッサーZCT1によるCroSTR1プロモーターの制御を調査しました。私たちの方法は、C。roseusにおけるプロモーター活性の活性化と抑制の両方の定量的評価を実証しました。私たちの効率的なアグロバクテリウム媒介苗浸透（EASI）プロトコルは、C。roseus子葉の非常に効率的で再現性のある均質な形質転換を可能にし、特に転写因子がどのように調節するかを調査するために、コミュニティが植物の遺伝子の機能を迅速に評価するためのタイムリーなツールを提供しますテルペノイドインドールアルカロイド生合成。"]
[64,30845784,"plant","chicory (Cichorium intybus L.)","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","chicory phytoene desaturase gene (CiPDS)","International journal of molecular sciences","Efficient Genome Editing Using CRISPR/Cas9 Technology in Chicory.",2019,"20(5)","[Bernard G et al.]","Universite de Lille, INRA, ISA, Univ. Artois, Univ. Littoral Cote d'Opale, Villeneuve d'Ascq, France.",30845784,"10.3390/ijms20051155 ","CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated with protein CAS9) is a genome-editing tool that has been extensively  used in the last five years because of its novelty, affordability, and feasibility. This technology has been developed in many plant species for gene function analysis and crop improvement but has never been used in chicory (Cichorium intybus L.). In this study, we successfully applied CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis to chicory using Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation and protoplast transfection methods. A U6 promoter (CiU6-1p) among eight predicted U6 promoters in chicory was selected to  drive sgRNA expression. A binary vector designed to induce targeted mutations in  the fifth exon of the chicory phytoene desaturase gene (CiPDS) was then constructed and used to transform chicory. The mutation frequency was 4.5% with the protoplast transient expression system and 31.25% with A. rhizogenes-mediated stable transformation. Biallelic mutations were detected in all the mutant plants. The use of A. rhizogenes-mediated transformation seems preferable as the  regeneration of plants is faster and the mutation frequency was shown to be higher. With both transformation methods, foreign DNA was integrated in the plant genome. Hence, selection of vector (transgene)-free segregants is required. Our results showed that genome editing with CRISPR/Cas9 system can be efficiently used with chicory, which should facilitate and accelerate genetic improvement and functional biology.","chicory","CRISPR / Cas9（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート/タンパク質CAS9に関連するCRISPR）は、その新規性、手頃な価格、および実現可能性のために、過去5年間に広く使用されてきたゲノム編集ツールです。この技術は、遺伝子機能分析と作物改良のために多くの植物種で開発されましたが、チコリ（Cichorium intybus L.）では使用されていません。この研究では、Agrobacterium rhizogenesを介した形質転換とプロトプラストトランスフェクション法を使用して、CRISPR / Cas9を介した標的突然変異誘発をチコリに適用することに成功しました。チコリで予測される8つのU6プロモーターの中からU6プロモーター（CiU6-1p）を選択して、sgRNAの発現を促進しました。次に、チコリフィトエンデサチュラーゼ遺伝子（CiPDS）の5番目のエキソンに標的変異を誘発するように設計されたバイナリベクターを構築し、チコリを形質転換するために使用しました。突然変異頻度は、プロトプラスト一過性発現システムで4.5％、A。リゾゲネスを介した安定した形質転換で31.25％でした。バイアレリック突然変異は、すべての突然変異植物で検出された。植物の再生がより速く、突然変異の頻度がより高いことが示されたので、A。rhizogenesを介した形質転換の使用が好ましいように思われる。両方の形質転換法で、外来DNAが植物ゲノムに組み込まれました。したがって、ベクター（導入遺伝子）を含まない分離体の選択が必要です。私たちの結果は、CRISPR / Cas9システムを使用したゲノム編集がチコリで効率的に使用できることを示しました。これにより、遺伝的改善と機能生物学が促進および加速されます。"]
[65,31417731,"plant","chinese kale","CRISPR;Cas9;","phytoene desaturase (BaPDS1; BaPDS2)","Royal Society open science","Functional differences of BaPDS1 and BaPDS2 genes in Chinese kale.",2019,"6(7):190260","[Sun B  et al.]","Sichuan Agricultural University, Chengdu, China.",31417731,"10.1098/rsos.190260 ","This study presents a systematic analysis of the functional differences between two genes that encode phytoene desaturase (PDS) in Chinese kale. The promoter sequences of both BaPDS1 and BaPDS2 were amplified and cloned, and their lengths  were 2005 bp and 2000 bp, respectively. The mining of cis-acting elements in the  promoters showed that the two BaPDS genes are mainly associated with light and phytohormone responsiveness. Light quality, light intensity and plant hormone treatments were conducted in seedlings of Chinese kale, and the results indicated that the response of the two genes to different factors differed. Among them, BaPDSs collectively respond to the treatment with salicylic acid and abscisic acid. With regard to response differences, BaPDS1 is sensitive to red and blue light, blue light, and strong light, while BaPDS2 responds to blue light, weak light, darkness, gibberellin and methyl jasmonate. In addition, both BaPDS1 and BaPDS2 are likely targeted to the chloroplast. Furthermore, single and double mutants of BaPDSs were generated via CRISPR/Cas9 technology. Phenotypic analysis  showed that the double mutant with edited PDS1 and PDS2 was a pure albino, while  the single mutants with edited PDS1 or PDS2 were partly whitened. In summary, BaPDS1 and BaPDS2 genes played different and indispensable roles in Chinese kale, and their functions were partially complementary.","chinese kale","この研究は、中国のケールのフィトエンデサチュラーゼ（PDS）をコードする2つの遺伝子間の機能の違いの体系的な分析を提示します。BaPDS1とBaPDS2の両方のプロモーター配列が増幅およびクローン化され、それらの長さはそれぞれ2005bpと2000bpでした。プロモーターのシス作用エレメントのマイニングは、2つのBaPDS遺伝子が主に光と植物ホルモンの応答性に関連していることを示しました。中国のケールの苗木で光の質、光の強さ、植物ホルモンの処理を行った結果、2つの遺伝子の異なる要因に対する反応が異なることが示されました。その中で、BaPDSはサリチル酸とアブシジン酸による治療に集合的に反応します。応答の違いに関しては、BaPDS1は赤と青の光、青の光、強い光に敏感ですが、BaPDS2は青の光、弱い光、暗闇、ジベレリン、ジャスモン酸メチルに反応します。さらに、BaPDS1とBaPDS2の両方が葉緑体を標的にしている可能性があります。さらに、BaPDSの単一および二重変異体はCRISPR / Cas9テクノロジーを介して生成されました。表現型分析では、PDS1とPDS2が編集された二重変異体は純粋なアルビノであり、PDS1またはPDS2が編集された単一変異体は部分的に白色化されていることが示されました。要約すると、BaPDS1とBaPDS2の遺伝子は、中国のケールで異なった不可欠な役割を果たし、それらの機能は部分的に補完的でした。"]
[66,31883409,"plant","cotton","CRISPR;","CGP1","Plant biotechnology journal","The gland localized CGP1 controls gland pigmentation and gossypol accumulation in cotton.",2019,null,"[Gao W  et al.]","Henan University, Kaifeng, China.",31883409,"10.1111/pbi.13323 ","Pigment glands, also known as black glands or gossypol glands, are specific for Gossypium spp. These glands strictly confine large amounts of secondary metabolites to the lysigenous cavity, leading to the glands' intense colour and providing defence against pests and pathogens. This study performed a comparative transcriptome analysis of glanded versus glandless cotton cultivars. Twenty-two transcription factors showed expression patterns associated with pigment glands and were characterized. Phenotypic screening of the genes, via virus-induced gene silencing, showed an apparent disappearance of pigmented glands after the silencing of a pair of homologous MYB-encoding genes in the A and D genomes (designated as CGP1). Further study showed that CGP1a encodes an active transcription factor, which is specifically expressed in the gland structure, while CGP1d encodes a non-functional protein due to a fragment deletion, which causes premature termination. RNAi-mediated silencing and CRISPR knockout of CGP1 in glanded cotton cultivars generated a glandless-like phenotype, similar to the  dominant glandless mutant Gl2 (e) . Microscopic analysis showed that CGP1 knockout did not affect gland structure or density, but affected gland pigmentation. The levels of gossypol and related terpenoids were significantly decreased in cgp1 mutants, and a number of gossypol biosynthetic genes were strongly down-regulated. CGP1 is located in the nucleus where it interacts with GoPGF, a critical transcription factor for gland development and gossypol synthesis. Our data suggest that CGP1 and GoPGF form heterodimers to control the  synthesis of gossypol and other secondary metabolites in cotton.","cotton","黒腺またはゴシポール腺としても知られる色素腺は、ゴシピウム属に特異的です。これらの腺は、大量の二次代謝産物を溶解性の空洞に厳密に閉じ込め、腺の濃い色をもたらし、害虫や病原体に対する防御を提供します。この研究では、グランド付きとグランドレスのワタ栽培品種のトランスクリプトーム比較分析を行いました。22の転写因子が色素腺に関連する発現パターンを示し、特徴づけられました。ウイルス誘発性遺伝子サイレンシングを介した遺伝子の表現型スクリーニングは、AおよびDゲノム（CGP1として指定）の相同MYBをコードする遺伝子のペアのサイレンシング後に色素性腺の明らかな消失を示した。さらなる研究により、CGP1aは腺構造で特異的に発現する活性転写因子をコードし、CGP1dはフラグメントの欠失により機能しないタンパク質をコードし、早期終了を引き起こすことが示されました。腺綿栽培品種におけるCGP1のRNAi媒介サイレンシングおよびCRISPRノックアウトは、優勢な腺のない変異体Gl2（e）と同様に、腺のないような表現型を生成しました。顕微鏡分析は、CGP1ノックアウトが腺の構造や密度に影響を与えなかったが、腺の色素沈着に影響を与えたことを示した。ゴシポールおよび関連するテルペノイドのレベルは、cgp1変異体で有意に減少し、多くのゴシポール生合成遺伝子が強くダウンレギュレートされました。CGP1は核内にあり、腺の発達とゴシポール合成に重要な転写因子であるGoPGFと相互作用します。私たちのデータは、CGP1とGoPGFがヘテロダイマーを形成して、綿のゴシポールと他の二次代謝産物の合成を制御することを示唆しています。"]
[67,30291759,"plant","cotton","CRISPR;Cas9;"," ","Plant biotechnology journal","Whole genome sequencing reveals rare off-target mutations and considerable inherent genetic or/and somaclonal variations in CRISPR/Cas9-edited cotton plants.",2019,"17(5):858-868","[Li J  et al.]","Huazhong Agricultural University, Wuhan, Hubei, China.",30291759,"10.1111/pbi.13020 ","The CRISPR/Cas9 system has been extensively applied for crop improvement. However, our understanding of Cas9 specificity is very limited in Cas9-edited plants. To identify on- and off-target mutation in an edited crop, we described whole genome sequencing (WGS) of 14 Cas9-edited cotton plants targeted to three genes, and three negative (Ne) control and three wild-type (WT) plants. In total, 4188-6404 unique single-nucleotide polymorphisms (SNPs) and 312-745 insertions/deletions (indels) were detected in 14 Cas9-edited plants compared to  WT, negative and cotton reference genome sequences. Since the majority of these variations lack a protospacer-adjacent motif (PAM), we demonstrated that the most variations following Cas9-edited are due either to somaclonal variation or/and pre-existing/inherent variation from maternal plants, but not off-target effects. Of a total of 4413 potential off-target sites (allowing </=5 mismatches within the 20-bp sgRNA and 3-bp PAM sequences), the WGS data revealed that only four are bona fide off-target indel mutations, validated by Sanger sequencing. Moreover, inherent genetic variation of WT can generate novel off-target sites and destroy  PAMs, which suggested great care should be taken to design sgRNA for the minimizing of off-target effect. These findings suggested that CRISPR/Cas9 system is highly specific for cotton plants.","cotton","CRISPR / Cas9システムは、作物の改良に広く適用されています。ただし、Cas9の特異性についての私たちの理解は、Cas9で編集された植物では非常に限られています。編集された作物のオンターゲットとオフターゲットの突然変異を特定するために、3つの遺伝子をターゲットにした14のCas9編集ワタ植物と3つのネガティブ（Ne）コントロールと3つの野生型（WT）植物の全ゲノムシーケンス（WGS）について説明しました。合計で、4188-6404の固有の単一ヌクレオチド多型（SNP）および312-745の挿入/削除（インデル）が、WT、ネガティブ、およびワタの参照ゲノム配列と比較して、14のCas9編集植物で検出されました。これらのバリエーションの大部分はプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）を欠いているため、Cas9で編集した後のほとんどのバリエーションは、体細胞変異または母体植物からの既存/固有の変異によるものであるが、オフターゲットではないことを示しました。効果。合計4413の潜在的なオフターゲットサイト（20 bpsgRNAおよび3bpPAMシーケンス内で</ = 5のミスマッチを許容）のうち、WGSデータは、サンガーによって検証された4つだけが真正なオフターゲットインデル変異であることを明らかにしましたシーケンス。さらに、WTの固有の遺伝的変異は、新規のオフターゲット部位を生成し、PAMを破壊する可能性があります。これは、オフターゲット効果を最小限に抑えるためにsgRNAを設計するために細心の注意を払う必要があることを示唆しています。これらの発見は、CRISPR / Cas9システムが綿花植物に非常に特異的であることを示唆しました。"]
[68,30467959,"plant","cotton (Gossypium hirsutum L.)","CRISPR;Cas9;","GoPGF","Plant biotechnology journal","Genes regulating gland development in the cotton plant.",2019,"17(6):1142-1153","[Janga MR et al.]","Texas A&M University, College Station, TX, USA.",30467959,"10.1111/pbi.13044 ","In seeds and other parts of cultivated, tetraploid cotton (Gossypium hirsutum L.), multicellular groups of cells lysigenously form dark glands containing toxic terpenoids such as gossypol that defend the plant against pests and pathogens. Using RNA-seq analysis of embryos from near-isogenic glanded (Gl2 Gl2 Gl3 Gl3 ) versus glandless (gl2 gl2 gl3 gl3 ) plants, we identified 33 genes that expressed exclusively or at higher levels in embryos just prior to gland formation in glanded plants. Virus-induced gene silencing against three gene pairs led to significant reductions in the number of glands in the leaves, and significantly lower levels of gossypol and related terpenoids. These genes encode transcription factors and have been designated the 'Cotton Gland Formation' (CGF) genes. No sequence differences were found between glanded and glandless cotton for CGF1 and CGF2 gene pairs. The glandless cotton has a transposon insertion within the coding sequence of the GoPGF (synonym CGF3) gene of the A subgenome and extensive mutations in the promoter of D subgenome homeolog. Overexpression of GoPGF (synonym CGF3) led to a dramatic increase in gossypol and related terpenoids in cultured cells, whereas CRISPR/Cas9 knockout of GoPGF (synonym CGF3) genes resulted in glandless phenotype. Taken collectively, the results show that the GoPGF (synonym CGF3) gene plays a critical role in the formation of glands in the cotton plant. Seed-specific silencing of CGF genes, either individually or in combination, could eliminate glands, thus gossypol, from the cottonseed to render it safe as food or feed for monogastrics.","cotton","栽培された四倍体ワタ（Gossypium hirsutum L.）の種子やその他の部分では、細胞の多細胞群が、害虫や病原体から植物を守るゴシポールなどの有毒なテルペノイドを含む暗い腺を同質的に形成します。ほぼ同質遺伝子の腺（Gl2 Gl2 Gl3 Gl3）と腺のない（gl2 gl2 gl3 gl3）植物の胚のRNA-seq分析を使用して、腺植物の腺形成の直前に胚で排他的または高レベルで発現する33の遺伝子を特定しました。3つの遺伝子ペアに対するウイルス誘発性の遺伝子サイレンシングにより、葉の腺の数が大幅に減少し、ゴシポールおよび関連するテルペノイドのレベルが大幅に低下しました。これらの遺伝子は転写因子をコードし、「綿腺形成」（CGF）遺伝子と呼ばれています。CGF1とCGF2の遺伝子ペアについて、グランドコットンとグランドレスコットンの間に配列の違いは見つかりませんでした。腺のない綿は、AサブゲノムのGoPGF（同義語CGF3）遺伝子のコード配列内にトランスポゾンが挿入されており、Dサブゲノムホメオログのプロモーターに広範な変異があります。GoPGF（同義語CGF3）の過剰発現は、培養細胞におけるゴシポールおよび関連するテルペノイドの劇的な増加をもたらしましたが、GoPGF（同義語CGF3）遺伝子のCRISPR / Cas9ノックアウトは、腺のない表現型をもたらしました。まとめると、結果は、GoPGF（同義語CGF3）遺伝子が綿植物の腺の形成に重要な役割を果たしていることを示しています。CGF遺伝子の種子特異的サイレンシングは、個別にまたは組み合わせて、綿実から腺、したがってゴシポールを排除し、単胃の食物または飼料として安全にすることができます。"]
[69,31109137,"plant","cowpea (Vigna unguiculata)","CRISPR;Cas9;","symbiosis receptor-like kinase","International journal of molecular sciences","Genome Editing in Cowpea Vigna unguiculata Using CRISPR-Cas9.",2019,"20(10)","[Ji J  et al.]","Huazhong Agricultural University, Wuhan, China.",31109137,"10.3390/ijms20102471 ","Cowpea (Vigna unguiculata) is widely cultivated across the world. Due to its symbiotic nitrogen fixation capability and many agronomically important traits, such as tolerance to low rainfall and low fertilization requirements, as well as  its high nutrition and health benefits, cowpea is an important legume crop, especially in many semi-arid countries. However, research in Vigna unguiculata is dramatically hampered by the lack of mutant resources and efficient tools for gene inactivation in vivo. In this study, we used clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated protein 9 (Cas9). We applied the CRISPR/Cas9-mediated genome editing technology to efficiently disrupt the representative symbiotic nitrogen fixation (SNF) gene in Vigna unguiculata. Our customized guide RNAs (gRNAs) targeting symbiosis receptor-like kinase (SYMRK) achieved ~67% mutagenic efficiency in hairy-root-transformed plants, and  nodule formation was completely blocked in the mutants with both alleles disrupted. Various types of mutations were observed near the PAM region of the respective gRNA. These results demonstrate the applicability of the CRISPR/Cas9 system in Vigna unguiculata, and therefore should significantly stimulate functional genomics analyses of many important agronomical traits in this unique  crop legume.","cowpea","カウピー（Vigna unguiculata）は、世界中で広く栽培されています。カウピーは、その共生窒素固定能力と、低降雨および低施肥要件への耐性などの多くの農業的に重要な特性、ならびにその高い栄養および健康上の利点のために、特に多くの半乾燥国において重要なマメ科作物です。しかし、Vigna unguiculataの研究は、invivoでの遺伝子不活化のための変異体リソースと効率的なツールの欠如によって劇的に妨げられています。この研究では、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）とCRISPR関連タンパク質9（Cas9）を使用しました。CRISPR / Cas9を介したゲノム編集技術を適用して、Vigna unguiculataの代表的な共生窒素固定（SNF）遺伝子を効率的に破壊しました。共生受容体様キナーゼ（SYMRK）を標的とするカスタマイズされたガイドRNA（gRNA）は、毛根形質転換植物で約67％の変異原性効率を達成し、両方の対立遺伝子が破壊された変異体では結節形成が完全にブロックされました。それぞれのgRNAのPAM領域の近くでさまざまなタイプの変異が観察されました。これらの結果は、VignaunguiculataにおけるCRISPR / Cas9システムの適用可能性を示しており、したがって、このユニークな作物マメ科植物の多くの重要な農業特性の機能的ゲノミクス分析を大幅に刺激するはずです。"]
[70,31179366,"plant","cowpea (Vigna unguiculata)","Agroinfiltration;","hpRNAi-MVR","Virusdisease","Screening of a multi-virus resistant RNAi construct in cowpea through transient vacuum infiltration method.",2019,"30(2):269-278","[Prasad Babu K et al.]","ICAR-Indian Institute of Horticultural Research, Bangalore, India.",31179366,"10.1007/s13337-018-00509-y ","Plant viruses are the most devastating pathogens causing substantial economic losses in many crops. Current viral disease management relies on prophylactics, roguing and insect vector control, since in most crops resistant gene pools for resistance breeding are unavailable. RNA interference, a sequence dependent gene  silencing mechanism holds great potential in imparting virus resistance. In this  study, the efficacy of a RNAi gene construct developed against four viruses commonly infesting tomato and chilli viz., capsicum chlorosis virus, groundnut bud necrosis virus, cucumber mosaic virus and chilli veinal mottle virus was evaluated. A 3546 bp dsRNA-forming construct comprising sense-intron-antisense fragments in binary vector pBI121 (hpRNAi-MVR) was mobilized into Agrobacterium tumefaciens. Cowpea (Vigna unguiculata) was used as an indicator plant for GBNV agroinfiltration to evaluate the efficacy of hpRNAi-MVR construct in conferring GBNV resistance. The type of agroinfiltration, bacterial concentration and incubation-temperatures were optimized. Vacuum infiltration of three pulses of 20-30 s at 66.66 kPa were effective than syringe infiltration. Of the five Agrobacterial concentrations, OD600 0.5 was more efficient. Incubation temperature of 31 +/- 1 degrees C was favorable for development of disease symptoms than 20 +/- 1 degrees C and 26 +/- 1 degrees C. ELISA revealed a 35% decline in viral load in hpRNAi-MVR infiltrated plants compared to vector control plants. Quantitative real time PCR results have shown a viral gene silencing to the extent of 930-990 folds in hpRNAi-MVR infiltrated plants compared to vector control. This approach is simple, rapid and efficient to screen the efficacy of RNAi constructs developed for the RNAi mediated plant virus management.","cowpea","植物ウイルスは最も破壊的な病原体であり、多くの作物でかなりの経済的損失を引き起こしています。現在のウイルス性疾患管理は、ほとんどの作物で耐性育種のための耐性遺伝子プールが利用できないため、予防、不正行為、および昆虫ベクター制御に依存しています。配列依存性の遺伝子サイレンシングメカニズムであるRNA干渉は、ウイルス耐性を付与する上で大きな可能性を秘めています。この研究では、トマトとチリに一般的に蔓延する4つのウイルス、すなわち、カプシカムクロロシスウイルス、落花生芽壊死ウイルス、キュウリモザイクウイルス、およびチリ静脈斑点ウイルスに対して開発されたRNAi遺伝子構築物の有効性を評価しました。バイナリーベクターpBI121（hpRNAi-MVR）にセンス-イントロン-アンチセンスフラグメントを含む3546 bp dsRNA形成コンストラクトを、Agrobacteriumtumefaciensに動員しました。ササゲ（Vigna unguiculata）は、GBNV耐性の付与におけるhpRNAi-MVRコンストラクトの有効性を評価するためのGBNVアグロインフィルトレーションの指標植物として使用されました。アグロインフィルトレーションのタイプ、細菌濃度、インキュベーション温度が最適化されました。66.66 kPaで20〜30秒の3つのパルスの真空浸透は、シリンジ浸透よりも効果的でした。5つのアグロバクテリア濃度のうち、OD6000.5がより効率的でした。31 +/- 1℃のインキュベーション温度は、20 +/- 1℃および26 +/- 1℃よりも病気の症状の発症に有利でした。ELISAは、hpRNAi-MVR浸潤植物のウイルス量が35％減少したことを明らかにしました。対照植物をベクター化する。定量的リアルタイムPCRの結果は、ベクターコントロールと比較して、hpRNAi-MVR浸潤植物で930〜990倍の範囲でウイルス遺伝子がサイレンシングしていることを示しています。このアプローチは、RNAiを介した植物ウイルス管理用に開発されたRNAiコンストラクトの有効性をスクリーニングするためのシンプルで迅速かつ効率的なアプローチです。"]
[71,30954462,"plant","cucumber","Agroinfiltration;","neutralizing epitope of PRRSV glycoprotein 5","Journal of virological methods","Development of a cucumber green mottle mosaic virus-based expression vector for the production in cucumber of neutralizing epitopes against a devastating animal  virus.",2019,"269:18-25","[Tran HH et al.]","London Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food Canada, London, Ontario, Canada.",30954462,"10.1016/j.jviromet.2019.04.006 ","Virus-based expression systems have been widely exploited for the production of recombinant proteins in plants during the last thirty years. Advances in technology have boosted scale-up manufacturing of plant-made pharmaceuticals to high levels, via the complementation of transient expression and viral vectors. This combination allows proteins of interest to be produced in plants within a matter of days and thus, is well suited for the development of plant-made vaccines or therapeutics against emerging infectious diseases and potential bioterrorism agents. Several plant-based products are currently in varying stages of clinical development. To investigate the viability of virus-based expression systems for plant-made vaccines against porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), the most devastating threat to the pork industry in Canada, we cloned the full-length genome of a cucumber green mottle mosaic virus  (CGMMV) isolate and developed a CGMMV-based expression vector. We further employed this vector to express the neutralizing epitope (NE) of PRRSV glycoprotein 5 (GP5) in cucumber leaves via agroinfiltration. The coding region of the GP5 NE was inserted downstream of the open reading frame for coat protein  (CP) and expressed by a readthrough mechanism. The chimeric virus particles were  stable and the expression levels reached as high as 35.84 mg/kg of cucumber leaf  fresh weight. This study offers a promising solution to the production of a low cost, versatile and robust vaccine for oral administration against PRRSV through  a chimeric virus particle display system.","cucumber","ウイルスベースの発現システムは、過去30年間、植物における組換えタンパク質の生産に広く利用されてきました。技術の進歩により、一過性の発現とウイルスベクターの補完により、植物製医薬品のスケールアップ製造が高レベルにまで押し上げられました。この組み合わせにより、目的のタンパク質を数日以内に植物で生産できるため、植物製のワクチンや、新たな感染症や潜在的な生物テロ因子に対する治療法の開発に適しています。いくつかの植物ベースの製品は、現在、臨床開発のさまざまな段階にあります。カナダの豚肉産業にとって最も壊滅的な脅威であるブタ生殖呼吸症候群ウイルス（PRRSV）に対する植物製ワクチンのウイルスベースの発現システムの実行可能性を調査するために、キュウリの緑のまだらモザイクの全長ゲノムをクローン化しました。ウイルス（CGMMV）は、CGMMVベースの発現ベクターを分離して開発しました。さらに、このベクターを使用して、アグロインフィルトレーションを介してキュウリの葉でPRRSV糖タンパク質5（GP5）の中和エピトープ（NE）を発現させました。GP5 NEのコーディング領域は、コートタンパク質（CP）のオープンリーディングフレームの下流に挿入され、リードスルーメカニズムによって発現されました。キメラウイルス粒子は安定しており、発現レベルは35.84 mg / kgのキュウリの葉の新鮮重量に達した。この研究は、キメラウイルス粒子ディスプレイシステムを介したPRRSVに対する経口投与のための低コストで用途が広く堅牢なワクチンの製造に対する有望な解決策を提供します。"]
[72,30972865,"plant","duckweed (Lemna aequinoctialis)","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","LaPDS","Plant biotechnology journal","Efficient genetic transformation and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in Lemna aequinoctialis.",2019,"17(11):2143-2152","[Liu Y et al.]","Qingdao Agricultural University, Qingdao, China.",30972865,"10.1111/pbi.13128 ","The fast growth, ease of metabolic labelling and potential for feedstock and biofuels production make duckweeds not only an attractive model system for understanding plant biology, but also a potential future crop. However, current duckweed research is constrained by the lack of efficient genetic manipulation tools. Here, we report a case study on genome editing in a duckweed species, Lemna aequinoctialis, using a fast and efficient transformation and CRISPR/Cas9 tool. By optimizing currently available transformation protocols, we reduced the  duration time of Agrobacterium-mediated transformation to 5-6 weeks with a success rate of over 94%. Based on the optimized transformation protocol, we generated 15 (14.3% success rate) biallelic LaPDS mutants that showed albino phenotype using a CRISPR/Cas9 system. Investigations on CRISPR/Cas9-mediated mutation spectrum among mutated L. aequinoctialis showed that most of mutations were short insertions and deletions. This study presents the first example of CRISPR/Cas9-mediated genome editing in duckweeds, which will open new research avenues in using duckweeds for both basic and applied research.","duckweed","急速な成長、代謝標識の容易さ、および原料とバイオ燃料生産の可能性により、アヒルの雑草は植物生物学を理解するための魅力的なモデルシステムであるだけでなく、将来の作物の可能性もあります。ただし、現在のアヒルの子の研究は、効率的な遺伝子操作ツールの欠如によって制約されています。ここでは、高速かつ効率的な変換とCRISPR / Cas9ツールを使用して、ウキクサ種、Lemnaaequinoctialisのゲノム編集に関するケーススタディを報告します。現在利用可能な形質転換プロトコルを最適化することにより、アグロバクテリウムを介した形質転換の期間を5〜6週間に短縮し、成功率は94％を超えました。最適化された変換プロトコルに基づいて、CRISPR / Cas9システムを使用してアルビノ表現型を示す15（14.3％の成功率）の2対立遺伝子LaPDS変異体を生成しました。変異したL.aequinoctialisのCRISPR / Cas9を介した変異スペクトルに関する調査では、変異のほとんどが短い挿入と削除であることが示されました。この研究は、ウキクサにおけるCRISPR / Cas9を介したゲノム編集の最初の例を示しています。これにより、基礎研究と応用研究の両方にウキクサを使用する新しい研究の道が開かれます。"]
[73,31676875,"plant","gentian flowers","CRISPR;Cas9;","anthocyanin 5-O-glycosyltransferase (Gt5GT); anthocyanin 3'-O-glycosyltransferase (Gt3'GT); anthocyanin 5/3'-aromatic acyltransferase (Gt5/3'AT)","Scientific reports","Effects of knocking out three anthocyanin modification genes on the blue pigmentation of gentian flowers.",2019,"9(1):15831","[Tasaki K et al.]","Iwate Biotechnology Research Center, Kitakami, Iwate, Japan.",31676875,"10.1038/s41598-019-51808-3 ","Genome editing by the CRISPR/Cas9 system has recently been used to produce gene knockout lines in many plant species. We applied this system to analyze Japanese  gentian plants that produce blue flowers because of the accumulation of a polyacylated anthocyanin, gentiodelphin. Mutant lines in which anthocyanin modification genes were knocked out were examined to assess the contribution of each gene to the blue pigmentation of flowers. The targeted genes encoded anthocyanin 5-O-glycosyltransferase (Gt5GT), anthocyanin 3'-O-glycosyltransferase (Gt3'GT), and anthocyanin 5/3'-aromatic acyltransferase (Gt5/3'AT). The Gt5GT knockout lines accumulated delphinidin 3G, whereas the Gt3'GT knockout lines accumulated delphinidin 3G-5CafG as the major flower pigment. Knocking out Gt5/3'AT resulted in the accumulation of delphinidin 3G-5G-3'G and delphinidin 3G-5G as the primary and secondary pigments, respectively. These results indicated the existence of two pathways mediating the modification of delphinidin 3G-5G in flowers, with one involving a glycosylation by 3'GT and the other involving an acylation by 5/3'AT. The Gt5GT, Gt3'GT, and Gt5/3'AT transformants produced pale red violet, dull pink, and pale mauve flowers, respectively, unlike the vivid blue flowers of wild-type plants. Thus, the glycosylation and subsequent acylation of the 3'-hydroxy group of the B-ring in delphinidin aglycone is essential for the development of blue gentian flowers.","gentian flowers","CRISPR / Cas9システムによるゲノム編集は、最近、多くの植物種で遺伝子ノックアウトラインを作成するために使用されています。このシステムを適用して、ポリアシル化アントシアニンであるゲンチオデルフィンの蓄積により青い花を生成する日本のゲンチアナ植物を分析しました。アントシアニン修飾遺伝子がノックアウトされた変異株を調べて、花の青色色素沈着に対する各遺伝子の寄与を評価した。標的遺伝子は、アントシアニン5-O-グリコシルトランスフェラーゼ（Gt5GT）、アントシアニン3'-O-グリコシルトランスフェラーゼ（Gt3'GT）、およびアントシアニン5 / 3'-芳香族アシルトランスフェラーゼ（Gt5 / 3'AT）をコードしていた。Gt5GTノックアウトラインはデルフィニジン3Gを蓄積しましたが、Gt3'GTノックアウトラインは主要な花の色素としてデルフィニジン3G-5CafGを蓄積しました。Gt5 / 3'ATをノックアウトすると、一次および二次色素としてそれぞれデルフィニジン3G-5G-3'Gおよびデルフィニジン3G-5Gが蓄積しました。これらの結果は、花のデルフィニジン3G-5Gの修飾を媒介する2つの経路の存在を示しており、1つは3'GTによるグリコシル化を含み、もう1つは5 / 3'ATによるアシル化を含みます。Gt5GT、Gt3'GT、およびGt5 / 3'AT形質転換体は、野生型植物の鮮やかな青い花とは異なり、それぞれ淡い赤紫、鈍いピンク、および淡い藤色の花を生成しました。したがって、デルフィニジンアグリコンのB環の3'-ヒドロキシ基のグリコシル化とそれに続くアシル化は、青いゲンチアナの花の発達に不可欠です。"]
[74,31156675,"plant","grape","CRISPR;Cas9;","phytoene desaturase","Frontiers in plant science","Efficiency Optimization of CRISPR/Cas9-Mediated Targeted Mutagenesis in Grape.",2019,"10:612","[Ren F et al.]","Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China.",31156675,"10.3389/fpls.2019.00612 ","Clustered regularly interspersed short palindromic repeats (CRISPR)/Cas system is an efficient targeted genome editing method. Although CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis has been applied successfully in grape, few studies have examined the technique's efficiency. To optimize CRISPR/Cas9 editing efficiency in Vitis vinifera, we surveyed three key parameters: GC content of single guide RNA (sgRNA), variety of transformant cells used, and SpCas9 expression levels in transgenic cell mass. Four sgRNAs with differing GC content were designed to target exon sites of the V. vinifera phytoene desaturase gene. Suspension cells of 'Chardonnay' and '41B' varieties were used as the transgenic cell mass. Both T7EI and PCR/RE assays showed that CRISPR/Cas9 editing efficiency increases proportionally with sgRNA GC content with 65% GC content yielding highest editing efficiency in both varieties. Additionally, gene editing was more efficient in '41B' than in 'Chardonnay.' CRISPR/Cas9 systems with different editing efficiency showed different SpCas9 expression level, but compared with GC content of sgRNA,  SpCas9 expression level has less influence on editing efficiency. Taken together, these results help optimize of CRISPR/Cas9 performance in grape.","grape","クラスター化された定期的に散在する短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ Casシステムは、効率的なターゲットゲノム編集方法です。CRISPR / Cas9を介した突然変異誘発はブドウにうまく適用されていますが、この技術の効率を調べた研究はほとんどありません。VitisviniferaでのCRISPR / Cas9編集効率を最適化するために、3つの主要なパラメーターを調査しました：シングルガイドRNA（sgRNA）のGC含有量、使用されるさまざまな形質転換細胞、およびトランスジェニック細胞塊におけるSpCas9発現レベル。異なるGC含量を持つ4つのsgRNAは、V。viniferaフィトエンデサチュラーゼ遺伝子のエクソン部位を標的とするように設計されました。トランスジェニック細胞塊として、「カルドネ」および「41B」品種の懸濁細胞を使用した。T7EIアッセイとPCR / REアッセイはどちらも、CRISPR / Cas9編集効率がsgRNAGCコンテンツに比例して増加し、65％のGCコンテンツが両方の品種で最高の編集効率をもたらすことを示しました。さらに、遺伝子編集は「Chardonnay」よりも「41B」の方が効率的でした。編集効率が異なるCRISPR / Cas9システムは異なるSpCas9発現レベルを示しましたが、sgRNAのGC含有量と比較して、SpCas9発現レベルは編集効率への影響が少ないです。まとめると、これらの結果は、ブドウのCRISPR / Cas9パフォーマンスの最適化に役立ちます。"]
[75,30908830,"plant","Duncan grapefruit","CRISPR;Cpf1;Agroinfiltration;","CsPDS; CsLOB1","Plant biotechnology journal","CRISPR-LbCas12a-mediated modification of citrus.",2019,"17(10):1928-1937","[Jia H et al.]","University of Florida, Lake Alfred, FL, USA.",30908830,"10.1111/pbi.13109 ","Recently, CRISPR-Cas12a (Cpf1) from Prevotella and Francisella was engineered to  modify plant genomes. In this report, we employed CRISPR-LbCas12a (LbCpf1), which is derived from Lachnospiraceae bacterium ND2006, to edit a citrus genome for the first time. First, LbCas12a was used to modify the CsPDS gene successfully in Duncan grapefruit via Xcc-facilitated agroinfiltration. Next, LbCas12a driven by  either the 35S or Yao promoter was used to edit the PthA4 effector binding elements in the promoter (EBEP thA4 -CsLOBP) of CsLOB1. A single crRNA was selected to target a conserved region of both Type I and Type II CsLOBPs, since the protospacer adjacent motif of LbCas12a (TTTV) allows crRNA to act on the conserved region of these two types of CsLOBP. CsLOB1 is the canker susceptibility gene, and it is induced by the corresponding pathogenicity factor  PthA4 in Xanthomonas citri by binding to EBEP thA4 -CsLOBP. A total of seven 35S-LbCas12a-transformed Duncan plants were generated, and they were designated as #D35 s1 to #D35 s7, and ten Yao-LbCas12a-transformed Duncan plants were created and designated as #Dyao 1 to #Dyao 10. LbCas12a-directed EBEP thA4 -CsLOBP modifications were observed in three 35S-LbCas12a-transformed Duncan plants (#D35 s1, #D35 s4 and #D35 s7). However, no LbCas12a-mediated indels were  observed in the Yao-LbCas12a-transformed plants. Notably, transgenic line #D35 s4, which contains the highest mutation rate, alleviates XccDeltapthA4:dCsLOB1.4  infection. Finally, no potential off-targets were observed. Therefore, CRISPR-LbCas12a can readily be used as a powerful tool for citrus genome editing.","grapefruit","最近、PrevotellaおよびFrancisellaのCRISPR-Cas12a（Cpf1）が、植物ゲノムを改変するように設計されました。このレポートでは、Lachnospiraceae細菌ND2006に由来するCRISPR-LbCas12a（LbCpf1）を使用して、柑橘類のゲノムを初めて編集しました。最初に、LbCas12aを使用して、Xccが促進するアグロインフィルトレーションを介してダンカングレープフルーツのCsPDS遺伝子を正常に変更しました。次に、35SまたはYaoプロモーターのいずれかによって駆動されるLbCas12aを使用して、CsLOB1のプロモーター（EBEP thA4 -CsLOBP）内のPthA4エフェクター結合要素を編集しました。LbCas12a（TTTV）のプロトスペーサー隣接モチーフにより、crRNAがこれら2つのタイプのCsLOBPの保存領域に作用できるため、タイプIとタイプIIの両方のCsLOBPの保存領域をターゲットとする単一のcrRNAが選択されました。CsLOB1は潰瘍感受性遺伝子であり、EBEP thA4 -CsLOBPに結合することにより、Xanthomonascitriの対応する病原性因子PthA4によって誘導されます。合計7つの35S-LbCas12a変換ダンカン植物が生成され、それらは＃D35 s1から＃D35 s7として指定され、10のYao-LbCas12a変換ダンカン植物が作成されて＃Dyao1から＃Dyao10として指定されました。LbCas12a 35S-LbCas12aで形質転換された3つのダンカン植物（＃D35 s1、＃D35 s4、および＃D35 s7）で、指向性EBEP thA4-CsLOBPの変更が観察されました。しかし、Yao-LbCas12aで形質転換された植物では、LbCas12aを介したインデルは観察されませんでした。特に、最も高い突然変異率を含むトランスジェニック系統＃D35 s4は、XccDeltapthA4：dCsLOB1.4感染を軽減します。最後に、潜在的なオフターゲットは観察されませんでした。したがって、CRISPR-LbCas12aは柑橘類のゲノム編集のための強力なツールとして容易に使用できます。"]
[76,31423365,"plant","Hibiscus hamabo Sieb. et Zucc.","Agroinfiltration;","cloroplastos alterados 1","PeerJ","Efficient virus-induced gene silencing in Hibiscus hamabo Sieb. et Zucc. using tobacco rattle virus.",2019,"7:e7505","[Wang Z et al.]","Institute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences, Nanjing, Jiangsu, China.",31423365,"10.7717/peerj.7505 ","Background: Hibiscus hamabo Sieb. et Zucc. is a semi-mangrove plant used for the  ecological restoration of saline-alkali land, coastal afforestation and urban landscaping. The genetic transformation H. hamabo is currently inefficient and laborious, restricting gene functional studies on this species. In plants, virus-induced gene silencing provides a pathway to rapidly and effectively create targeted gene knockouts for gene functional studies. Methods: In this study, we tested the efficiency of a tobacco rattle virus vector in silencing the cloroplastos alterados 1 (CLA1) gene through agroinfiltration. Results: The leaves of H. hamabo showed white streaks typical of CLA1 gene silencing three weeks after agroinfiltration. In agroinfiltrated H. hamabo plants, the CLA1 expression levels in leaves with white streaks were all significantly lower than  those in leaves from mock-infected and control plants. Conclusions: The system presented here can efficiently silence genes in H. hamabo and may be a powerful tool for large-scale reverse-genetic analyses of gene functions in H. hamabo.","Hibiscus hamabo Sieb. et Zucc.","背景：ハイビスカスハマボシーブ。etZucc。は、塩水アルカリ性の土地の生態学的な回復、沿岸の植林、都市の造園に使用されるセミマングローブ植物です。遺伝的形質転換H.hamaboは現在非効率的で骨の折れるものであり、この種の遺伝子機能研究を制限しています。植物では、ウイルス誘発性の遺伝子サイレンシングは、遺伝子機能研究のための標的遺伝子ノックアウトを迅速かつ効果的に作成するための経路を提供します。方法：この研究では、アグロインフィルトレーションを介してcloroplastos alterados 1（CLA1）遺伝子をサイレンシングする際のタバコガラガラウイルスベクターの効率をテストしました。結果：H。hamaboの葉は、アグロインフィルトレーションの3週間後にCLA1遺伝子のサイレンシングに典型的な白い縞を示しました。アグロインフィルトレーションされたH.hamabo植物では、白い筋のある葉のCLA1発現レベルはすべて、模擬感染植物および対照植物の葉のCLA1発現レベルよりも有意に低かった。結論：ここで紹介するシステムは、H。hamaboの遺伝子を効率的にサイレンシングすることができ、H。hamaboの遺伝子機能の大規模な逆遺伝学的分析のための強力なツールとなる可能性があります。"]
[77,30806711,"plant","hybrid aspen","CRISPR;Cas9;","all NAC SECONDARY WALL THICKENING PROMOTING FACTOR3/SECONDARY WALL-ASSOCIATED NAC DOMAIN PROTEIN 1 (NST3/SND1) genes","Tree physiology","Populus NST/SND orthologs are key regulators of secondary cell wall formation in  wood fibers, phloem fibers and xylem ray parenchyma cells.",2019,"39(4):514-525","[Takata N et al.]","Forestry and Forest Products Research Institute, Hitachi, Ibaraki, Japan.",30806711,"10.1093/treephys/tpz004 ","Wood fibers form thick secondary cell wall (SCW) in xylem tissues to give mechanical support to trees. NAC SECONDARY WALL THICKENING PROMOTING FACTOR3/SECONDARY WALL-ASSOCIATED NAC DOMAIN PROTEIN 1 (NST3/SND1) and NST1 were  identified as master regulators of SCW formation in xylem fiber cells in the model plant Arabidopsis thaliana. In Populus species, four NST/SND orthologs have been conserved and coordinately control SCW formation in wood fibers and phloem fibers. However, it remains to be elucidated whether SCW formation in other xylem cells, such as ray parenchyma cells and vessel elements, is regulated by NST/SND  orthologs in poplar. We knocked out all NST/SND genes in hybrid aspen using the clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 nuclease (Cas9) system and investigated the  detailed histological appearance of stem tissues in the knockout mutants. Observation by light microscopy and transmission electron microscopy showed that  SCW was severely suppressed in wood fibers, phloem fibers and xylem ray parenchyma cells in the knockout mutants. Although almost all wood fibers lacked  SCW, some fiber cells formed thick cell walls. The irregularly cell wall-forming  fibers retained primary wall and SCW, and were mainly located in the vicinity of  vessel elements. Field emission-scanning electron microscope observation showed that there were no apparent differences in the structural features of pits such as the shape and size between irregularly SCW-forming wood fibers in the knockout mutants and normal wood fibers in wild-type. Cell wall components such as cellulose, hemicellulose and lignin were deposited in the cell wall of irregularly SCW-forming wood fibers in quadruple mutants. Our results indicate that four NST/SND orthologs are master switches for SCW formation in wood fibers, xylem ray parenchyma cells and phloem fibers in poplar, while SCW is still formed in limited wood fibers, which are located at the region adjacent to vessel elements in the knockout mutants.","hybrid aspen","木質繊維は、木に機械的支持を与えるために、キシレム組織に厚い二次細胞壁（SCW）を形成します。NAC二次壁肥厚促進因子3 /二次壁関連NACドメインタンパク質1（NST3 / SND1）およびNST1は、モデル植物Arabidopsisthalianaのキシレム繊維細胞におけるSCW形成のマスターレギュレーターとして同定されました。Populus種では、4つのNST / SNDオルソログが保存されており、木質繊維とフロム繊維のSCW形成を協調的に制御しています。しかし、光線実質細胞や血管要素などの他のキシレム細胞でのSCW形成が、ポプラのNST / SNDオルソログによって調節されているかどうかはまだ解明されていません。クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9ヌクレアーゼ（Cas9）システムを使用して、ハイブリッドアスペンのすべてのNST / SND遺伝子をノックアウトし、ノックアウト変異体の幹組織の詳細な組織学的外観を調査しました。光学顕微鏡および透過電子顕微鏡による観察は、SCWがノックアウト変異体の木材繊維、フロム繊維およびキシレム光線実質細胞においてひどく抑制されたことを示した。ほとんどすべての木質繊維はSCWを欠いていましたが、一部の繊維セルは厚いセル壁を形成していました。不規則な細胞壁形成繊維は一次壁とSCWを保持し、主に血管要素の近くに位置していた。電界放出走査型電子顕微鏡観察は、ノックアウト変異体の不規則なSCW形成木質繊維と野生型の通常の木質繊維との間の形状およびサイズなどのピットの構造的特徴に明らかな違いがないことを示した。セルロース、ヘミセルロース、リグニンなどの細胞壁成分は、4重変異体の不規則なSCW形成木質繊維の細胞壁に沈着しました。私たちの結果は、4つのNST / SNDオルソログが木質繊維、キシレム光線実質細胞、ポプラのフロエム繊維のSCW形成のマスタースイッチであるのに対し、SCWはまだ限られた木質繊維で形成されていることを示しています。ノックアウト変異体。"]
[78,31562521,"plant","Kalanchoe fedtschenkoi","CRISPR;Cas9;","blue light receptor phototropin 2","Journal of experimental botany","CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis for functional genomics research of crassulacean acid metabolism plants.",2019,"70(22):6621-6629","[Liu D et al.]","Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN, USA.",31562521,"10.1093/jxb/erz415 ","Crassulacean acid metabolism (CAM) is an important photosynthetic pathway in diverse lineages of plants featuring high water-use efficiency and drought tolerance. A big challenge facing the CAM research community is to understand the function of the annotated genes in CAM plant genomes. Recently, a new genome editing technology using CRISPR/Cas9 has become a more precise and powerful tool  than traditional approaches for functional genomics research in C3 and C4 plants. In this study, we explore the potential of CRISPR/Cas9 to characterize the function of CAM-related genes in the model CAM species Kalanchoe fedtschenkoi. We demonstrate that CRISPR/Cas9 is effective in creating biallelic indel mutagenesis to reveal previously unknown roles of blue light receptor phototropin 2 (KfePHOT2) in the CAM pathway. Knocking out KfePHOT2 reduced stomatal conductance and CO2 fixation in late afternoon and increased stomatal conductance and CO2 fixation during the night, indicating that blue light signaling plays an important role in the CAM pathway. Lastly, we provide a genome-wide guide RNA database targeting 45 183 protein-coding transcripts annotated in the K. fedtschenkoi genome.","Kalanchoe fedtschenkoi","Crassulacean酸代謝（CAM）は、高い水利用効率と耐乾性を特徴とする植物の多様な系統における重要な光合成経路です。CAM研究コミュニティが直面している大きな課題は、CAM植物ゲノムの注釈付き遺伝子の機能を理解することです。最近、CRISPR / Cas9を使用した新しいゲノム編集技術は、C3およびC4植物の機能的ゲノミクス研究のための従来のアプローチよりも正確で強力なツールになりました。この研究では、モデルCAM種KalanchoefedtschenkoiのCAM関連遺伝子の機能を特徴付けるCRISPR / Cas9の可能性を探ります。CRISPR / Cas9が二対立遺伝子のインデル突然変異誘発を作成するのに効果的であり、CAM経路における青色光受容体フォトトロピン2（KfePHOT2）のこれまで知られていなかった役割を明らかにすることを示します。KfePHOT2をノックアウトすると、午後遅くに気孔コンダクタンスとCO2固定が減少し、夜間に気孔コンダクタンスとCO2固定が増加しました。これは、青色光信号がCAM経路で重要な役割を果たしていることを示しています。最後に、K。fedtschenkoiゲノムで注釈が付けられた45183のタンパク質コーディング転写物を対象としたゲノム全体のガイドRNAデータベースを提供します。"]
[79,30302894,"plant","kiwifruit (Actinidia chinensis)","CRISPR;Cas9;","CENTRORADIALIS (CEN)-like gene (AcCEN4; AcCEN)","Plant biotechnology journal","Mutagenesis of kiwifruit CENTRORADIALIS-like genes transforms a climbing woody perennial with long juvenility and axillary flowering into a compact plant with rapid terminal flowering.",2019,"17(5):869-880","[Varkonyi-Gasic E  et al.]","New Zealand Institute for Plant & Food Research Limited (Plant & Food Research), Auckland, New Zealand.",30302894,"10.1111/pbi.13021 ","Annualization of woody perennials has the potential to revolutionize the breeding and production of fruit crops and rapidly improve horticultural species. Kiwifruit (Actinidia chinensis) is a recently domesticated fruit crop with a short history of breeding and tremendous potential for improvement. Previously, multiple kiwifruit CENTRORADIALIS (CEN)-like genes have been identified as potential repressors of flowering. In this study, CRISPR/Cas9- mediated manipulation enabled functional analysis of kiwifruit CEN-like genes AcCEN4 and AcCEN. Mutation of these genes transformed a climbing woody perennial, which develops axillary inflorescences after many years of juvenility, into a compact plant with rapid terminal flower and fruit development. The number of affected genes and alleles and severity of detected mutations correlated with the precocity and change in plant stature, suggesting that a bi-allelic mutation of either AcCEN4 or AcCEN may be sufficient for early flowering, whereas mutations affecting both genes further contributed to precocity and enhanced the compact growth habit. CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of AcCEN4 and AcCEN may be a valuable means to engineer Actinidia amenable for accelerated breeding, indoor farming and cultivation as an annual crop.","kiwifruit (Actinidia chinensis)","木本多年生植物の年次化は、果樹の育種と生産に革命をもたらし、園芸種を急速に改善する可能性を秘めています。キウイフルーツ（Actinidia chinensis）は最近飼育された果物作物で、繁殖の歴史が短く、改善の可能性が非常に高いです。以前は、複数のキウイフルーツCENTRORADIALIS（CEN）のような遺伝子が、開花の潜在的な抑制因子として特定されていました。この研究では、CRISPR / Cas9を介した操作により、キウイフルーツのCEN様遺伝子AcCEN4およびAcCENの機能分析が可能になりました。これらの遺伝子の変異は、長年の若さの後に腋窩花序を発達させる登山木質多年生を、急速な終末花と果実の発達を伴うコンパクトな植物に変えました。影響を受けた遺伝子と対立遺伝子の数、および検出された突然変異の重症度は、早熟性と植物の身長の変化と相関しており、AcCEN4またはAcCENのいずれかのバイアレリック突然変異が早期開花に十分である可能性があることを示唆していますが、両方の遺伝子に影響を与える突然変異はさらに早熟性に寄与しましたコンパクトな成長習慣を強化しました。CRISPR / Cas9を介したAcCEN4およびAcCENの突然変異誘発は、年間作物としての繁殖、屋内農業、および栽培の加速に適したActinidiaを設計するための貴重な手段となる可能性があります。"]
[80,31207994,"plant","Lilium pumilum DC. Fisch.; Lilium longiflorum 'White Heaven'","CRISPR;Cas9;","LpPDS","International journal of molecular sciences","Establishment of Efficient Genetic Transformation Systems and Application of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technology in Lilium pumilum DC. Fisch. and Lilium longiflorum White Heaven.",2019,"20(12)","[Yan R et al.]","Shenyang Agricultural University, Shenyang, China.",31207994,"10.3390/ijms20122920 ","Lilium spp. is a bulb flower with worldwide distribution and unique underground organs. The lack of an efficient genetic transformation system for Lilium has been an international obstacle. Because existing model plants lack bulbs, bulb-related gene function verification studies cannot be carried out in model plants. Here, two stable and efficient genetic transformation systems based on somatic embryogenesis and adventitious bud regeneration were established in two Lilium species. Transgenic plants and T-DNA insertion lines were confirmed by beta-glucuronidase (GUS) assay, polymerase chain reaction (PCR) and Southern blot. After condition optimization, transformation efficiencies were increased to 29.17% and 4% in Lilium pumilum DC. Fisch. and the Lilium longiflorum 'White Heaven', respectively. To further verify the validity of these transformation systems and apply the CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-associated protein 9) technology in Lilium, the LpPDS gene in the two Lilium species was knocked out. Completely albino, pale yellow and albino-green chimeric mutants were observed. Sequence analysis in the  transgenic lines revealed various mutation patterns, including base insertion, deletion and substitution. These results verified the feasibility and high efficiency of both transformation systems and the successful application of the CRISPR/Cas9 system to gene editing in Lilium for the first time. Overall, this study lays an important foundation for gene function research and germplasm improvement in Lilium spp.","Lilium pumilum DC. Fisch.; Lilium longiflorum 'White Heaven'","ユリ属 は、世界中に分布し、ユニークな地下器官を持つ球根の花です。リリウムの効率的な遺伝子変換システムの欠如は、国際的な障害となっています。既存のモデル植物には球根がないため、球根関連の遺伝子機能検証研究をモデル植物で実施することはできません。ここでは、体細胞胚形成と不定芽再生に基づく2つの安定した効率的な遺伝子形質転換システムが2つのリリウム種で確立されました。トランスジェニック植物とT-DNA挿入系統は、ベータグルクロニダーゼ（GUS）アッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、およびサザンブロットによって確認されました。条件の最適化後、変換効率はLilium pumilum DCで29.17％と4％に増加しました。フィッシュ。それぞれ、Lilium longiflorum'WhiteHeaven '。これらの形質転換システムの有効性をさらに検証し、CRISPR / Cas9（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）関連タンパク質9）テクノロジーをリリウムに適用するために、2つのリリウム種のLpPDS遺伝子をノックアウトしました。完全にアルビノ、淡黄色、アルビノグリーンのキメラ変異体が観察された。トランスジェニック系統の配列分析により、塩基の挿入、削除、置換など、さまざまな変異パターンが明らかになりました。これらの結果は、両方の形質転換システムの実現可能性と高効率、およびCRISPR / Cas9システムのリリウムでの遺伝子編集への適用の成功を初めて検証しました。全体として、この研究は、ユリ属の遺伝子機能研究と遺伝資源の改善のための重要な基盤を築きます。"]
[81,30442644,"plant","liverwort","CRISPR;Cas9;","Mppyl1","Plant physiology","Archetypal Roles of an Abscisic Acid Receptor in Drought and Sugar Responses in Liverworts.",2019,"179(1):317-328","[Jahan A et al.]","Saitama University, Saitama, Japan.",30442644,"10.1104/pp.18.00761 ","Abscisic acid (ABA) controls seed dormancy and stomatal closure through binding to the intracellular receptor Pyrabactin resistance1 (Pyr1)/Pyr1-like/regulatory  components of ABA receptors (PYR/PYL/RCAR) in angiosperms. Genes encoding PYR/PYL/RCAR are thought to have arisen in the ancestor of embryophytes, but the  roles of the genes in nonvascular plants have not been determined. In the liverwort Marchantia polymorpha, ABA reduces growth and enhances desiccation tolerance through increasing accumulation of intracellular sugars and various transcripts such as those of Late Embryogenesis Abundant (LEA)-like genes. In this study, we analyzed a gene designated MpPYL1, which is closely related to PYR/PYL/RCAR of angiosperms, in transgenic liverworts. Transgenic lines overexpressing MpPYL1-GFP showed ABA-hypersensitive growth with enhanced desiccation tolerance, whereas Mppyl1 generated by CRISPR-Cas9-mediated genome editing showed ABA-insensitive growth with reduced desiccation tolerance. Transcriptome analysis indicated that MpPYL1 is a major regulator of abiotic stress-associated genes, including all 35 ABA-induced LEA-like genes. Furthermore, these transgenic plants showed altered responses to extracellular Suc, suggesting that ABA and PYR/PYL/RCAR function in sugar responses. The results presented here reveal an important role of PYR/PYL/RCAR in the ABA response, which was likely acquired in the common ancestor of land plants. The results also indicate the archetypal role of ABA and its receptor in sugar response and accumulation processes for vegetative desiccation tolerance in bryophytes.","liverwort","アブシジン酸（ABA）は、血管精子の細胞内受容体ピラバクチン耐性1（Pyr1）/ Pyr1様/ ABA受容体の調節成分（PYR / PYL / RCAR）に結合することにより、種子の休眠と気孔閉鎖を制御します。PYR / PYL / RCARをコードする遺伝子は、陸上植物の祖先で発生したと考えられていますが、非血管植物における遺伝子の役割は決定されていません。ゼニゴケのMarchantiapolymorphaでは、ABAは細胞内糖や後期胚発生豊富（LEA）様遺伝子などのさまざまな転写産物の蓄積を増加させることにより、成長を抑制し、乾燥耐性を高めます。この研究では、トランスジェニック肝盂において、血管精子のPYR / PYL / RCARに密接に関連するMpPYL1と呼ばれる遺伝子を分析しました。MpPYL1-GFPを過剰発現するトランスジェニック系統は、乾燥耐性が強化されたABA過敏性増殖を示したのに対し、CRISPR-Cas9を介したゲノム編集によって生成されたMppyl1は、乾燥耐性が低下したABA非感受性増殖を示しました。トランスクリプトーム分析は、MpPYL1が35のABA誘発LEA様遺伝子すべてを含む非生物的ストレス関連遺伝子の主要な調節因子であることを示しました。さらに、これらのトランスジェニック植物は、細胞外Sucに対する応答の変化を示し、ABAおよびPYR / PYL / RCARが糖応答で機能することを示唆しています。ここに示す結果は、ABA応答におけるPYR / PYL / RCARの重要な役割を明らかにしています。これは、陸上植物の共通の祖先で獲得された可能性があります。結果はまた、bryophytesの栄養乾燥耐性のための糖反応と蓄積プロセスにおけるABAとその受容体の典型的な役割を示しています。"]
[82,31543452,"plant","liverwort (Marchantia polymorpha)","CRISPR;Cas9;","mir529c","Current biology","An Early Arising Role of the MicroRNA156/529-SPL Module in Reproductive Development Revealed by the Liverwort Marchantia polymorpha.",2019,"29(19):3307-3314.e5","[Tsuzuki M et al.]","University of Tokyo, Tokyo, Japan.",31543452,"10.1016/j.cub.2019.07.084 ","In angiosperms, the phase transition from vegetative to reproductive growth involves the de-repression of the squamosa promoter-binding-protein-like (SPL) class of transcription factors, which is negatively regulated by the specific microRNAs (miRNAs/miRs) miR156/529 [1]. Non-vascular land plants also undergo growth-phase transition to the reproductive state, but knowledge regarding the controlling mechanisms is limited. Here, we investigate the reproductive transition in the liverwort Marchantia polymorpha, focusing on the roles of miR529c [2-4] and MpSPL2. First, we established mir529c-null mutants using CRISPR/Cas9. Even in the absence of far-red light-supplemented long-day condition, which is usually needed to induce reproductive development [5, 6], the mutant thalli developed sexual reproductive organs (gametangia) and produced gametes. Transgenic plants expressing a miR529-resistant MpSPL2 transgene also showed a similar phenotype of reproductive transition in the absence of inductive far-red light signals. In these mutants and transgenic plants, the MpSPL2 mRNA abundance was elevated. Mpspl2(ko) mutant plants showed successful gamete development and fertilization, which suggests that MpSPL2 is involved in, but not essential for, sexual reproduction in M. polymorpha. Furthermore, analysis of Mpspl2(ko) mutant and its complemented lines suggests that MpSPL2 may have a role in promotion of reproductive transition. These findings support the notion that the transition to reproductive development in liverworts is controlled by a system similar to that in angiosperms, and the miR156/529-SPL module has common significance in the control of the vegetative-to-reproductive transition during development in many land plants, including liverworts.","liverwort (Marchantia polymorpha)","血管精子では、栄養成長から生殖成長への相転移には、特定のマイクロRNA（miRNA / miR）miR156 / 529によって負に調節されるスクアモサプロモーター結合タンパク質様（SPL）クラスの転写因子の抑制解除が含まれます。 [1]。非血管性陸上植物もまた、増殖期から生殖状態への移行を経るが、制御メカニズムに関する知識は限られている。ここでは、miR529c [2-4]とMpSPL2の役割に焦点を当てて、肝虫マルカンティアポリモルファの生殖遷移を調査します。まず、CRISPR / Cas9を使用してmir529c-null変異体を確立しました。生殖発達を誘発するために通常必要とされる遠赤色光補充長日状態がない場合でさえ[5、6]、変異タリは性的生殖器官（ガメタンジア）を発達させ、配偶子を産生した。miR529耐性MpSPL2導入遺伝子を発現するトランスジェニック植物も、誘導性の遠赤色光信号がない場合に、同様の生殖遷移の表現型を示しました。これらの変異体およびトランスジェニック植物では、MpSPL2mRNAの存在量が上昇しました。Mpspl2（ko）変異植物は、配偶子の発達と受精の成功を示しました。これは、MpSPL2がM. polymorphaの有性生殖に関与しているが、必須ではないことを示唆しています。さらに、Mpspl2（ko）変異体とその補完系統の分析は、MpSPL2が生殖移行の促進に役割を果たしている可能性があることを示唆しています。これらの調査結果は、肝虫の生殖発達への移行が血管精子のそれと同様のシステムによって制御され、miR156 / 529-SPLモジュールが多くの発達中の栄養から生殖への移行の制御において共通の重要性を持っているという概念を支持します肝虫を含む陸上植物。"]
[83,31355948,"plant","Lotus japonicus","CRISPR;Cas9;","3 types of leghemoglobins","New phytologist","CRISPR/Cas9 knockout of leghemoglobin genes in Lotus japonicus uncovers their synergistic roles in symbiotic nitrogen fixation.",2019,"224(2):818-832","[Wang L  et al.]","Huazhong Agricultural University, Wuhan, China.",31355948,"10.1111/nph.16077 ","Legume nodules contain high concentrations of leghemoglobins (Lbs) encoded by several genes. The reason for this multiplicity is unknown. CRISPR/Cas9 technology was used to generate stable mutants of the three Lbs of Lotus japonicus. The phenotypes were characterized at the physiological, biochemical and molecular levels. Nodules of the triple mutants were examined by electron microscopy and subjected to RNA-sequencing (RNA-seq) analysis. Complementation studies revealed that Lbs function synergistically to maintain optimal N2 fixation. The nodules of the triple mutants overproduced superoxide radicals and  hydrogen peroxide, which was probably linked to activation of NADPH oxidases and  changes in superoxide dismutase isoforms expression. The mutant nodules showed major ultrastructural alterations, including vacuolization, accumulation of poly-beta-hydroxybutyrate and disruption of mitochondria. RNA-seq of c. 20 000 genes revealed significant changes in expression of carbon and nitrogen metabolism genes, transcription factors, and proteinases. Lb-deficient nodules had c. 30-50-fold less heme but similar transcript levels of heme biosynthetic genes, suggesting a post-translational regulatory mechanism of heme synthesis. We conclude that Lbs act additively in nodules and that the lack of Lbs results in early nodule senescence. Our observations also provide insight into the reprogramming of the gene expression network associated with Lb deficiency, probably as a result of uncontrolled intracellular free O2 concentration.","Lotus japonicus","マメ科植物の根粒には、いくつかの遺伝子によってコードされる高濃度のレグヘモグロビン（Lbs）が含まれています。この多様性の理由は不明です。CRISPR / Cas9テクノロジーを使用して、Lotusjaponicusの3つのLbの安定した変異体を生成しました。表現型は、生理学的、生化学的および分子レベルで特徴づけられました。三重変異体の小結節を電子顕微鏡で調べ、RNAシーケンシング（RNA-seq）分析を行った。補完研究により、Lbsが相乗的に機能して最適なN2固定を維持することが明らかになりました。三重変異体の小結節は、スーパーオキシドラジカルと過酸化水素を過剰産生し、これはおそらくNADPHオキシダーゼの活性化とスーパーオキシドジスムターゼアイソフォーム発現の変化に関連していた。変異結節は、空胞化、ポリ-ベータ-ヒドロキシブチレートの蓄積およびミトコンドリアの破壊を含む主要な超構造的変化を示した。cのRNA-seq。20 000の遺伝子は、炭素および窒素代謝遺伝子、転写因子、およびプロテイナーゼの発現に有意な変化を示しました。Lb欠損結節はcを持っていた。ヘムは30〜50倍少ないが、ヘム生合成遺伝子の転写レベルは類似しており、ヘム合成の翻訳後の調節メカニズムを示唆している。Lbsは結節で相加的に作用し、Lbsの欠如は早期の結節老化をもたらすと結論します。私たちの観察はまた、おそらく制御されていない細胞内遊離O2濃度の結果として、Lb欠乏に関連する遺伝子発現ネットワークの再プログラミングへの洞察を提供します。"]
[84,31768113,"plant","Lotus japonicus, soybean Glycine max, common bean Phaseolus vulgaris","Agroinfiltration;","GFP","Plant biotechnology","Agroinfiltration-based efficient transient protein expression in leguminous plants.",2019,"36(2):119-123","[Suzaki T et al.]","University of Tsukuba, Tsukuba, Ibaraki, Japan.",31768113,"10.5511/plantbiotechnology.19.0220b ","Transient protein expression is an effective tool to rapidly unravel novel gene functions, such as transcriptional activity of promoters and sub-cellular localization of proteins. However, transient expression is not applicable to some species and varieties because of insufficient expression levels. We recently developed one of the strongest agroinfiltration-based transient protein expression systems for plant cells, termed 'Tsukuba system.' About 4 mg/g fresh weight of protein expression in Nicotiana benthamiana was obtained using this system. The vector pBYR2HS, which contains a geminiviral replication system and a double terminator, can be used in various plant species and varieties, including  lettuces, eggplants, tomatoes, hot peppers, and orchids. In this study, we assessed the applicability of the Tsukuba system to several species of legumes, including Lotus japonicus, soybean Glycine max, and common bean Phaseolus vulgaris. The GFP protein was transiently expressed in the seedpods of all examined legume species, however, protein expression in leaves was observed only  in P. vulgaris. Taken together, our system is an effective tool to examine gene function rapidly in several legume species based on transient protein expression.","Lotus japonicus, soybean Glycine max, common bean Phaseolus vulgaris","一過性のタンパク質発現は、プロモーターの転写活性やタンパク質の細胞内局在など、新しい遺伝子機能を迅速に解明するための効果的なツールです。ただし、一過性の発現は、発現レベルが不十分なため、一部の種や品種には適用できません。私たちは最近、「ツクバシステム」と呼ばれる、植物細胞のための最も強力なアグロインフィルトレーションベースの一過性タンパク質発現システムの1つを開発しました。このシステムを使用して、ニコチアナ・ベンタミアナにおけるタンパク質発現の約4mg / g新鮮重量が得られた。ジェミニウイルス複製システムとダブルターミネーターを含むベクターpBYR2HSは、レタス、ナス、トマト、唐辛子、ランなど、さまざまな植物種や品種で使用できます。この研究では、Lotus japonicus、大豆Glycine max、一般的な豆Phaseolus vulgarisなど、数種のマメ科植物へのツクバシステムの適用性を評価しました。GFPタンパク質は、調べたすべてのマメ科植物の種莢で一過性に発現しましたが、葉でのタンパク質発現はP.vulgarisでのみ観察されました。まとめると、私たちのシステムは、一過性のタンパク質発現に基づいて、いくつかのマメ科植物の遺伝子機能を迅速に調べるための効果的なツールです。"]
[85,31610539,"plant","maize","CRISPR;Cas9;","in situ specific repeats","Cytogenetic and genome research","CRISPR/Cas9-Based RGEN-ISL Allows the Simultaneous and Specific Visualization of  Proteins, DNA Repeats, and Sites of DNA Replication.",2019,"159(1):48-53","[Nemeckova A et al.]","Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK) Gatersleben, Seeland, Germany",31610539,"10.1159/000502600 ","Visualizing the spatiotemporal organization of the genome will improve our understanding of how chromatin structure and function are intertwined. Here, we describe a further development of the CRISPR/Cas9-based RNA-guided endonuclease-in situ labeling (RGEN-ISL) method. RGEN-ISL allowed the differentiation between vertebrate-type (TTAGGG)n and Arabidopsis-type (TTTAGGG)n telomere repeats. Using maize as an example, we established a combination of RGEN-ISL, immunostaining, and EdU labeling to visualize in situ specific repeats, histone marks, and DNA replication sites, respectively. The effects of the non-denaturing RGEN-ISL and standard denaturing FISH on the chromatin structure were compared using super-resolution microscopy. 3D structured illumination microscopy revealed that denaturation and acetic acid fixation impaired and flattened the chromatin. The broad range of adaptability of RGEN-ISL to different combinations of methods has the potential to advance the field of chromosome biology.","maize","ゲノムの時空間構成を視覚化することで、クロマチンの構造と機能がどのように絡み合っているかについての理解が深まります。ここでは、CRISPR / Cas9ベースのRNAガイドエンドヌクレアーゼ-insituラベリング（RGEN-ISL）メソッドのさらなる開発について説明します。RGEN-ISLにより、脊椎動物型（TTAGGG）nとシロイヌナズナ型（TTTAGGG）nのテロメアリピートを区別することができました。例としてトウモロコシを使用して、RGEN-ISL、免疫染色、およびEdU標識の組み合わせを確立し、それぞれin situ固有の繰り返し、ヒストンマーク、およびDNA複製部位を視覚化しました。クロマチン構造に対する非変性RGEN-ISLと標準変性FISHの効果を、超解像度顕微鏡を使用して比較しました。3D構造化照明顕微鏡法は、変性と酢酸固定がクロマチンを損ない、平らにすることを明らかにしました。さまざまな方法の組み合わせに対するRGEN-ISLの幅広い適応性は、染色体生物学の分野を前進させる可能性を秘めています。"]
[86,30839161,"plant","maize","CRISPR;","dek42","Journal of integrative plant biology","Dek42 encodes an RNA-binding protein that affects alternative pre-mRNA splicing and maize kernel development.",2019,"61(6):728-748","[Zuo Y et al.]","China Agricultural University, Beijing, China.",30839161,"10.1111/jipb.12798 ","RNA-binding proteins (RBPs) play an important role in post-transcriptional gene regulation. However, the functions of RBPs in plants remain poorly understood. Maize kernel mutant dek42 has small defective kernels and lethal seedlings. Dek42 was cloned by Mutator tag isolation and further confirmed by an independent mutant allele and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 materials. Dek42 encodes an RRM_RBM48 type RNA-binding protein that localizes to the nucleus. Dek42 is constitutively expressed in various maize tissues. The dek42 mutation caused a significant reduction in the accumulation of DEK42 protein in mutant kernels. RNA-seq analysis showed that the dek42 mutation significantly disturbed the expression of thousands of genes during maize kernel development. Sequence analysis also showed that the dek42 mutation significantly changed alternative splicing in expressed genes, which were especially enriched for the U12-type intron-retained type. Yeast two-hybrid screening identified SF3a1 as a DEK42-interacting protein. DEK42 also interacts with the spliceosome component U1-70K. These results suggested that DEK42 participates in the regulation of pre-messenger RNA splicing through its interaction with other spliceosome components. This study showed the function of a newly identified RBP and provided insights into alternative splicing regulation during maize kernel development.","maize","RNA結合タンパク質（RBP）は、転写後の遺伝子調節において重要な役割を果たします。ただし、植物のRBPの機能はよくわかっていないままです。トウモロコシの穀粒変異体dek42には、小さな欠陥のある穀粒と致命的な苗木があります。Dek42は、ミューテータータグの分離によってクローン化され、独立したミュータントアレルによってさらに確認され、規則的に間隔を空けて配置された短いパリンドロームリピート（CRISPR）-CRISPR関連タンパク質9材料がクラスター化されました。Dek42は、核に局在するRRM_RBM48タイプのRNA結合タンパク質をコードします。Dek42は、さまざまなトウモロコシ組織で構成的に発現しています。dek42変異は、変異体カーネルにおけるDEK42タンパク質の蓄積の有意な減少を引き起こしました。RNA-seq分析は、dek42変異が、トウモロコシの穀粒の発達中に何千もの遺伝子の発現を著しく妨害することを示しました。配列分析はまた、dek42変異が、発現した遺伝子の代替スプライシングを有意に変化させたことを示しました。これは、U12タイプのイントロン保持タイプで特に濃縮されていました。酵母ツーハイブリッドスクリーニングにより、SF3a1がDEK42相互作用タンパク質として同定されました。DEK42は、スプライスソームコンポーネントU1-70Kとも相互作用します。これらの結果は、DEK42が他のスプライスソーム成分との相互作用を介してプレメッセンジャーRNAスプライシングの調節に関与していることを示唆しています。この研究は、新たに同定されたRBPの機能を示し、トウモロコシの穀粒開発中の選択的スプライシング調節への洞察を提供しました。"]
[87,30902686,"plant","maize","CRISPR;Cas9;"," ","Molecular plant","Development of a Haploid-Inducer Mediated Genome Editing System for Accelerating  Maize Breeding.",2019,"12(4):597-602","[Wang B et al.]","Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, China.",30902686,"10.1016/j.molp.2019.03.006 ","Crop breeding aims to generate pure inbred lines with multiple desired traits. Doubled haploid (DH) and genome editing using CRISPR/Cas9 are two powerful game-changing technologies in crop breeding. However, both of them still fall short for rapid generation of pure elite lines with integrated favorable traits.  Here, we report the development of a Haploid-Inducer Mediated Genome Editing (IMGE) approach, which utilizes a maize haploid inducer line carrying a CRISPR/Cas9 cassette targeting for a desired agronomic trait to pollinate an elite maize inbred line and to generate genome-edited haploids in the elite maize background. Homozygous pure DH lines with the desired trait improvement could be  generated within two generations, thus bypassing the lengthy procedure of repeated crossing and backcrossing used in conventional breeding for integrating  a desirable trait into elite commercial backgrounds.","maize","作物育種は、複数の望ましい特性を持つ純粋な同系交配系統を生成することを目的としています。CRISPR / Cas9を使用した倍加半数体（DH）とゲノム編集は、作物育種における2つの強力な画期的な技術です。しかし、どちらも、統合された好ましい特性を備えた純粋なエリートラインを迅速に生成するにはまだ不十分です。ここでは、Haploid-Inducer Mediated Genome Editing（IMGE）アプローチの開発について報告します。これは、CRISPR / Cas9カセットを搭載したトウモロコシの半数体インデューサーラインを利用して、エリートトウモロコシ近交系を汚染し、ゲノムを生成します。エリートトウモロコシの背景で編集された半数体。望ましい形質の改善を伴うホモ接合性の純粋なDH系統は、2世代以内に生成でき、したがって、望ましい形質をエリートの商業的背景に統合するための従来の育種で使用される反復交配および戻し交配の長い手順をバイパスできます。"]
[88,31182848,"plant","maize","CRISPR;Cas9;","ZmDMP","Nature plants","Mutation of ZmDMP enhances haploid induction in maize.",2019,"5(6):575-580","[Zhong Y  et al.]","China Agricultural University, Beijing, China.",31182848,"10.1038/s41477-019-0443-7 ","Doubled haploid (DH) breeding based on in vivo haploid induction has led to a new approach for maize breeding(1). All modern haploid inducers used in DH breeding are derived from the haploid inducer line Stock6. Two key quantitative trait loci, qhir1 and qhir8, lead to high-frequency haploid induction(2). Mutation of the gene MTL/ZmPLA1/NLD in qhir1 could generate a ~2% haploid induction rate (HIR)(3-5); nevertheless, this mutation is insufficient for modern haploid inducers whose average HIR is ~10%(6). Therefore, cloning of the gene underlying  qhir8 is important for illuminating the genetic basis of haploid induction. Here, we present the discovery that mutation of a non-Stock6-originating gene in qhir8, namely, ZmDMP, enhances and triggers haploid induction. ZmDMP was identified by map-based cloning and further verified by CRISPR-Cas9-mediated knockout experiments. A single-nucleotide change in ZmDMP leads to a 2-3-fold increase in  the HIR. ZmDMP knockout triggered haploid induction with a HIR of 0.1-0.3% and exhibited a greater ability to increase the HIR by 5-6-fold in the presence of mtl/zmpla1/nld. ZmDMP was highly expressed during the late stage of pollen development and localized to the plasma membrane. These findings provide important approaches for studying the molecular mechanism of haploid induction and improving DH breeding efficiency in maize.","maize","インビボ半数体誘導に基づく倍加半数体（DH）育種は、トウモロコシ育種のための新しいアプローチをもたらしました（1）。DH育種で使用されるすべての最新の半数体誘導物質は、半数体誘導物質系統Stock6に由来します。2つの重要な量的形質遺伝子座qhir1とqhir8は、高頻度の半数体誘導を引き起こします（2）。qhir1の遺伝子MTL / ZmPLA1 / NLDの変異は、約2％の一倍体誘導率（HIR）を生成する可能性があります（3-5）。それにもかかわらず、この突然変異は、平均HIRが約10％である現代の半数体誘導物質には不十分です（6）。したがって、qhir8の基礎となる遺伝子のクローニングは、半数体誘導の遺伝的基礎を明らかにするために重要です。ここでは、qhir8の非Stock6由来遺伝子、すなわちZmDMPの変異が、半数体誘導を増強および誘発するという発見を提示します。ZmDMPは、マップベースのクローニングによって識別され、CRISPR-Cas9を介したノックアウト実験によってさらに検証されました。ZmDMPの単一ヌクレオチドの変更により、HIRが2〜3倍に増加します。ZmDMPノックアウトは、0.1〜0.3％のHIRで半数体誘導を引き起こし、mtl / zmpla1 / nldの存在下でHIRを5〜6倍増加させる大きな能力を示しました。ZmDMPは花粉発生の後期に高度に発現し、原形質膜に局在しました。これらの発見は、半数体誘導の分子メカニズムを研究し、トウモロコシのDH育種効率を改善するための重要なアプローチを提供します。"]
[89,29972722,"plant","maize","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;Cpf1;","glossy2","Plant biotechnology journal","Activities and specificities of CRISPR/Cas9 and Cas12a nucleases for targeted mutagenesis in maize.",2019,"17(2):362-372","[Lee K et al.]","Iowa State University, Ames, IA, USA.",29972722,"10.1111/pbi.12982 ","CRISPR/Cas9 and Cas12a (Cpf1) nucleases are two of the most powerful genome editing tools in plants. In this work, we compared their activities by targeting  maize glossy2 gene coding region that has overlapping sequences recognized by both nucleases. We introduced constructs carrying SpCas9-guide RNA (gRNA) and LbCas12a-CRISPR RNA (crRNA) into maize inbred B104 embryos using Agrobacterium-mediated transformation. On-target mutation analysis showed that 90%-100% of the Cas9-edited T0 plants carried indel mutations and 63%-77% of them were homozygous or biallelic mutants. In contrast, 0%-60% of Cas12a-edited T0 plants had on-target mutations. We then conducted CIRCLE-seq analysis to identify genome-wide potential off-target sites for Cas9. A total of 18 and 67 potential off-targets were identified for the two gRNAs, respectively, with an average of five mismatches compared to the target sites. Sequencing analysis of a selected subset of the off-target sites revealed no detectable level of mutations in the T1 plants, which constitutively express Cas9 nuclease and gRNAs. In conclusion, our results suggest that the CRISPR/Cas9 system used in this study is highly efficient and specific for genome editing in maize, while CRISPR/Cas12a needs further optimization for improved editing efficiency.","maize","CRISPR / Cas9およびCas12a（Cpf1）ヌクレアーゼは、植物で最も強力なゲノム編集ツールの2つです。この作業では、両方のヌクレアーゼによって認識される重複する配列を持つトウモロコシのglossy2遺伝子コーディング領域をターゲットにして、それらの活動を比較しました。SpCas9ガイドRNA（gRNA）とLbCas12a-CRISPR RNA（crRNA）を運ぶコンストラクトを、アグロバクテリウムを介した形質転換を使用してトウモロコシ近交系B104胚に導入しました。オンターゲット突然変異分析は、Cas9で編集されたT0植物の90％-100％がインデル突然変異を運び、それらの63％-77％がホモ接合または二対立遺伝子突然変異体であることを示しました。対照的に、Cas12aで編集されたT0植物の0％-60％は、標的に変異がありました。次に、CIRCLE-seq分析を実施して、Cas9のゲノム全体の潜在的なオフターゲットサイトを特定しました。合計18と67の潜在的なオフターゲットが2つのgRNAでそれぞれ特定され、ターゲットサイトと比較して平均5つのミスマッチがありました。オフターゲットサイトの選択されたサブセットのシーケンス分析では、Cas9ヌクレアーゼとgRNAを構成的に発現するT1植物に検出可能なレベルの変異は見られませんでした。結論として、我々の結果は、この研究で使用されたCRISPR / Cas9システムは非常に効率的で、トウモロコシのゲノム編集に特異的であるが、CRISPR / Cas12aは編集効率を改善するためにさらに最適化する必要があることを示唆しています。"]
[90,30684023,"plant","maize","CRISPR;Cas9;","20 genes","Plant cell reports","Single and multiple gene knockouts by CRISPR-Cas9 in maize.",2019,"38(4):487-501","[Doll NM et al.]","Univ Lyon, ENS de Lyon, UCB Lyon 1, CNRS, INRA, Lyon, France.",30684023,"10.1007/s00299-019-02378-1 ","KEY MESSAGE: The analysis of 93 mutant alleles in 18 genes demonstrated that CRISPR-Cas9 is a robust tool for targeted mutagenesis in maize, permitting efficient generation of single and multiple knockouts. CRISPR-Cas9 technology is  a simple and efficient tool for targeted mutagenesis of the genome. It has been implemented in many plant species, including crops such as maize. Here we report  single- and multiple-gene mutagenesis via stably transformed maize plants. Two different CRISPR-Cas9 vectors were used allowing the expression of multiple guide RNAs and different strategies to knockout either independent or paralogous genes. A total of 12 plasmids, representing 28 different single guide RNAs (sgRNAs), were generated to target 20 genes. For 18 of these genes, at least one mutant allele was obtained, while two genes were recalcitrant to sequence editing. 19% (16/83) of mutant plants showed biallelic mutations. Small insertions or deletions of less than ten nucleotides were most frequently observed, regardless  of whether the gene was targeted by one or more sgRNAs. Deletions of defined regions located between the target sites of two guide RNAs were also reported although the exact deletion size was variable. Double and triple mutants were created in a single step, which is especially valuable for functional analysis of genes with strong genetic linkage. Off-target effects were theoretically limited  due to rigorous sgRNA design and random experimental checks at three potential off-target sites did not reveal any editing. Sanger chromatograms allowed to unambiguously class the primary transformants; the majority (85%) were fully edited plants transmitting systematically all detected mutations to the next generation, generally following Mendelian segregation.","maize","重要なメッセージ：18遺伝子の93の変異対立遺伝子の分析は、CRISPR-Cas9がトウモロコシの標的変異誘発のための強力なツールであり、単一および複数のノックアウトの効率的な生成を可能にすることを示しました。CRISPR-Cas9テクノロジーは、ゲノムの標的突然変異誘発のためのシンプルで効率的なツールです。トウモロコシなどの作物を含む多くの植物種に導入されています。ここでは、安定して形質転換されたトウモロコシ植物を介した単一遺伝子および複数遺伝子の突然変異誘発について報告します。2つの異なるCRISPR-Cas9ベクターを使用して、複数のガイドRNAの発現と、独立した遺伝子またはパラロガスな遺伝子をノックアウトするための異なる戦略を可能にしました。20個の遺伝子をターゲットにするために、28個の異なるシングルガイドRNA（sgRNA）を表す合計12個のプラスミドが生成されました。これらの遺伝子のうち18個については、少なくとも1つの変異対立遺伝子が得られましたが、2つの遺伝子は配列編集に抵抗していました。変異植物の19％（16/83）が二対立遺伝子変異を示した。遺伝子が1つまたは複数のsgRNAの標的であるかどうかに関係なく、10ヌクレオチド未満の小さな挿入または削除が最も頻繁に観察されました。正確な欠失サイズは変動しましたが、2つのガイドRNAの標的部位の間に位置する定義された領域の欠失も報告されました。二重および三重変異体は単一のステップで作成されました。これは、強力な遺伝的連鎖を持つ遺伝子の機能分析に特に価値があります。厳密なsgRNA設計のため、オフターゲット効果は理論的に制限されており、3つの潜在的なオフターゲットサイトでのランダムな実験チェックでは編集は明らかになりませんでした。サンガークロマトグラムは、一次形質転換体を明確に分類することを可能にしました。大多数（85％）は完全に編集された植物であり、検出されたすべての変異を体系的に次世代に伝達し、一般的にはメンデルの分離に続いています。"]
[91,31350363,"plant","maize","CRISPR;Cas9;","Zmpif3; Zmpif4; Zmpif5","Plant physiology","Characterization of Maize Phytochrome-Interacting Factors in Light Signaling and  Photomorphogenesis.",2019,"181(2):789-803","[Wu G et al.]","Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, China.",31350363,"10.1104/pp.19.00239 ","Increasing planting density has been an effective means of increasing maize (Zea  mays ssp. mays) yield per unit of land area over the past few decades. However, high-density planting will cause a reduction in the ratio of red to far-red incident light, which could trigger the shade avoidance syndrome and reduce yield. The molecular mechanisms regulating the shade avoidance syndrome are well  established in Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) but poorly understood in maize. Here, we conducted an initial functional characterization of the maize Phytochrome-Interacting Factor (PIF) gene family in regulating light signaling and photomorphogenesis. The maize genome contains seven distinct PIF genes, which could be grouped into three subfamilies: ZmPIF3s, ZmPIF4s, and ZmPIF5s Similar to the Arabidopsis PIFs, all ZmPIF proteins are exclusively localized to the nucleus and most of them can form nuclear bodies upon light irradiation. We show that all of the ZmPIF proteins could interact with ZmphyB. Heterologous expression of each ZmPIF member could partially or fully rescue the phenotype of the Arabidopsis pifq mutant, and some of these proteins conferred enhanced shade avoidance syndrome in Arabidopsis. Interestingly, all ZmPIF proteins expressed in Arabidopsis are much more stable than their Arabidopsis counterparts upon exposure to red light. Moreover, the Zmpif3, Zmpif4, and Zmpif5 knockout mutants  generated via CRISPR/Cas9 technology all showed severely suppressed mesocotyl elongation in dark-grown seedlings and were less responsive to simulated shade treatment. Taken together, our results reveal both conserved and distinct molecular properties of ZmPIFs in regulating light signaling and photomorphogenesis in maize.","maize","植栽密度の増加は、過去数十年にわたって土地面積の単位あたりのトウモロコシ（Zea maysssp。mays）の収量を増加させる効果的な手段でした。ただし、高密度の植栽は、赤と遠赤の入射光の比率を低下させ、日陰回避症候群を引き起こし、収量を低下させる可能性があります。日陰回避症候群を調節する分子メカニズムは、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）で十分に確立されていますが、トウモロコシではあまり理解されていません。ここでは、光シグナル伝達と光形態形成の調節におけるトウモロコシのフィトクローム相互作用因子（PIF）遺伝子ファミリーの初期機能特性評価を実施しました。トウモロコシのゲノムには7つの異なるPIF遺伝子が含まれており、ZmPIF3、ZmPIF4、ZmPIF5の3つのサブファミリーに分類できます。シロイヌナズナのPIFと同様に、すべてのZmPIFタンパク質は核にのみ局在し、それらのほとんどは光照射により核体を形成します。すべてのZmPIFタンパク質がZmphyBと相互作用できることを示します。各ZmPIFメンバーの異種発現は、Arabidopsis pifq変異体の表現型を部分的または完全に救済する可能性があり、これらのタンパク質のいくつかは、Arabidopsisに強化された日陰回避症候群をもたらしました。興味深いことに、シロイヌナズナで発現するすべてのZmPIFタンパク質は、赤色光にさらされたときに、対応するシロイヌナズナよりもはるかに安定しています。さらに、CRISPR / Cas9テクノロジーを介して生成されたZmpif3、Zmpif4、およびZmpif5ノックアウト変異体はすべて、暗所で育てられた苗木でメソコチルの伸長が大幅に抑制され、シミュレートされた日陰処理に対する反応が鈍かった。まとめると、我々の結果は、トウモロコシの光シグナル伝達と光形態形成の調節におけるZmPIFの保存された明確な分子特性の両方を明らかにしています。"]
[92,31397626,"plant","maize","CRISPR;Cas9;","ACCELERATED CELL DEATH6 (ZmACD6)","Plant signaling & behavior","Identification and characterization of maize ACD6-like gene reveal ZmACD6 as the  maize orthologue conferring resistance to Ustilago maydis.",2019,"14(10):e1651604","[Zhang Z  et al.]","Agricultural University of Hebei, Baoding, China.",31397626,"10.1080/15592324.2019.1651604 ","Enhancing broad-spectrum resistance is a major goal of crop breeding. However, broad-spectrum resistance has not been thoroughly investigated, and its underlying molecular mechanisms remain elusive. In the model plant Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), ACCELERATED CELL DEATH6 (ACD6) is a key component of broad-spectrum resistance that acts in a positive feedback loop with salicylic acid (SA) to regulate multiple pattern recognition receptors. However, the role of ACD6 in disease resistance in crop plants is unclear. Here, we show that the transcript of ANK23, one of the 15 ACD6-like genes in maize (Zea mays), is induced by SA and by infection with the pathogenic fungus Ustilago maydis. Heterologous expression of ANK23 restored disease resistance in the Arabidopsis mutant acd6-2. We show that ANK23 is a maize ortholog of ACD6 and therefore rename ANK23 as ZmACD6. Furthermore, using CRISPR/Cas9, we generated ZmACD6 knockout maize plants, which are more susceptible to U. maydis than wild-type plants. We also identified a maize line (SC-9) with relatively high ZmACD6 expression levels from a diverse natural maize population. SC-9 has increased disease resistance to U. maydis and defense activation, suggesting a practical approach to cultivate elite varieties with enhanced disease resistance.","maize","広域耐性の強化は、作物育種の主要な目標です。ただし、広域スペクトル耐性は徹底的に調査されておらず、その根底にある分子メカニズムはとらえどころのないままです。モデル植物Arabidopsis（Arabidopsis thaliana）では、ACCELERATED CELL DEATH6（ACD6）は、サリチル酸（SA）との正のフィードバックループで作用して複数のパターン認識受容体を調節する広域スペクトル耐性の重要な要素です。ただし、作物植物の耐病性におけるACD6の役割は不明です。ここでは、トウモロコシ（Zea mays）の15のACD6様遺伝子の1つであるANK23の転写産物が、SAおよび病原性真菌Ustilagomaydisの感染によって誘導されることを示します。ANK23の異種発現により、アラビドプシス変異体acd6-2の耐病性が回復しました。ANK23がACD6のトウモロコシオルソログであるため、ANK23の名前をZmACD6に変更することを示します。さらに、CRISPR / Cas9を使用して、野生型植物よりもU.maydisの影響を受けやすいZmACD6ノックアウトトウモロコシ植物を生成しました。また、多様な天然トウモロコシ集団から比較的高いZmACD6発現レベルを持つトウモロコシ系統（SC-9）を特定しました。SC-9は、U。maydisに対する耐病性と防御活性化を高めており、耐病性が強化されたエリート品種を栽培するための実用的なアプローチを示唆しています。"]
[93,31925225,"plant","Zea mays","CRISPR;Cas9;Cpf1;"," ","Communications biology","The repurposing of type I-E CRISPR-Cascade for gene activation in plants.",2019,"2(1):383","[Young JK et al.]","Corteva Agriscience, Johnston, IA, USA.",31925225,"10.1038/s42003-019-0637-6 ","CRISPR-Cas systems are robust and facile tools for manipulating the genome, epigenome and transcriptome of eukaryotic organisms. Most groups use class 2 effectors, such as Cas9 and Cas12a, however, other CRISPR-Cas systems may provide unique opportunities for genome engineering. Indeed, the multi-subunit composition of class 1 systems offers to expand the number of domains and functionalities that may be recruited to a genomic target. Here we report DNA targeting in Zea mays using a class 1 type I-E CRISPR-Cas system from S. thermophilus. First, we engineer its Cascade complex to modulate gene expression  by tethering a plant transcriptional activation domain to 3 different subunits. Next, using an immunofluorescent assay, we confirm Cascade cellular complex formation and observe enhanced gene activation when multiple subunits tagged with the transcriptional activator are combined. Finally, we examine Cascade mediated  gene activation at chromosomal DNA targets by reprogramming Zea mays cells to change color.","maize","CRISPR-Casシステムは、真核生物のゲノム、エピゲノム、トランスクリプトームを操作するための堅牢で簡単なツールです。ほとんどのグループはCas9やCas12aなどのクラス2エフェクターを使用していますが、他のCRISPR-Casシステムはゲノムエンジニアリングに独自の機会を提供する可能性があります。実際、クラス1システムのマルチサブユニット構成は、ゲノムターゲットに採用される可能性のあるドメインと機能の数を拡大することを提供します。ここでは、S.thermophilusのクラス1タイプIECRISPR-Casシステムを使用したZeamaysでのDNAターゲティングについて報告します。まず、植物の転写活性化ドメインを3つの異なるサブユニットにつなぐことにより、遺伝子発現を調節するようにカスケード複合体を設計します。次に、免疫蛍光アッセイを使用して、カスケード細胞複合体形成を確認し、転写活性化因子でタグ付けされた複数のサブユニットが組み合わされたときに増強された遺伝子活性化を観察します。最後に、Zea mays細胞を再プログラミングして色を変えることにより、染色体DNAターゲットでのカスケード媒介遺伝子活性化を調べます。"]
[94,30996077,"plant","maize (Zea mays)","CRISPR;","closed stomata1","Plant cell","A Subsidiary Cell-Localized Glucose Transporter Promotes Stomatal Conductance and Photosynthesis.",2019,"31(6):1328-1343","[Wang H  et al.]","Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, China.",30996077,"10.1105/tpc.18.00736 ","It has long been recognized that stomatal movement modulates CO2 availability and as a consequence the photosynthetic rate of plants, and that this process is feedback-regulated by photoassimilates. However, the genetic components and mechanisms underlying this regulatory loop remain poorly understood, especially in monocot crop species. Here, we report the cloning and functional characterization of a maize (Zea mays) mutant named closed stomata1 (cst1). Map-based cloning of cst1 followed by confirmation with the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ CRISPR associated protein 9 system identified the causal mutation in a Clade I Sugars Will Eventually be Exported Transporters (SWEET) family gene, which leads to the E81K mutation in the CST1 protein. CST1 encodes a functional glucose transporter expressed in subsidiary cells, and the E81K mutation strongly impairs the oligomerization and  glucose transporter activity of CST1. Mutation of CST1 results in reduced stomatal opening, carbon starvation, and early senescence in leaves, suggesting that CST1 functions as a positive regulator of stomatal opening. Moreover, CST1 expression is induced by carbon starvation and suppressed by photoassimilate accumulation. Our study thus defines CST1 as a missing link in the feedback-regulation of stomatal movement and photosynthesis by photoassimilates in maize.","maize (Zea mays)","気孔の動きがCO2の利用可能性を調節し、その結果、植物の光合成速度を調節し、このプロセスが光同化物によってフィードバック調節されることが長い間認識されてきました。ただし、この規制ループの根底にある遺伝的要素とメカニズムは、特にモノコット作物種では、十分に理解されていないままです。ここでは、closed stomata1（cst1）という名前のトウモロコシ（Zea mays）変異体のクローニングと機能特性を報告します。cst1のマップベースのクローニングと、それに続くクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9システムによる確認により、クレードI糖が最終的に輸出トランスポーター（SWEET）ファミリー遺伝子の原因となる変異が特定されました。 CST1タンパク質のE81K変異。CST1は、補助細胞で発現する機能的なグルコーストランスポーターをコードしており、E81K変異は、CST1のオリゴマー化とグルコーストランスポーター活性を強く損ないます。CST1の変異は、気孔開口の減少、炭素欠乏、および葉の早期老化をもたらし、CST1が気孔開口の正の調節因子として機能することを示唆している。さらに、CST1の発現は炭素欠乏によって誘発され、光同化物の蓄積によって抑制されます。したがって、私たちの研究では、CST1を、トウモロコシの光同化物による気孔の動きと光合成のフィードバック調節における欠落したリンクとして定義しています。"]
[95,31558579,"plant","maize (Zea mays)","CRISPR;Cas9;","morphogenic regulator","Plant physiology","A Novel Ternary Vector System United with Morphogenic Genes Enhances CRISPR/Cas Delivery in Maize.",2019,"181(4):1441-1448","[Zhang Q et al.]","China Agricultural University, Beijing, China.",31558579,"10.1104/pp.19.00767 ","The lack of efficient delivery methods is a major barrier to clustered regularly  interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein (CRISPR/Cas)-mediated genome editing in many plant species. Combinations of morphogenic regulator (MR) genes and ternary vector systems are promising solutions to this problem. In this study, we first demonstrated that MR vectors greatly enhance maize (Zea mays) transformation. We then tested a CRISPR/Cas9 MR  vector in maize and found that the MR and CRISPR/Cas9 modules have no negative influence on each other. Finally, we developed a novel ternary vector system to integrate the MR and CRISPR/Cas modules. Our ternary vector system is composed of new pGreen-like binary vectors, here named pGreen3, and a pVS1-based virulence helper plasmid, which also functions as a replication helper for the pGreen3 vectors in Agrobacterium tumefaciens The pGreen3 vectors were derived from the plasmid pRK2 and display advantages over pGreen2 vectors regarding both compatibility and stability. We demonstrated that the union of our ternary vector system with MR gene modules has additive effects in enhancing maize transformation and that this enhancement is especially evident in the transformation of recalcitrant maize inbred lines. Collectively, our ternary vector system-based tools provide a user-friendly solution to the low efficiency  of CRISPR/Cas delivery in maize and represent a basic platform for developing efficient delivery tools to use in other plant species recalcitrant to transformation.","maize (Zea mays)","効率的な配信方法の欠如は、多くの植物種において、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート/ CRISPR関連タンパク質（CRISPR / Cas）を介したゲノム編集に対する主要な障壁です。形態形成調節因子（MR）遺伝子と三元ベクターシステムの組み合わせは、この問題に対する有望な解決策です。この研究では、MRベクターがトウモロコシ（Zea mays）の形質転換を大幅に強化することを最初に示しました。次に、トウモロコシでCRISPR / Cas9 MRベクターをテストしたところ、MRモジュールとCRISPR / Cas9モジュールが互いに悪影響を及ぼさないことがわかりました。最後に、MRモジュールとCRISPR / Casモジュールを統合するための新しい3値ベクトルシステムを開発しました。私たちの三元ベクターシステムは、ここではpGreen3と呼ばれる新しいpGreenのようなバイナリベクターと、AgrobacteriumtumefaciensのpGreen3ベクターの複製ヘルパーとしても機能するpVS1ベースの病原性ヘルパープラスミドで構成されています。pGreen3ベクターはプラスミドpRK2から派生しました。互換性と安定性の両方に関して、pGreen2ベクトルよりも優れています。三元ベクターシステムとMR遺伝子モジュールの結合は、トウモロコシの形質転換を促進する上で相加効果があり、この増強は、扱いにくいトウモロコシ近交系の形質転換において特に明白であることを示しました。まとめると、当社の三元ベクトルシステムベースのツールは、トウモロコシでのCRISPR / Cas配信の低効率に対するユーザーフレンドリーなソリューションを提供し、変換に抵抗する他の植物種で使用する効率的な配信ツールを開発するための基本的なプラットフォームを表します。"]
[96,31768497,"plant","maize; Setaria viridis; Nicotiana benthamiana","Cas9;","N. benthamiana Phytoene desaturase gene, S. viridis Carbonic anhydrase 2 gene, and maize HKT1 gene","Plant direct","Protein expression and gene editing in monocots using foxtail mosaic virus vectors.",2019,"3(11):e00181","[Mei Y et al.]","Iowa State University, Ames, IA, USA.",31768497,"10.1002/pld3.181 ","Plant viruses can be engineered to carry sequences that direct silencing of target host genes, expression of heterologous proteins, or editing of host genes. A set of foxtail mosaic virus (FoMV) vectors was developed that can be used for transient gene expression and single guide RNA delivery for Cas9-mediated gene editing in maize, Setaria viridis, and Nicotiana benthamiana. This was accomplished by duplicating the FoMV capsid protein subgenomic promoter, abolishing the unnecessary open reading frame 5A, and inserting a cloning site containing unique restriction endonuclease cleavage sites immediately after the duplicated promoter. The modified FoMV vectors transiently expressed green fluorescent protein (GFP) and bialaphos resistance (BAR) protein in leaves of systemically infected maize seedlings. GFP was detected in epidermal and mesophyll cells by epifluorescence microscopy, and expression was confirmed by Western blot analyses. Plants infected with FoMV carrying the bar gene were temporarily protected from a glufosinate herbicide, and expression was confirmed  using a rapid antibody-based BAR strip test. Expression of these proteins was stabilized by nucleotide substitutions in the sequence of the duplicated promoter region. Single guide RNAs expressed from the duplicated promoter mediated edits in the N. benthamiana Phytoene desaturase gene, the S. viridis Carbonic anhydrase 2 gene, and the maize HKT1 gene encoding a potassium transporter. The efficiency  of editing was enhanced in the presence of synergistic viruses and a viral silencing suppressor. This work expands the utility of FoMV for virus-induced gene silencing (VIGS), virus-mediated overexpression (VOX), and virus-enabled gene editing (VEdGE) in monocots.","maize; Setaria viridis; Nicotiana benthamiana","植物ウイルスは、標的宿主遺伝子のサイレンシング、異種タンパク質の発現、または宿主遺伝子の編集を指示する配列を運ぶように設計することができます。フォックステールモザイクウイルス（FoMV）ベクターのセットが開発されました。これは、トウモロコシ、Setaria viridis、およびNicotianabenthamianaでのCas9を介した遺伝子編集のための一過性遺伝子発現およびシングルガイドRNAデリバリーに使用できます。これは、FoMVキャプシドタンパク質サブゲノムプロモーターを複製し、不要なオープンリーディングフレーム5Aを廃止し、複製されたプロモーターの直後に固有の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含むクローニング部位を挿入することによって達成されました。改変されたFoMVベクターは、全身感染したトウモロコシの苗葉において、緑色蛍光タンパク質（GFP）およびビアラホス耐性（BAR）タンパク質を一時的に発現しました。GFPは、落射蛍光顕微鏡法によって表皮細胞と葉肉細胞で検出され、発現はウエスタンブロット分析によって確認されました。bar遺伝子を持つFoMVに感染した植物は、グルフォシン酸除草剤から一時的に保護され、迅速な抗体ベースのBARストリップテストを使用して発現が確認されました。これらのタンパク質の発現は、複製されたプロモーター領域の配列におけるヌクレオチド置換によって安定化された。N.ベンタミアナフィトエンデサチュラーゼ遺伝子、S。viridis炭酸アンヒドラーゼ2遺伝子、およびカリウムトランスポーターをコードするトウモロコシHKT1遺伝子の編集を介した複製プロモーターから発現されたシングルガイドRNA。編集の効率は、相乗的ウイルスとウイルスサイレンシングサプレッサーの存在下で強化されました。この作業は、モノコットでのウイルス誘発性遺伝子サイレンシング（VIGS）、ウイルス媒介性過剰発現（VOX）、およびウイルス対応遺伝子編集（VEdGE）に対するFoMVの有用性を拡張します。"]
[97,31495052,"plant","apple (Malus x domestica)","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","MdDIPM4","Plant biotechnology journal","Reduced fire blight susceptibility in apple cultivars using a high-efficiency CRISPR/Cas9-FLP/FRT-based gene editing system.",2019,null,"[Pompili V  et al.]","Fondazione Edmund Mach, San Michele all'Adige, Italy.",31495052,"10.1111/pbi.13253 ","The bacterium Erwinia amylovora, the causal agent of fire blight disease in apple, triggers its infection through the DspA/E effector which interacts with the apple susceptibility protein MdDIPM4. In this work, MdDIPM4 knockout has been produced in two Malus x domestica susceptible cultivars using the CRISPR/Cas9 system delivered via Agrobacterium tumefaciens. Fifty-seven transgenic lines were screened to identify CRISPR/Cas9-induced mutations. An editing efficiency of 75%  was obtained. Seven edited lines with a loss-of-function mutation were inoculated with the pathogen. Highly significant reduction in susceptibility was observed compared to control plants. Sequencing of five potential off-target sites revealed no mutation event. Moreover, our construct contained a heat-shock inducible FLP/FRT recombination system designed specifically to remove the T-DNA  harbouring the expression cassettes for CRISPR/Cas9, the marker gene and the FLP  itself. Six plant lines with reduced susceptibility to the pathogen were heat-treated and screened by real-time PCR to quantify the exogenous DNA elimination. The T-DNA removal was further validated by sequencing in one plant line. To our knowledge, this work demonstrates for the first time the development and application of a CRISPR/Cas9-FLP/FRT gene editing system for the production of edited apple plants carrying a minimal trace of exogenous DNA.","Malus x domestica","リンゴの火傷病の原因菌である細菌Erwiniaamylovoraは、リンゴ感受性タンパク質MdDIPM4と相互作用するDspA / Eエフェクターを介して感染を引き起こします。この作業では、MdDIPM4ノックアウトは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介して提供されるCRISPR / Cas9システムを使用して、2つのMalusxdomestica感受性品種で生産されました。CRISPR / Cas9によって誘発された変異を特定するために、57のトランスジェニック系統がスクリーニングされました。75％の編集効率が得られました。機能喪失変異を有する7つの編集された系統に病原体を接種した。対照植物と比較して、感受性の非常に有意な減少が観察された。5つの潜在的なオフターゲットサイトのシーケンスでは、変異イベントは見られませんでした。さらに、私たちのコンストラクトには、CRISPR / Cas9の発現カセット、マーカー遺伝子、およびFLP自体を含むT-DNAを除去するために特別に設計された熱ショック誘導性FLP / FRT組換えシステムが含まれていました。病原体に対する感受性が低下した6つの植物系統を熱処理し、リアルタイムPCRでスクリーニングして、外因性DNAの除去を定量化しました。T-DNAの除去は、1つの植物系統での配列決定によってさらに検証されました。私たちの知る限り、この研究は、最小限の外因性DNAを運ぶ編集されたリンゴ植物の生産のためのCRISPR / Cas9-FLP / FRT遺伝子編集システムの開発と応用を初めて示しています。"]
[98,31379911,"plant","Marchantia polymorpha","CRISPR;Cas9;","MpATG8","Frontiers in plant science","Marchantia polymorpha, a New Model Plant for Autophagy Studies.",2019,"10:935","[Norizuki T et al.]","University of  Tokyo, Tokyo, Japan.",31379911,"10.3389/fpls.2019.00935 ","Autophagy is a catabolic process for bulk and selective degradation of cytoplasmic components in the vacuole/lysosome. In Saccharomyces cerevisiae, ATG  genes were identified as essential genes for autophagy, and most ATG genes are highly conserved among eukaryotes, including plants. Although reverse genetic analyses have revealed that autophagy is involved in responses to abiotic and biotic stresses in land plants, our knowledge of its molecular mechanism remains  limited. This limitation is partly because of the multiplication of some ATG genes, including ATG8, in widely used model plants such as Arabidopsis thaliana,  which adds complexity to functional studies. Furthermore, due to limited information on the composition and functions of the ATG genes in basal land plants and charophytes, it remains unclear whether multiplication of ATG genes is associated with neofunctionalization of these genes. To gain insight into the diversification of ATG genes during plant evolution, we compared the composition  of ATG genes in plants with a special focus on a liverwort and two charophytes, which have not previously been analyzed. Our results showed that the liverwort Marchantia polymorpha and the charophytes Klebsormidium nitens and Chara braunii  harbor fundamental sets of ATG genes with low redundancy compared with those of A. thaliana and the moss Physcomitrella patens, suggesting that multiplication of ATG genes occurred during land plant evolution. We also attempted to establish an experimental system for analyzing autophagy in M. polymorpha. We generated transgenic plants expressing fluorescently tagged MpATG8 to observe its dynamics  in M. polymorpha and produced autophagy-defective mutants by genome editing using the CRISPR/Cas9 system. These tools allowed us to demonstrate that MpATG8 is transported into the vacuole in an MpATG2-, MpATG5-, and MpATG7-dependent manner, suggesting that fluorescently tagged MpATG8 can be used as an autophagosome marker in M. polymorpha. M. polymorpha can provide a powerful system for studying the mechanisms and evolution of autophagy in plants.","Marchantia polymorpha","オートファジーは、空胞/リソソーム内の細胞質成分のバルクおよび選択的分解のための異化プロセスです。Saccharomyces cerevisiaeでは、ATG遺伝子がオートファジーに不可欠な遺伝子として同定されており、ほとんどのATG遺伝子は植物を含む真核生物の間で高度に保存されています。逆遺伝学的分析により、オートファジーが陸上植物の非生物的および生物的ストレスへの応答に関与していることが明らかになりましたが、その分子メカニズムに関する知識は限られています。この制限の一部は、Arabidopsisthalianaなどの広く使用されているモデル植物でATG8を含むいくつかのATG遺伝子が増殖しているためであり、機能研究が複雑になっています。さらに、基礎陸上植物および車軸藻植物におけるATG遺伝子の組成および機能に関する情報が限られているため、ATG遺伝子の増殖がこれらの遺伝子の新機能化に関連しているかどうかは不明なままです。植物の進化におけるATG遺伝子の多様化についての洞察を得るために、これまで分析されていなかった肝虫と2つのチャロファイトに特に焦点を当てて植物のATG遺伝子の組成を比較しました。私たちの結果は、肝虫マルカンティアポリモルファとチャロファイトKlebsormidiumnitensとCharabrauniiが、A。thalianaとコケPhyscomitrella patensに比べて冗長性の低いATG遺伝子の基本セットを持っていることを示し、ATG遺伝子の増殖が陸上植物の進化中に起こったことを示唆しています。また、M。polymorphaのオートファジーを分析するための実験システムの確立を試みました。M. polymorphaでのダイナミクスを観察するために、蛍光タグ付きMpATG8を発現するトランスジェニック植物を生成し、CRISPR / Cas9システムを使用したゲノム編集によってオートファジー欠損変異体を生成しました。これらのツールにより、MpATG8がMpATG2-、MpATG5-、およびMpATG7依存的に空胞に輸送されることを実証でき、蛍光標識されたMpATG8をM.polymorphaのオートファゴソームマーカーとして使用できることが示唆されました。M. polymorphaは、植物のオートファジーのメカニズムと進化を研究するための強力なシステムを提供できます。"]
[99,30816950,"plant","Marchantia polymorpha","CRISPR;Cas9;","MpFHY1 (ortholog of FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL1); MpPIF (PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR)","Plant & cell physiology","Reproductive Induction is a Far-Red High Irradiance Response that is Mediated by  Phytochrome and PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR in Marchantia polymorpha.",2019,"60(5):1136-1145","[Inoue K et al.]","Kyoto University, Kyoto, Japan.",30816950,"10.1093/pcp/pcz029 ","Land plants have evolved a series of photoreceptors to precisely perceive environmental information. Among these, phytochromes are the sole photoreceptors  for red light (R) and far-red light (FR), and play pivotal roles in modulating various developmental processes. Most extant land plants possess multiple phytochromes that probably evolved from a single phytochrome in the common ancestor of land plants. However, the ancestral phytochrome signaling mechanism remains unknown due to a paucity of knowledge regarding phytochrome functions in  basal land plants. It has recently been reported that Mpphy, a single phytochrome in the liverwort Marchantia polymorpha, regulates typical photoreversible responses collectively classified as low fluence response (LFR). Here, we show that Mpphy also regulates the gametangiophore formation analogous to the mode of  action of the far-red high irradiance response (FR-HIR) in angiosperms. Our phenotypic analyses using mutant plants obtained by CRISPR/Cas9-based genome editing revealed that MpFHY1, an ortholog of FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL1, as well as Mpphy is critical for the FR-HIR signaling in M. polymorpha. In addition, knockout of MpPIF, a single PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR gene in M. polymorpha, completely abolished the FR-HIR-dependent gametangiophore formation, while overexpression of MpPIF accelerated the response. FR-HIR-dependent transcriptional regulation was also disrupted in the Mppif mutant. Our findings suggest that plants had already acquired the FR-HIR signaling mediated by phytochrome and PIF at a very early stage during the course of land plant evolution, and that a single phytochrome in the common ancestor of land plants could mediate both LFR and FR-HIR.","Marchantia polymorpha","陸上植物は、環境情報を正確に知覚するために一連の光受容体を進化させてきました。これらの中で、フィトクロムは赤色光（R）と遠赤色光（FR）の唯一の光受容体であり、さまざまな発達過程の調節において極めて重要な役割を果たします。ほとんどの現存する陸上植物は、おそらく陸上植物の共通の祖先の単一のフィトクロムから進化した複数のフィトクロムを持っています。ただし、基本的な陸上植物のフィトクローム機能に関する知識が不足しているため、祖先のフィトクロームシグナル伝達メカニズムは不明なままです。ゼニゴケMarchantiapolymorphaの単一のフィトクロムであるMpphyが、低フルエンス応答（LFR）としてまとめて分類される典型的な光可逆応答を調節することが最近報告されました。ここでは、Mpphyが血管精子の遠赤色高照射応答（FR​​-HIR）の作用機序に類似した配偶子母細胞形成も調節することを示します。CRISPR / Cas9ベースのゲノム編集によって得られた変異植物を使用した表現型分析により、MpFHY1、FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL1のオルソログ、およびMpphyがM.polymorphaのFR-HIRシグナル伝達に重要であることが明らかになりました。さらに、M。polymorphaの単一のPHYTOCHROME INTERACTING FACTOR遺伝子であるMpPIFのノックアウトは、FR-HIR依存の配偶子母体形成を完全に無効にし、MpPIFの過剰発現は応答を加速しました。FR-HIR依存の転写調節もMppif変異体で破壊されました。私たちの発見は、陸上植物の進化の過程の非常に早い段階で、植物がフィトクロムとPIFによって媒介されるFR-HIRシグナル伝達をすでに獲得しており、陸上植物の共通の祖先にある単一のフィトクロムがLFRとFR-の両方を媒介できることを示唆しています。 HIR。"]
[100,30664233,"plant","Medicago truncatula","CRISPR;Cas9;","nodule-specific Polycystin-1, Lipoxygenase, Alpha Toxin (PLAT) domain proteins (NPD)","New phytologist","Nodule-specific PLAT domain proteins are expanded in the Medicago lineage and required for nodulation.",2019,"222(3):1538-1550","[Trujillo DI  et al.]","University of Minnesota, Saint Paul, MN, USA.",30664233,"10.1111/nph.15697 ","Symbiotic nitrogen fixation in legumes is mediated by an interplay of signaling processes between plant hosts and rhizobial symbionts. In legumes, several secreted protein families have undergone expansions and play key roles in nodulation. Thus, identifying lineage-specific expansions (LSEs) of nodulation-associated genes can be a strategy to discover candidate gene families. Using bioinformatic tools, we identified 13 LSEs of nodulation-related  secreted protein families, each unique to either Glycine, Arachis or Medicago lineages. In the Medicago lineage, nodule-specific Polycystin-1, Lipoxygenase, Alpha Toxin (PLAT) domain proteins (NPDs) expanded to five members. We examined NPD function using CRISPR/Cas9 multiplex genome editing to create Medicago truncatula NPD knockout lines, targeting one to five NPD genes. Mutant lines with differing combinations of NPD gene inactivations had progressively smaller nodules, earlier onset of nodule senescence, or ineffective nodules compared to the wild-type control. Double- and triple-knockout lines showed dissimilar nodulation phenotypes but coincided in upregulation of a DHHC-type zinc finger and an aspartyl protease gene, possible candidates for the observed disturbance of proper nodule function. By postulating that gene family expansions can be used to detect candidate genes, we identified a family of nodule-specific PLAT domain  proteins and confirmed that they play a role in successful nodule formation.","Medicago truncatula","マメ科植物における共生窒素固定は、植物宿主と根粒菌共生生物の間のシグナル伝達プロセスの相互作用によって媒介されます。マメ科植物では、いくつかの分泌タンパク質ファミリーが拡大し、結節形成において重要な役割を果たしています。したがって、根粒形成関連遺伝子の系統特異的拡大（LSE）を特定することは、候補遺伝子ファミリーを発見するための戦略となり得る。バイオインフォマティクスツールを使用して、結節関連の分泌タンパク質ファミリーの13のLSEを特定しました。それぞれ、グリシン、アラキス、またはメディカゴの系統に固有です。Medicago系統では、結節特異的ポリシスチン-1、リポキシゲナーゼ、アルファトキシン（PLAT）ドメインタンパク質（NPD）が5つのメンバーに拡大しました。CRISPR / Cas9マルチプレックスゲノム編集を使用してNPD機能を調べ、1〜5個のNPD遺伝子を対象としたMedicago truncatulaNPDノックアウトラインを作成しました。NPD遺伝子の不活性化の組み合わせが異なる変異株は、野生型の対照と比較して、小結節が次第に小さくなり、小結節の老化が早く始まり、または効果のない小結節がありました。ダブルノックアウトラインとトリプルノックアウトラインは、異なる結節表現型を示しましたが、DHHCタイプの亜鉛フィンガーとアスパルチルプロテアーゼ遺伝子のアップレギュレーションで一致し、適切な結節機能の観察された障害の候補となる可能性があります。遺伝子ファミリーの拡大を使用して候補遺伝子を検出できると仮定することにより、結節特異的PLATドメインタンパク質のファミリーを特定し、それらが結節形成の成功に役割を果たすことを確認しました。"]
[101,31505675,"plant","Medicago truncatula","Cas9;"," ","Nucleic acids research","muLAS technology for DNA isolation coupled to Cas9-assisted targeting for sequencing and assembly of a 30 kb region in plant genome.",2019,"47(15):8050-8060","[Milon N et al.]","CNRS, Toulouse, France.",31505675,"10.1093/nar/gkz632 ","Cas9-assisted targeting of DNA fragments in complex genomes is viewed as an essential strategy to obtain high-quality and continuous sequence data. However,  the purity of target loci selected by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) has so far been insufficient to assemble the sequence in one contig. Here, we describe the muLAS technology to capture and purify high molecular weight DNA. First, the technology is optimized to perform high sensitivity DNA profiling with a limit of detection of 20 fg/mul for 50 kb fragments and an analytical time of 50 min. Then, muLAS is operated to isolate a 31.5 kb locus cleaved by Cas9 in the genome of the plant Medicago truncatula. Target purification is validated on a Bacterial Artificial Chromosome plasmid, and subsequently carried out in whole genome with muLAS, PFGE or by combining these techniques. PacBio sequencing shows an enrichment factor of the target sequence of 84 with PFGE alone versus 892 by association of PFGE with muLAS. These performances allow us to sequence and assemble one contig of 29 441 bp with 99% sequence identity to the reference sequence.","Medicago truncatula","複雑なゲノム内のDNAフラグメントのCas9支援ターゲティングは、高品質で連続的な配列データを取得するための重要な戦略と見なされています。しかし、パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）によって選択された標的遺伝子座の純度は、これまでのところ、1つの連続体に配列を組み立てるには不十分でした。ここでは、高分子量DNAを捕捉して精製するmuLASテクノロジーについて説明します。まず、このテクノロジーは、50kbフラグメントの検出限界が20fg / mul、分析時間が50分の高感度DNAプロファイリングを実行するように最適化されています。次に、muLASを操作して、植物MedicagotruncatulaのゲノムでCas9によって切断された31.5kbの遺伝子座を分離します。ターゲットの精製は、Bacterial Artificial Chromosomeプラスミドで検証され、その後、muLAS、PFGEを使用して、またはこれらの手法を組み合わせて、全ゲノムで実行されます。PacBioシーケンスは、PFGEとmuLASの関連付けによる892に対して、PFGEのみの84のターゲットシーケンスの濃縮係数を示しています。これらのパフォーマンスにより、参照シーケンスと99％のシーケンス同一性を持つ29 441bpの1つのコンティグをシーケンスおよびアセンブルできます。"]
[102,31591150,"plant","Medicago truncatula","TALENs","basic helix-loop-helix transcription factor2","Plant physiology","Transcription Factor bHLH2 Represses CYSTEINE PROTEASE77 to Negatively Regulate Nodule Senescence.",2019,"181(4):1683-1703","[Deng J  et al.]","China  Agricultural University, Beijing, China.",31591150,"10.1104/pp.19.00574 ","Legume-rhizobia symbiosis is a time-limited process due to the onset of senescence, which results in the degradation of host plant cells and symbiosomes. A number of transcription factors, proteases, and functional genes have been associated with nodule senescence; however, whether other proteases or transcription factors are involved in nodule senescence remains poorly understood. In this study, we identified an early nodule senescence mutant in Medicago truncatula, denoted basic helix-loop-helix transcription factor2 (bhlh2), that exhibits decreased nitrogenase activity, acceleration of plant programmed cell death (PCD), and accumulation of reactive oxygen species (ROS). The results suggest that MtbHLH2 plays a negative role in nodule senescence. Nodules of wild-type and bhlh2-TALEN mutant plants at 28 d postinoculation were used for transcriptome sequencing. The transcriptome data analysis identified a papain-like Cys protease gene, denoted MtCP77, that could serve as a potential target of MtbHLH2. Electrophoretic mobility shift assays and chromatin immunoprecipitation analysis demonstrated that MtbHLH2 directly binds to the promoter of MtCP77 to inhibit its expression. MtCP77 positively regulates nodule  senescence by accelerating plant PCD and ROS accumulation. In addition, the expression of MtbHLH2 in the nodules gradually decreased from the meristematic zone to the nitrogen fixation zone, whereas the expression of MtCP77 showed enhancement. These results indicate that MtbHLH2 and MtCP77 have opposite functions in the regulation of nodule senescence. These results reveal significant roles for MtbHLH2 and MtCP77 in plant PCD, ROS accumulation, and nodule senescence, and improve our understanding of the regulation of the nodule  senescence process.","Medicago truncatula","Legume-rhizobiaの共生は、老化の開始による時間制限のあるプロセスであり、宿主植物細胞とシンビオソームの分解をもたらします。多くの転写因子、プロテアーゼ、および機能遺伝子が結節の老化に関連しています。ただし、他のプロテアーゼまたは転写因子が結節の老化に関与しているかどうかはよくわかっていないままです。この研究では、基本的なヘリックス-ループ-ヘリックス転写因子2（bhlh2）と呼ばれる、Medicago truncatulaの初期の小結節老化変異体を特定しました。これは、窒素分解酵素活性の低下、植物プログラム細胞死（PCD）の加速、および反応性酸素種の蓄積を示します。 （ROS）。結果は、MtbHLH2が結節の老化において負の役割を果たしていることを示唆している。接種後28日目の野生型およびbhlh2-TALEN変異体植物の小結節をトランスクリプトーム配列決定に使用した。トランスクリプトームデータ分析により、MtbHLH2の潜在的な標的として機能する可能性のあるMtCP77と呼ばれるパパイン様Cysプロテアーゼ遺伝子が同定されました。電気泳動移動度シフトアッセイおよびクロマチン免疫沈降分析は、MtbHLH2がMtCP77のプロモーターに直接結合してその発現を阻害することを示しました。MtCP77は、植物のPCDおよびROSの蓄積を促進することにより、結節の老化を積極的に調節します。さらに、根粒におけるMtbHLH2の発現は、分裂組織ゾーンから窒素固定ゾーンへと徐々に減少したが、MtCP77の発現は増強を示した。これらの結果は、MtbHLH2とMtCP77が小結節老化の調節において反対の機能を持っていることを示しています。これらの結果は、植物のPCD、ROSの蓄積、および結節の老化におけるMtbHLH2およびMtCP77の重要な役割を明らかにし、結節の老化プロセスの調節についての理解を深めます。"]
[103,30976084,"plant","Medicago truncatula","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","Gibberellin inactivating C20-GA2-oxidase (MtGA2ox10)","Scientific reports","MtGA2ox10 encoding C20-GA2-oxidase regulates rhizobial infection and nodule development in Medicago truncatula.",2019,"9(1):5952","[Kim GB et al.]","Myongji University, Yongin, Korea.",30976084,"10.1038/s41598-019-42407-3 ","Gibberellin (GA) plays a controversial role in the legume-rhizobium symbiosis. Recent studies have shown that the GA level in legumes must be precisely controlled for successful rhizobial infection and nodule organogenesis. However,  regulation of the GA level via catabolism in legume roots has not been reported to date. Here, we investigate a novel GA inactivating C20-GA2-oxidase gene MtGA2ox10 in Medicago truncatula. RNA sequencing analysis and quantitative polymerase chain reaction revealed that MtGA2ox10 was induced as early as 6 h post-inoculation (hpi) of rhizobia and reached peak transcript abundance at 12 hpi. Promoter::beta-glucuronidase fusion showed that the promoter activity was localized in the root infection/differentiation zone during the early stage of rhizobial infection and in the vascular bundle of the mature nodule. The CRISPR/Cas9-mediated deletion mutation of MtGA2ox10 suppressed infection thread formation, which resulted in reduced development and retarded growth of nodules on the Agrobacterium rhizogenes-transformed roots. Over-expression of MtGA2ox10 in the stable transgenic plants caused dwarfism, which was rescued by GA3 application, and increased infection thread formation but inhibition of nodule development. We conclude that MtGA2ox10 plays an important role in the rhizobial  infection and the development of root nodules through fine catabolic tuning of GA in M. truncatula.","Medicago truncatula","ジベレリン（GA）は、マメ科植物と根粒菌の共生において物議を醸す役割を果たしています。最近の研究では、根茎の感染と結節の器官形成を成功させるには、マメ科植物のGAレベルを正確に制御する必要があることが示されています。しかし、マメ科植物の根の異化作用によるGAレベルの調節はこれまで報告されていません。ここでは、MedicagotruncatulaのC20-GA2-オキシダーゼ遺伝子MtGA2ox10を不活性化する新規GAを調査します。RNAシーケンシング分析と定量的ポリメラーゼ連鎖反応により、MtGA2ox10は根粒菌の接種後6時間（hpi）に誘導され、12hpiで転写産物の量がピークに達することが明らかになりました。プロモーター::ベータ-グルクロニダーゼ融合は、プロモーター活性が根粒菌感染の初期段階の根の感染/分化ゾーンと成熟した結節の維管束に局在することを示した。MtGA2ox10のCRISPR / Cas9を介した欠失変異は、感染糸の形成を抑制し、その結果、Agrobacterium rhizogenesで形質転換された根の小結節の発達が低下し、成長が遅れました。安定したトランスジェニック植物におけるMtGA2ox10の過剰発現は、GA3の適用によって救済された矮性を引き起こし、感染糸の形成を増加させたが、結節の発達を阻害した。MtGA2ox10は、M。truncatulaのGAを細かくカタボリックに調整することにより、根茎感染と根結節の発達に重要な役割を果たしていると結論付けています。"]
[104,31745156,"plant","melon","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","phytoene desaturase","Scientific reports","Efficient knockout of phytoene desaturase gene using CRISPR/Cas9 in melon.",2019,"9(1):17077","[Hooghvorst I  et al.]","Universitat de Barcelona, Barcelona, Spain.",31745156,"10.1038/s41598-019-53710-4 ","CRISPR/Cas9 system has been widely applied in many plant species to induce mutations in the genome for studying gene function and improving crops. However,  to our knowledge, there is no report of CRISPR/Cas9-mediated genome editing in melon (Cucumis melo). In our study, phytoene desaturase gene of melon (CmPDS) was selected as target for the CRISPR/Cas9 system with two designed gRNAs, targeting  exons 1 and 2. A construct (pHSE-CmPDS) carrying both gRNAs and the Cas9 protein  was delivered by PEG-mediated transformation in protoplasts. Mutations were detected in protoplasts for both gRNAs. Subsequently, Agrobacterium-mediated transformation of cotyledonary explants was carried out, and fully albino and chimeric albino plants were successfully regenerated. A regeneration efficiency of 71% of transformed plants was achieved from cotyledonary explants, a 39% of genetic transformed plants were successful gene edited, and finally, a 42-45% of  mutation rate was detected by Sanger analysis. In melon protoplasts and plants most mutations were substitutions (91%), followed by insertions (7%) and deletions (2%). We set up a CRISPR/Cas9-mediated genome editing protocol which is efficient and feasible in melon, generating multi-allelic mutations in both genomic target sites of the CmPDS gene showing an albino phenotype easily detectable after only few weeks after Agrobacterium-mediated transformation.","melon","CRISPR / Cas9システムは、遺伝子機能を研究し、作物を改善するためにゲノムに変異を誘発するために、多くの植物種に広く適用されています。しかし、私たちの知る限り、メロン（Cucumis melo）でのCRISPR / Cas9を介したゲノム編集の報告はありません。私たちの研究では、メロンのフィトエンデサチュラーゼ遺伝子（CmPDS）が、エキソン1と2をターゲットとする2つの設計されたgRNAを備えたCRISPR / Cas9システムのターゲットとして選択されました。gRNAとCas9タンパク質の両方を運ぶコンストラクト（pHSE-CmPDS）は、プロトプラストにおけるPEGを介した形質転換。両方のgRNAのプロトプラストで変異が検出されました。続いて、アグロバクテリウムを介した子葉外植片の形質転換が行われ、完全なアルビノおよびキメラアルビノ植物が首尾よく再生された。子葉外植片から形質転換植物の71％の再生効率が達成され、遺伝子形質転換植物の39％が遺伝子編集に成功し、最後に、サンガー分析によって42〜45％の変異率が検出されました。メロンプロトプラストと植物では、ほとんどの変異は置換（91％）であり、挿入（7％）と削除（2％）がそれに続きました。メロンで効率的かつ実行可能なCRISPR / Cas9を介したゲノム編集プロトコルを設定し、CmPDS遺伝子の両方のゲノムターゲットサイトでマルチアレリック変異を生成し、アグロバクテリウムを介した変換後わずか数週間でアルビノ表現型を簡単に検出できることを示しました。"]
[105,31004551,"plant","mini-citrus (Fortunella hindsii)","CRISPR;Cas9;"," ","Plant biotechnology journal","Genome sequencing and CRISPR/Cas9 gene editing of an early flowering Mini-Citrus  (Fortunella hindsii).",2019,"17(11):2199-2210","[Zhu C et al.]","Huazhong Agricultural University, Wuhan, China.",31004551,"10.1111/pbi.13132 ","Hongkong kumquat (Fortunella hindsii) is a wild citrus species characterized by dwarf plant height and early flowering. Here, we identified the monoembryonic F.  hindsii (designated as 'Mini-Citrus') for the first time and constructed its selfing lines. This germplasm constitutes an ideal model for the genetic and functional genomics studies of citrus, which have been severely hindered by the long juvenility and inherent apomixes of citrus. F. hindsii showed a very short juvenile period (~8 months) and stable monoembryonic phenotype under cultivation. We report the first de novo assembled 373.6 Mb genome sequences (Contig-N50 2.2 Mb and Scaffold-N50 5.2 Mb) for F. hindsii. In total, 32 257 protein-coding genes were annotated, 96.9% of which had homologues in other eight Citrinae species. The phylogenomic analysis revealed a close relationship of F. hindsii with cultivated citrus varieties, especially with mandarin. Furthermore, the CRISPR/Cas9 system was demonstrated to be an efficient strategy to generate target mutagenesis on F. hindsii. The modifications of target genes in the CRISPR-modified F. hindsii were predominantly 1-bp insertions or small deletions. This genetic transformation system based on F. hindsii could shorten the whole process from explant to T1 mutant to about 15 months. Overall, due to its short juvenility, monoembryony, close genetic background to cultivated citrus and applicability of CRISPR, F. hindsii shows unprecedented potentials to be used as  a model species for citrus research.","mini-citrus (Fortunella hindsii)","マメキンカン（Fortunella hindsii）は、矮性の草丈と早咲きが特徴の野生の柑橘類です。ここでは、単胚性のF. hindsii（「ミニシトラス」と呼ばれる）を初めて特定し、その自殖線を構築しました。この生殖質は、柑橘類の長い若さと固有のアポミックスによってひどく妨げられてきた柑橘類の遺伝的および機能的ゲノミクス研究のための理想的なモデルを構成します。F. hindsiiは、非常に短い幼若期（〜8か月）と培養中の安定した単胚性表現型を示しました。F.hindsiiの最初のdenovoアセンブルされた373.6Mbゲノム配列（Contig-N50 2.2MbおよびScaffold-N505.2 Mb）を報告します。合計で、32 257のタンパク質コード遺伝子に注釈が付けられ、そのうちの96.9％は他の8つのCitrinae種に相同性がありました。系統学的分析により、F.hindsiiと栽培された柑橘類の品種、特にマンダリンとの密接な関係が明らかになりました。さらに、CRISPR / Cas9システムは、F.hindsiiで標的突然変異誘発を生成するための効率的な戦略であることが実証されました。CRISPRで修飾されたF.hindsiiの標的遺伝子の修飾は、主に1bpの挿入または小さな欠失でした。F. hindsiiに基づくこの遺伝子変換システムは、外植片からT1変異体までのプロセス全体を約15か月に短縮することができます。全体として、その短い若さ、単胚性、栽培された柑橘類に近い遺伝的背景、およびCRISPRの適用性により、F。hindsiiは、柑橘類研究のモデル種として使用される前例のない可能性を示しています。"]
[106,31863481,"plant","Parasponia andersonii","CRISPR;Cas9;","NODULE INCEPTION (NIN); NUCLEAR FACTOR Y (NF-YA) ","New phytologist","Mutant analysis in the nonlegume Parasponia andersonii identifies NIN and NF-YA1  transcription factors as a core genetic network in nitrogen-fixing nodule symbioses.",2019,null,"[Bu F  et al.]","Wageningen University, Wageningen, the Netherlands.",31863481,"10.1111/nph.16386 ","Nitrogen-fixing nodulation occurs in 10 taxonomic lineages, with either rhizobia  or Frankia bacteria. To establish such an endosymbiosis, two processes are essential: nodule organogenesis and intracellular bacterial infection. In the legume-rhizobium endosymbiosis, both processes are guarded by the transcription factor NODULE INCEPTION (NIN) and its downstream target genes of the NUCLEAR FACTOR Y (NF-Y) complex. It is hypothesized that nodulation has a single evolutionary origin c. 110 Ma, followed by many independent losses. Despite a significant body of knowledge of the legume-rhizobium symbiosis, it remains elusive which signalling modules are shared between nodulating species in different taxonomic clades. We used Parasponia andersonii to investigate the role of NIN and NF-YA genes in rhizobium nodulation in a nonlegume system. Consistent  with legumes, P. andersonii PanNIN and PanNF-YA1 are coexpressed in nodules. By analyzing single, double and higher-order CRISPR-Cas9 knockout mutants, we show that nodule organogenesis and early symbiotic expression of PanNF-YA1 are PanNIN-dependent and that PanNF-YA1 is specifically required for intracellular rhizobium infection. This demonstrates that NIN and NF-YA1 have conserved symbiotic functions. As Parasponia and legumes diverged soon after the birth of the nodulation trait, we argue that NIN and NF-YA1 represent core transcriptional regulators in this symbiosis.","Parasponia andersonii","窒素固定結節は、根圏菌またはフランキア菌のいずれかを伴う10の分類学的系統で発生します。このような内部共生を確立するには、結節の器官形成と細胞内細菌感染という2つのプロセスが不可欠です。マメ科植物と根茎の内部共生では、両方のプロセスが転写因子NODULE INCEPTION（NIN）とその下流のNUCLEAR FACTOR Y（NF-Y）複合体の標的遺伝子によって守られています。結節形成は単一の進化的起源を有すると仮定されているc。110 Ma、それに続く多くの独立した損失。マメ科植物とリゾビウムの共生に関するかなりの知識があるにもかかわらず、異なる分類学的クレードの結節種間でどのシグナル伝達モジュールが共有されているかは、とらえどころのないままです。Parasponia andersoniiを使用して、非マメ科植物の根茎結節形成におけるNINおよびNF-YA遺伝子の役割を調査しました。マメ科植物と一致して、P。andersoniPanNINとPanNF-YA1は根粒で共発現します。シングル、ダブル、および高次のCRISPR-Cas9ノックアウト変異体を分析することにより、PanNF-YA1の結節器官形成と初期の共生発現がPanNIN依存性であり、PanNF-YA1が細胞内リゾビウム感染に特に必要であることを示します。これは、NINとNF-YA1が共生機能を保存していることを示しています。結節形質の誕生直後にパラスポニアとマメ科植物が分岐したため、NINとNF-YA1がこの共生の中心的な転写調節因子であると主張します。"]
[107,31475981,"plant","Parasponia andersonii (fast-growing tropical tree)","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;"," ","Journal of visualized experiments","Transforming, Genome Editing and Phenotyping the Nitrogen-fixing Tropical Cannabaceae Tree Parasponia andersonii.",2019,"(150)","[Wardhani TAK et al.]","Wageningen University & Research, the Netherlands.",31475981,"10.3791/59971 ","Parasponia andersonii is a fast-growing tropical tree that belongs to the Cannabis family (Cannabaceae). Together with 4 additional species, it forms the only known non-legume lineage able to establish a nitrogen-fixing nodule symbiosis with rhizobium. Comparative studies between legumes and P. andersonii could provide valuable insight into the genetic networks underlying root nodule formation. To facilitate comparative studies, we recently sequenced the P. andersonii genome and established Agrobacterium tumefaciens-mediated stable transformation and CRISPR/Cas9-based genome editing. Here, we provide a detailed  description of the transformation and genome editing procedures developed for P.  andersonii. In addition, we describe procedures for the seed germination and characterization of symbiotic phenotypes. Using this protocol, stable transgenic  mutant lines can be generated in a period of 2-3 months. Vegetative in vitro propagation of T0 transgenic lines allows phenotyping experiments to be initiated at 4 months after A. tumefaciens co-cultivation. Therefore, this protocol takes only marginally longer than the transient Agrobacterium rhizogenes-based root transformation method available for P. andersonii, though offers several clear advantages. Together, the procedures described here permit P. andersonii to be used as a research model for studies aimed at understanding symbiotic associations as well as potentially other aspects of the biology of this tropical tree.","Parasponia andersonii (fast-growing tropical tree)","Parasponia andersoniiは、大麻科（大麻科）に属する急成長中の熱帯樹木です。4つの追加種と一緒に、それはリゾビウムとの窒素固定小結節共生を確立することができる唯一の既知の非レグム系統を形成します。マメ科植物とP.andersoniの比較研究は、根粒形成の根底にある遺伝子ネットワークへの貴重な洞察を提供する可能性があります。比較研究を容易にするために、最近、P。andersoniゲノムの配列を決定し、Agrobacteriumtumefaciensを介した安定した形質転換とCRISPR / Cas9ベースのゲノム編集を確立しました。ここでは、P。andersoniのために開発された変換およびゲノム編集手順の詳細な説明を提供します。さらに、種子の発芽と共生表現型の特性評価の手順についても説明します。このプロトコルを使用すると、安定したトランスジェニック変異株を2〜3か月で生成できます。T0トランスジェニック系統の植物性invitro増殖により、A。tumefaciensの共培養後4ヶ月で表現型実験を開始することができます。したがって、このプロトコルは、P。andersoniiで利用可能な一時的なAgrobacterium rhizogenesベースのルート変換方法よりもわずかに長くかかりますが、いくつかの明確な利点があります。一緒に、ここで説明されている手順は、P。andersoniiが、この熱帯樹の生物学の他の側面と同様に、共生関係を理解することを目的とした研究の研究モデルとして使用されることを可能にします。"]
[108,31035982,"plant","peanut","CRISPR;Cas9;","fatty acid desaturase (FAD2)","BMC biotechnology","Mutagenesis of FAD2 genes in peanut with CRISPR/Cas9 based gene editing.",2019,"19(1):24","[Yuan M et al.]","Tuskegee University, Tuskegee, AL, USA.",31035982,"10.1186/s12896-019-0516-8 ","BACKGROUND: Increasing the content of oleic acid in peanut seeds is one of the major goals in peanut breeding due to consumer and industry benefits, such as anti-oxidation and long shelf-life. Homeologous ahFAD2A and ahFAD2B genes encode  fatty acid desaturases, which are the key enzymes for converting oleic acid to linoleic acid that oxidizes readily. To date, all high oleic acid peanut varieties result from natural mutations occurred in both genes. A method to induce mutations in the genes of other elite cultivars could speed introgression  of this valuable trait. The gene-editing approach utilizing CRISPR/Cas9 technology was employed to induce de novo mutations in the ahFAD2 genes using peanut protoplasts and hairy root cultures as models. RESULTS: The hot spot of natural mutation in these genes was selected as the target region. Appropriate sgRNAs were designed and cloned into a CRISPR/Cas9 expression plasmid. As a result of CRISPR/Cas9 activity, three mutations were identified - G448A in ahFAD2A, and 441_442insA and G451T in ahFAD2B. The G448A and 441_442insA mutations are the same as those seen in existing high oleate varieties and the G451T is new mutation. Because natural mutations appear more often in the ahFAD2A gene than in the ahFAD2B gene in subspecies A. hypogaea var. hypogaea, the mutations induced in ahFAD2B by gene editing may be useful in developing high oleate lines with many genetic backgrounds after validation of oleic acid content in the transformed lines. The appearance of the G448A mutation in ahFAD2A is a further benefit for high oleic acid oil content. CONCLUSIONS: Overall, these results showed that mutations were, for the first time, induced by CRISPR-based gene editing approach in peanut. This research demonstrated the potential application of gene editing for mutagenesis in peanut and suggested that CRISPR/Cas9 technology may be useful in the peanut breeding programs.","peanut","背景：ピーナッツ種子中のオレイン酸の含有量を増やすことは、抗酸化や長い貯蔵寿命などの消費者および業界の利益のために、ピーナッツ育種の主要な目標の1つです。同種のahFAD2AおよびahFAD2B遺伝子は、脂肪酸デサチュラーゼをコードします。これは、オレイン酸を容易に酸化するリノール酸に変換するための重要な酵素です。現在まで、すべての高オレイン酸ピーナッツの品種は、両方の遺伝子で発生した自然な突然変異に起因しています。他のエリート栽培者の遺伝子に突然変異を誘発する方法は、この貴重な特性の侵入を加速する可能性があります。CRISPR / Cas9テクノロジーを利用した遺伝子編集アプローチを採用し、ピーナッツプロトプラストと毛状根培養をモデルとして使用して、ahFAD2遺伝子にdenovo変異を誘導しました。結果：これらの遺伝子の自然突然変異のホットスポットがターゲット領域として選択されました。適切なsgRNAが設計され、CRISPR / Cas9発現プラスミドにクローン化されました。CRISPR / Cas9アクティビティの結果として、ahFAD2AのG448A、ahFAD2Bの441_442insAとG451Tの3つの変異が特定されました。G448Aおよび441_442insA変異は、既存の高オレイン酸品種に見られるものと同じであり、G451Tは新しい変異です。自然変異は、亜種A. hypogaeavar。のahFAD2B遺伝子よりもahFAD2A遺伝子に多く現れるためです。hypogaea、遺伝子編集によってahFAD2Bに誘発された突然変異は、形質転換された系統のオレイン酸含有量の検証後、多くの遺伝的背景を持つ高オレイン酸系統の開発に役立つ可能性があります。ahFAD2AでのG448A変異の出現は、高オレイン酸油含有量のさらなる利点です。結論：全体として、これらの結果は、突然変異がピーナッツのCRISPRベースの遺伝子編集アプローチによって初めて誘発されたことを示しました。この研究は、ピーナッツの突然変異誘発のための遺伝子編集の潜在的な応用を実証し、CRISPR / Cas9技術がピーナッツ育種プログラムに役立つかもしれないことを示唆しました。"]
[109,31888281,"plant","pear (Pyrus bretschneideri)","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","S-acyltransferase (PbPAT14)","International journal of molecular sciences","Knockout of the S-acyltransferase Gene, PbPAT14, Confers the Dwarf Yellowing Phenotype in First Generation Pear by ABA Accumulation.",2019,"20(24)","[Pang H et al.]","Hebei Agricultural University, Baoding, China.",31888281,"10.3390/ijms20246347 ","The development of dwarf fruit trees with smaller and compact characteristics leads to significantly increased fruit production, which is a major objective of  pear (Pyrus bretschneideri) breeding. We identified the S-acylation activity of PbPAT14, an S-acyltransferase gene related to plant development, using a yeast (Saccharomyces cerevisiae) complementation assay, and also PbPAT14 could rescue the growth defect of the Arabidopsis mutant atpat14. We further studied the function of PbPAT14 by designing three guide RNAs for PbPAT14 to use in the CRISPR/Cas9 system. We obtained 22 positive transgenic pear lines via Agrobacterium-mediated transformation using cotyledons from seeds of Pyrus betulifolia ('Duli'). Six of these lines exhibited the dwarf yellowing phenotype  and were homozygous mutations according to sequencing analysis. Ultrastructure analysis suggested that this dwarfism was manifested by shorter, thinner stems due to a reduction in cell number. A higher level of endogenous abscisic acid (ABA) and a higher transcript level of the ABA pathway genes in the mutant lines  revealed that the PbPAT14 function was related to the ABA pathway. Overall, our experimental results increase the understanding of how PATs function in plants and help elucidate the mechanism of plant dwarfism.","pear (Pyrus bretschneideri)","小さくコンパクトな特性を持つ矮性果実の木の開発は、果実生産の大幅な増加につながります。これは、ナシ（Pyrus bretschneideri）の繁殖の主要な目的です。酵母（Saccharomyces cerevisiae）相補性アッセイを使用して、植物の発育に関連するS-アシルトランスフェラーゼ遺伝子であるPbPAT14のS-アシル化活性を同定しました。また、PbPAT14はシロイヌナズナ変異体atpat14の成長欠陥を救うことができました。さらに、CRISPR / Cas9システムで使用するPbPAT14の3つのガイドRNAを設計することにより、PbPAT14の機能を研究しました。Pyrus betulifolia（ 'Duli'）の種子から子葉を使用して、アグロバクテリウムを介した形質転換により、22の陽性トランスジェニック梨系統を取得しました。これらの系統のうち6つは、矮性黄変表現型を示し、配列分析によるとホモ接合変異でした。超微細構造分析は、この矮小化が細胞数の減少によるより短く、より細い茎によって明らかにされたことを示唆しました。変異株におけるより高いレベルの内因性アブシジン酸（ABA）およびより高い転写レベルのABA経路遺伝子は、PbPAT14機能がABA経路に関連していることを明らかにした。全体として、私たちの実験結果は、PATが植物でどのように機能するかについての理解を深め、植物の矮小化のメカニズムを解明するのに役立ちます。"]
[110,30230695,"plant","pennycress (Thlapsi arvense L.)","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","FATTY ACID ELONGATION1 (FAE1)","Plant biotechnology journal","Molecular tools enabling pennycress (Thlaspi arvense) as a model plant and oilseed cash cover crop.",2019,"17(4):776-788","[McGinn M et al.]","Illinois State University, Normal, IL, USA.",30230695,"10.1111/pbi.13014 ","Thlapsi arvense L. (pennycress) is being developed as a profitable oilseed cover  crop for the winter fallow period throughout the temperate regions of the world,  controlling soil erosion and nutrients run-off on otherwise barren farmland. We demonstrate that pennycress can serve as a user-friendly model system akin to Arabidopsis that is well-suited for both laboratory and field experimentation. We sequenced the diploid genome of the spring-type Spring 32-10 inbred line (1C DNA  content of 539 Mb; 2n = 14), identifying variation that may explain phenotypic differences with winter-type pennycress, as well as predominantly a one-to-one correspondence with Arabidopsis genes, which makes translational research straightforward. We developed an Agrobacterium-mediated floral dip transformation method (0.5% transformation efficiency) and introduced CRISPR-Cas9 constructs to  produce indel mutations in the putative FATTY ACID ELONGATION1 (FAE1) gene, thereby abolishing erucic acid production and creating an edible seed oil comparable to that of canola. We also stably transformed pennycress with the Euonymus alatus diacylglycerol acetyltransferase (EaDAcT) gene, producing low-viscosity acetyl-triacylglycerol-containing seed oil suitable as a diesel-engine drop-in fuel. Adoption of pennycress as a model system will accelerate oilseed-crop translational research and facilitate pennycress' rapid domestication to meet the growing sustainable food and fuel demands.","pennycress (Thlapsi arvense L.)","Thlapsi arvense L.（pennycress）は、世界の温暖な地域全体で冬休み期間の収益性の高い油糧種子カバー作物として開発されており、不毛の農地での土壌侵食と栄養素の流出を抑制しています。ペニークレスは、実験室と野外実験の両方に適した、アラビドプシスに似たユーザーフレンドリーなモデルシステムとして機能できることを示しています。春型のSpring32-10近交系（1CDNA含有量539Mb; 2n = 14）の二倍体ゲノムの配列を決定し、冬型ペニークレスとの表現型の違いを説明する可能性のある変動を特定しました。 -Arabidopsis遺伝子との1つの対応。これにより、翻訳研究が簡単になります。アグロバクテリウムを介したフローラルディップ変換法（変換効率0.5％）を開発し、CRISPR-Cas9コンストラクトを導入して推定FATTY ACID ELONGATION1（FAE1）遺伝子にインデル変異を生成し、それによってエルシン酸生成を廃止し、同等の食用種子油を作成しました。カノーラのそれ。また、Euonymus alatusジアシルグリセロールアセチルトランスフェラーゼ（EaDAcT）遺伝子でペニークレスを安定して形質転換し、ディーゼルエンジンのドロップイン燃料として適した低粘度のアセチルトリアシルグリセロール含有種子油を生成しました。モデルシステムとしてペニークレスを採用することで、油糧種子作物の翻訳研究が加速され、ペニークレスの急速な家畜化が促進され、増大する持続可能な食品と燃料の需要に対応できるようになります。"]
[111,31432295,"plant","Physcomitrella patens","CRISPR;","BLADE-ON-PETIOLE","Journal of plant research","BLADE-ON-PETIOLE genes are not involved in the transition from protonema to gametophore in the moss Physcomitrella patens.",2019,"132(5):617-627","[Hata Y et al.]","Tohoku University, Sendai, Miyagi, Japan.",31432295,"10.1007/s10265-019-01132-8 ","The timing of the transition between developmental phases is a critical determinant of plant form. In the moss Physcomitrella patens, the transition from protonema to gametophore is a particularly important step as it results in a change from two-dimensional to three-dimensional growth of the plant body. It is  well known that this transition is promoted by cytokinin (CK), however, the underlying mechanisms are poorly understood. Previously, it was reported that P.  patens orthologs of BLADE-ON-PETIOLE (BOP) genes (PpBOPs) work downstream of CK to promote the transition to gametophore. To further understand the role of PpBOPs in the control of this transition, we performed functional analyses of PpBOP genes. We simultaneously disrupted the function of all three PpBOP genes in P. patens using CRISPR technology, however, no abnormal phenotypes were observed  in the triple mutant during either the gametophytic or the sporophytic growth stages. CK treatment did not alter the phase change in the triple mutant. We conclude that PpBOP genes are unnecessary in the control of P. patens development under normal conditions. We propose that BOP genes are not involved in the control of developmental processes in bryophytes and other basal land plants, but may function in physiological processes such as in the defense response.","Physcomitrella patens","発達段階間の移行のタイミングは、植物の形態の重要な決定要因です。コケのPhyscomitrellapatensでは、原糸体から配偶子母体への移行は、植物体の2次元から3次元への成長をもたらすため、特に重要なステップです。この移行がサイトカイニン（CK）によって促進されることはよく知られていますが、根本的なメカニズムはよくわかっていません。以前、BLADE-ON-PETIOLE（BOP）遺伝子（PpBOP）のP. patensオルソログがCKの下流で機能して、配偶子母体への移行を促進することが報告されました。この移行の制御におけるPpBOPの役割をさらに理解するために、PpBOP遺伝子の機能分析を行いました。CRISPRテクノロジーを使用してP.patensの3つのPpBOP遺伝子すべての機能を同時に破壊しましたが、配偶体または胞子体の成長段階のいずれにおいても、三重変異体では異常な表現型は観察されませんでした。CK処理は三重変異体の相変化を変化させなかった。PpBOP遺伝子は、通常の条件下でのP.patensの発生の制御には不要であると結論付けています。BOP遺伝子は、bryophytesや他の基底陸植物の発達過程の制御には関与していないが、防御反応などの生理学的過程では機能している可能性があることを提案します。"]
[112,31523744,"plant","Physcomitrella patens","CRISPR;Cas9;","4 loci","Plant direct","Efficient and modular CRISPR-Cas9 vector system for Physcomitrella patens.",2019,"3(9):e00168","[Mallett DR  et al.]","Dartmouth College, Hanover, NH, USA.",31523744,"10.1002/pld3.168 ","CRISPR-Cas9 has been shown to be a valuable tool in recent years, allowing researchers to precisely edit the genome using an RNA-guided nuclease to initiate double-strand breaks. Until recently, classical RAD51-mediated homologous recombination has been a powerful tool for gene targeting in the moss Physcomitrella patens. However, CRISPR-Cas9-mediated genome editing in P. patens  was shown to be more efficient than traditional homologous recombination (Plant Biotechnology Journal, 15, 2017, 122). CRISPR-Cas9 provides the opportunity to efficiently edit the genome at multiple loci as well as integrate sequences at precise locations in the genome using a simple transient transformation. To fully take advantage of CRISPR-Cas9 genome editing in P. patens, here we describe the generation and use of a flexible and modular CRISPR-Cas9 vector system. Without the need for gene synthesis, this vector system enables editing of up to 12 loci  simultaneously. Using this system, we generated multiple lines that had null alleles at four distant loci. We also found that targeting multiple sites within  a single locus can produce larger deletions, but the success of this depends on individual protospacers. To take advantage of homology-directed repair, we developed modular vectors to rapidly generate DNA donor plasmids to efficiently introduce DNA sequences encoding for fluorescent proteins at the 5' and 3' ends of gene coding regions. With regard to homology-directed repair experiments, we found that if the protospacer sequence remains on the DNA donor plasmid, then Cas9 cleaves the plasmid target as well as the genomic target. This can reduce the efficiency of introducing sequences into the genome. Furthermore, to ensure the generation of a null allele near the Cas9 cleavage site, we generated a homology plasmid harboring a \"stop codon cassette\" with downstream near-effortless genotyping.","Physcomitrella patens","CRISPR-Cas9は近年貴重なツールであることが示されており、研究者はRNAガイドヌクレアーゼを使用してゲノムを正確に編集し、二本鎖切断を開始することができます。最近まで、古典的なRAD51を介した相同組換えは、コケPhyscomitrellapatensの遺伝子ターゲティングのための強力なツールでした。ただし、P。patensでのCRISPR-Cas9を介したゲノム編集は、従来の相同組換えよりも効率的であることが示されました（Plant Biotechnology Journal、15、2017、122）。CRISPR-Cas9は、複数の遺伝子座でゲノムを効率的に編集するだけでなく、単純な一時的な変換を使用してゲノム内の正確な位置で配列を統合する機会を提供します。P. patensでのCRISPR-Cas9ゲノム編集を十分に活用するために、ここでは、柔軟でモジュール式のCRISPR-Cas9ベクターシステムの生成と使用について説明します。このベクターシステムは、遺伝子合成を必要とせずに、最大12個の遺伝子座を同時に編集できます。このシステムを使用して、4つの離れた場所にヌル対立遺伝子を持つ複数の行を生成しました。また、単一の遺伝子座内の複数のサイトをターゲットにすると、より大きな削除が生成される可能性があることもわかりましたが、これが成功するかどうかは、個々のプロトスペーサーに依存します。相同性指向修復を利用するために、モジュラーベクターを開発してDNAドナープラスミドを迅速に生成し、遺伝子コーディング領域の5 'および3'末端に蛍光タンパク質をコードするDNA配列を効率的に導入しました。相同性指向修復実験に関して、プロトスペーサー配列がDNAドナープラスミド上に残っている場合、Cas9はプラスミドターゲットとゲノムターゲットを切断することを発見しました。これにより、シーケンスをゲノムに導入する効率が低下する可能性があります。さらに、Cas9切断部位の近くにヌル対立遺伝子を確実に生成するために、下流のほぼ簡単なジェノタイピングを備えた「ストップコドンカセット」を含む相同性プラスミドを生成しました。"]
[113,31350780,"plant","Physcomitrella patens","CRISPR;Cpf1;"," ","Plant journal","A CRISPR/LbCas12a-based method for highly efficient multiplex gene editing in Physcomitrella patens.",2019,"100(4):863-872","[Pu X et al.]","Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming, China.",31350780,"10.1111/tpj.14478 ","Due to their high efficiency, specificity, and flexibility, programmable nucleases, such as those of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas12a (Cpf1) system, have greatly expanded the applicability of editing the genomes of various organisms. Genes from different gene families or genes with redundant functions in the same gene family can be examined by assembling multiple CRISPR RNAs (crRNAs) in a single vector. However, the activity and efficiency of CRISPR/Cas12a in the non-vascular plant Physcomitrella patens are largely unknown. Here, we demonstrate that LbCas12a together with its  mature crRNA can target multiple loci simultaneously in P. patens with high efficiency via co-delivery of LbCas12a and a crRNA expression cassette in vivo. The mutation frequencies induced by CRISPR/LbCas12a at a single locus ranged from 26.5 to 100%, with diverse deletions being the most common type of mutation. Our  method expands the repertoire of genome editing tools available for P. patens and facilitates the creation of loss-of-function mutants of multiple genes from different gene families.","physcomitrella patens","それらの高い効率、特異性、および柔軟性のために、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ Cas12a（Cpf1）システムのようなプログラム可能なヌクレアーゼは、さまざまな生物のゲノムを編集する適用性を大幅に拡大しました。異なる遺伝子ファミリーの遺伝子または同じ遺伝子ファミリーに重複する機能を持つ遺伝子は、単一のベクターに複数のCRISPR RNA（crRNA）を組み立てることで調べることができます。ただし、非血管植物PhyscomitrellapatensにおけるCRISPR / Cas12aの活性と効率はほとんど知られていません。ここでは、LbCas12aとその成熟したcrRNAを組み合わせて、LbCas12aとcrRNA発現カセットをin vivoで同時配信することにより、P。patensの複数の遺伝子座を同時に高効率でターゲットにできることを示します。単一の遺伝子座でCRISPR / LbCas12aによって誘発される突然変異の頻度は、26.5から100％の範囲であり、多様な欠失が最も一般的なタイプの突然変異でした。私たちの方法は、P。patensで利用可能なゲノム編集ツールのレパートリーを拡張し、異なる遺伝子ファミリーからの複数の遺伝子の機能喪失変異体の作成を容易にします。"]
[114,31728198,"plant","pomegranate (Punica granatum L.)","CRISPR;Cas9;","UDP-dependent glycosyltransferase (PgUGT84A23; PgUGT84A24)","Horticulture research","Effective genome editing and identification of a regiospecific gallic acid 4-O-glycosyltransferase in pomegranate (Punica granatum L.).",2019,"6:123","[Chang L et al.]","Shanghai Chenshan Botanical Garden, Shanghai, China.",31728198,"10.1038/s41438-019-0206-7 ","Pomegranate (Punica granatum L.) trees are woody perennials that bear colorful and nutritious fruits rich in phenolic metabolites, e.g., hydrolyzable tannins (HTs) and flavonoids. We here report genome editing and gene discovery in pomegranate hairy roots using Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) (CRISPR/Cas9), coupled with transcriptome and biochemical analyses. Single guide RNAs (sgRNAs) were designed  to target two UDP-dependent glycosyltransferases (UGTs), PgUGT84A23 and PgUGT84A24, which possess overlapping activities in beta-glucogallin (a galloylglucose ester; biosynthetic precursor of HTs) biosynthesis. A unique accumulation of gallic acid 3-O- and 4-O-glucosides (galloylglucose ethers) was observed in the PgUGT84A23 and PgUGT84A24 dual CRISPR/Cas9-edited lines (i.e., ugt84a23 ugt84a24) but not the control (empty vector) or PgUGT84A23/PgUGT84A24 single edited lines (ugt84a23 or ugt84a24). Transcriptome and real-time qPCR analyses identified 11 UGTs with increased expression in the ugt84a23 ugt84a24 hairy roots compared to the controls. Of the 11 candidate UGTs, only PgUGT72BD1 used gallic acid as substrate and produced a regiospecific product gallic acid 4-O-glucoside. This work demonstrates that the CRISPR/Cas9 method can facilitate  functional genomics studies in pomegranate and shows promise for capitalizing on  the metabolic potential of pomegranate for germplasm improvement.","pomegranate (Punica granatum L.)","ザクロ（Punica granatum L.）の木は、加水分解性タンニン（HT）やフラボノイドなどのフェノール代謝物が豊富なカラフルで栄養価の高い果実を生む木質の多年生植物です。ここでは、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9（Cas9）（CRISPR / Cas9）をトランスクリプトームおよび生化学的分析と組み合わせて使用​​して、ザクロの毛根におけるゲノム編集および遺伝子発見を報告します。シングルガイドRNA（sgRNA）は、ベータグルコガリン（ガロイルグルコースエステル; HTの生合成前駆体）生合成において重複する活性を持つ2つのUDP依存性グリコシルトランスフェラーゼ（UGT）、PgUGT84A23およびPgUGT84A24を標的とするように設計されました。没食子酸3-O-および4-O-グルコシド（ガロイルグルコースエーテル）のユニークな蓄積が、PgUGT84A23およびPgUGT84A24デュアルCRISPR / Cas9編集ライン（すなわち、ugt84a23 ugt84a24）で観察されましたが、コントロール（空のベクター）またはPgUGT84A23では観察されませんでした/ PgUGT84A24単一編集行（ugt84a23またはugt84a24）。トランスクリプトームおよびリアルタイムqPCR分析により、コントロールと比較してugt84a23ugt84a24毛状根での発現が増加した11個のUGTが同定されました。11の候補UGTのうち、PgUGT72BD1のみが基質として没食子酸を使用し、位置特異的生成物である没食子酸4-O-グルコシドを生成しました。この研究は、CRISPR / Cas9法がザクロの機能ゲノミクス研究を促進できることを示しており、生殖質の改善のためにザクロの代謝の可能性を利用する可能性を示しています。"]
[115,31137806,"plant","poplar (hybrid poplar Populus Alba x Populus glandulosa Uyeki)","agroinfiltration","beta-glucuronidase (GUS)","International journal of molecular sciences","Efficient Agrobacterium-Mediated Transformation of the Commercial Hybrid Poplar Populus Alba x Populus glandulosa Uyeki.",2019,"20(10)","[Song C et al.]","Beijing Forestry University, Beijing, China.",31137806,"10.3390/ijms20102594 ","Transgenic technology is a powerful tool for gene functional characterization, and poplar is a model system for genetic transformation of perennial woody plants. However, the poplar genetic transformation system is limited to a number  of model genotypes. Herein, we developed a transformation system based on efficient Agrobacterium-mediated transformation for the hybrid poplar Populus Alba x Populus glandulosa Uyeki, which is a fast-growing poplar species that is suitably grown in the northern part of China. Importantly, we optimized many independent factors and showed that the transformation efficiency was improved significantly using juvenile leaf explants. Explants were infected by an Agrobacterium suspension with the OD600 = 0.6 for 15 min and then co-cultured in  dark conditions for 3 days. Using the improved transformation system, we obtained the transgenic poplar with overexpression of beta-glucuronidase (GUS) via direct  organogenesis without callus induction. Furthermore, we analyzed the GUS gene in  the transgenic poplars using PCR, qRT-PCR, and GUS staining. These analyses revealed that the GUS gene was efficiently transformed, and it exhibited various  expression levels. Taken together, these results represent a simple, fast, and efficient transformation system of hybrid poplar plants. Our findings may facilitate future studies of gene functions in perennial woody plants and tree breeding via transgenic technology assisted design.","Populus","トランスジェニック技術は遺伝子機能の特徴づけのための強力なツールであり、ポプラは多年生の木質植物の遺伝子形質転換のためのモデルシステムです。ただし、ポプラの遺伝子形質転換システムは、いくつかのモデル遺伝子型に限定されています。ここでは、中国北部で適切に栽培されている急成長中のポプラ種であるハイブリッドポプラPopulus Alba x Populus glandulosaUyekiの効率的なアグロバクテリウム媒介形質転換に基づく形質転換システムを開発しました。重要なことに、私たちは多くの独立した要因を最適化し、幼葉の外植片を使用して形質転換効率が大幅に改善されることを示しました。外植片は、OD600 = 0.6のアグロバクテリウム懸濁液に15分間感染させた後、暗所で3日間共培養しました。改良された形質転換システムを使用して、カルス誘導なしの直接器官形成を介してベータグルクロニダーゼ（GUS）の過剰発現を伴うトランスジェニックポプラを得た。さらに、PCR、qRT-PCR、およびGUS染色を使用して、トランスジェニックポプラのGUS遺伝子を分析しました。これらの分析により、GUS遺伝子が効率的に形質転換され、様々な発現レベルを示したことが明らかになった。まとめると、これらの結果は、ハイブリッドポプラ植物のシンプルで高速かつ効率的な変換システムを表しています。私たちの調査結果は、トランスジェニック技術支援設計を介して多年生木本植物と樹木育種における遺伝子機能の将来の研究を容易にする可能性があります。"]
[116,31872214,"plant","Populus","CRISPR;Cas9;","PdGNC","Journal of experimental botany","A GATA transcription factor PdGNC plays an important role in photosynthesis and growth in Populus.",2019,null,"[An Y et al.]","Beijing Forestry University, Beijing, China.",31872214,"10.1093/jxb/erz564 ","GATA transcription factors are involved in regulation of diverse growth processes and environmental responses in Arabidopsis and rice. In this study, we conducted  a comprehensive bioinformatic survey of the GATA family in the woody perennial Populus. Thirty-nine Populus GATA genes were classified into four subfamilies based on gene structure and phylogenetic relationships. Predicted cis-elements suggested potential roles of Populus GATA genes in light, phytohormone, development, and stress responses. A Populus GATA gene, PdGATA19/PdGNC (GATA nitrate-inducible carbon-metabolism-involved), was identified from a rapid-growing Populus clone. PdGNC expression was significantly up-regulated in leaves under both high (50 mM NO3-) and low (0.2 mM NO3-) nitrate concentrations. The CRISPR/Cas9-mediated mutant crispr-GNC showed severely retarded growth and enhanced secondary xylem differentiation. PdGNC-overexpressing transformants exhibited faster growth, higher biomass accumulation, and increases in chlorophyll content, photosynthetic rate, and plant height by 25%-30%, 20%-28%, and ~25%, respectively, compared with the wild type. Transcriptomic analysis showed that PdGNC was involved in photosynthetic electron transfer and carbon assimilation in the leaf, cell division and carbohydrate utilization in the stem, and nitrogen uptake in the root. These data indicated that PdGNC plays a crucial  role in plant growth and is potentially useful in tree molecular breeding.","Populus","GATA転写因子は、シロイヌナズナとイネの多様な成長過程と環境応答の調節に関与しています。この研究では、木質の多年生ポプルスにおけるGATAファミリーの包括的なバイオインフォマティクス調査を実施しました。39のPopulusGATA遺伝子は、遺伝子構造と系統発生的関係に基づいて4つのサブファミリーに分類されました。予測されたシス要素は、光、植物ホルモン、発達、およびストレス応答におけるPopulusGATA遺伝子の潜在的な役割を示唆しました。Populus GATA遺伝子、PdGATA19 / PdGNC（GATA硝酸塩誘導性炭素代謝が関与）は、急速に成長しているPopulusクローンから同定されました。PdGNCの発現は、高濃度（50 mM NO3-）と低濃度（0.2 mM NO3-）の両方で葉で有意にアップレギュレートされました。CRISPR / Cas9を介した変異体crispr-GNCは、成長の大幅な遅延と二次キシレム分化の増強を示しました。PdGNCを過剰発現する形質転換体は、野生型と比較して、より速い成長、より高いバイオマス蓄積、およびクロロフィル含有量、光合成速度、および草丈のそれぞれ25％-30％、20％-28％、および〜25％の増加を示しました。転写解析は、PdGNCが葉での光合成電子伝達と炭素同化、幹での細胞分裂と炭水化物利用、および根での窒素取り込みに関与していることを示しました。これらのデータは、PdGNCが植物の成長に重要な役割を果たし、樹木の分子育種に役立つ可能性があることを示しています。"]
[117,31736216,"plant","Populus","CRISPR;Cas9;","UDP-glucose-dependent glycosyltransferase71L1","Plant journal","Discovery of salicyl benzoate UDP-glycosyltransferase, a central enzyme in poplar salicinoid phenolic glycoside biosynthesis.",2019,null,"[Fellenberg C et al.]","University of Victoria, Victoria, British Columbia, Canada.",31736216,"10.1111/tpj.14615 ","The salicinoids are anti-herbivore phenolic glycosides unique to the Salicaceae (Populus and Salix). They consist of a salicyl alcohol glucoside core, which is usually further acylated with benzoic, cinnamic or phenolic acids. While salicinoid structures are well known, their biosynthesis remains enigmatic. Recently, two enzymes from poplar, salicyl alcohol benzoyl transferase and benzyl alcohol benzoyl transferase, were shown to catalyze the production of salicyl benzoate, a predicted potential intermediate in salicinoid biosynthesis. Here, we used transcriptomics and co-expression analysis with these two genes to identify  two UDP-glucose-dependent glycosyltransferases (UGT71L1 and UGT78M1) as candidate enzymes in this pathway. Both recombinant enzymes accepted only salicyl benzoate, salicylaldehyde and 2-hydroxycinnamic acid as glucose acceptors. Knocking out the UGT71L1 gene by CRISPR/Cas9 in poplar hairy root cultures led to the complete loss of salicortin, tremulacin and tremuloidin, and a partial reduction of salicin content. This demonstrated that UGT71L1 is required for synthesis of the  major salicinoids, and suggested that an additional route can lead to salicin. CRISPR/Cas9 knockouts for UGT78M1 were not successful, and its in vivo role thus  remains to be determined. Although it has a similar substrate preference and predicted structure as UGT71L1, it appears not to contribute to the synthesis of  salicortin, tremulacin and tremuloidin, at least in roots. The demonstration of UGT71L1 as an enzyme of salicinoid biosynthesis will open up new avenues for the  elucidation of this pathway.","Populus","サリシノイドは、サリカ科（ポプルスとサリックス）に特有の抗草食性フェノールグリコシドです。それらはサリチルアルコールグルコシドコアから成り、通常は安息香酸、桂皮酸、またはフェノール酸でさらにアシル化されます。サリシノイド構造はよく知られていますが、それらの生合成は謎のままです。最近、ポプラからの2つの酵素、サリチルアルコールベンゾイルトランスフェラーゼとベンジルアルコールベンゾイルトランスフェラーゼが、サリシノイド生合成の予測される潜在的な中間体である安息香酸サリチルの生成を触媒することが示されました。ここでは、トランスクリプトミクスとこれら2つの遺伝子との共発現分析を使用して、この経路の候補酵素として2つのUDP-グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ（UGT71L1およびUGT78M1）を特定しました。両方の組換え酵素は、安息香酸サリチル、サリチルアルデヒド、および2-ヒドロキシ桂皮酸のみをグルコース受容体として受け入れた。ポプラ毛状根培養でCRISPR / Cas9によってUGT71L1遺伝子をノックアウトすると、サリコルチン、トレムラシン、トレムロイジンが完全に失われ、サリシン含有量が部分的に減少しました。これは、UGT71L1が主要なサリシノイドの合成に必要であることを示し、追加の経路がサリシンにつながる可能性があることを示唆しました。UGT78M1のCRISPR / Cas9ノックアウトは成功しなかったため、そのinvivoでの役割はまだ決定されていません。UGT71L1と同様の基質選択性と予測構造を持っていますが、少なくとも根では、サリコルチン、トレムラシン、トレムロイジンの合成に寄与していないようです。サリシノイド生合成の酵素としてのUGT71L1の実証は、この経路の解明のための新しい道を開くでしょう。"]
[118,30538157,"plant","Populus trichocarpa","CRISPR;","AREB1; ADA2b; GCN5","Plant cell","The AREB1 Transcription Factor Influences Histone Acetylation to Regulate Drought Responses and Tolerance in Populus trichocarpa.",2019,"31(3):663-686","[Li S et al.]","Northeast Forestry University, Harbin, China.",30538157,"10.1105/tpc.18.00437 ","Plants develop tolerance to drought by activating genes with altered levels of epigenetic modifications. Specific transcription factors are involved in this activation, but the molecular connections within the regulatory system are unclear. Here, we analyzed genome-wide acetylated lysine residue 9 of histone H3  (H3K9ac) enrichment and examined its association with transcriptomes in Populus trichocarpa under drought stress. We revealed that abscisic acid-Responsive Element (ABRE) motifs in promoters of the drought-responsive genes PtrNAC006, PtrNAC007, and PtrNAC120 are involved in H3K9ac enhancement and activation of these genes. Overexpressing these PtrNAC genes in P trichocarpa resulted in strong drought-tolerance phenotypes. We showed that the ABRE binding protein PtrAREB1-2 binds to ABRE motifs associated with these PtrNAC genes and recruits the histone acetyltransferase unit ADA2b-GCN5, forming AREB1-ADA2b-GCN5 ternary protein complexes. Moreover, this recruitment enables GCN5-mediated histone acetylation to enhance H3K9ac and enrich RNA polymerase II specifically at these  PtrNAC genes for the development of drought tolerance. CRISPR editing or RNA interference-mediated downregulation of any of the ternary members results in highly drought-sensitive P trichocarpa Thus, the combinatorial function of the ternary proteins establishes a coordinated histone acetylation and transcription  factor-mediated gene activation for drought response and tolerance in Populus species.","Populus","植物は、エピジェネティックな修飾のレベルが変化した遺伝子を活性化することにより、干ばつに対する耐性を発達させます。特定の転写因子がこの活性化に関与していますが、調節システム内の分子接続は不明です。ここでは、ヒストンH3（H3K9ac）濃縮のゲノム全体のアセチル化リジン残基9を分析し、干ばつストレス下のPopulustrichocarpaのトランスクリプトームとの関連を調べました。干ばつ応答性遺伝子PtrNAC006、PtrNAC007、およびPtrNAC120のプロモーターのアブシジン酸応答性要素（ABRE）モチーフが、これらの遺伝子のH3K9ac増強および活性化に関与していることを明らかにしました。P trichocarpaでこれらのPtrNAC遺伝子を過剰発現させると、強い干ばつ耐性の表現型が生じました。ABRE結合タンパク質PtrAREB1-2がこれらのPtrNAC遺伝子に関連するABREモチーフに結合し、ヒストンアセチルトランスフェラーゼユニットADA2b-GCN5を動員して、AREB1-ADA2b-GCN5三元タンパク質複合体を形成することを示しました。さらに、この募集により、GCN5を介したヒストンアセチル化がH3K9acを強化し、干ばつ耐性の発達のためにこれらのPtrNAC遺伝子でRNAポリメラーゼIIを特異的に濃縮することができます。CRISPR編集またはRNA干渉を介した三元メンバーのダウンレギュレーションは、干ばつに敏感なP trichocarpaをもたらします。したがって、三元タンパク質の組み合わせ機能は、ポプルスの干ばつ応答と耐性のための協調的なヒストンアセチル化と転写因子を介した遺伝子活性化を確立します。種。"]
[119,31344908,"plant","Populus x canescens; Populus tremula","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","twelve genes, including SOC1, FUL, and their paralogous genes, four NFP-like genes and TOZ19","International journal of molecular sciences","Evaluating the Efficiency of gRNAs in CRISPR/Cas9 Mediated Genome Editing in Poplars.",2019,"20(15)","[Bruegmann T  et al.]","Thuenen Institute of Forest Genetics, Grosshansdorf, Germany.",31344908,"10.3390/ijms20153623 ","CRISPR/Cas9 has become one of the most promising techniques for genome editing in plants and works very well in poplars with an Agrobacterium-mediated transformation system. We selected twelve genes, including SOC1, FUL, and their paralogous genes, four NFP-like genes and TOZ19 for three different research topics. The gRNAs were designed for editing, and, together with a constitutively  expressed Cas9 nuclease, transferred either into the poplar hybrid Populus x canescens or into P. tremula. The regenerated lines showed different types of editing and revealed several homozygous editing events which are of special interest in perennial species because of limited back-cross ability. Through a time series, we could show that despite the constitutive expression of the Cas9 nuclease, no secondary editing of the target region occurred. Thus, constitutive  Cas9 expression does not seem to pose any risk to additional editing events. Based on various criteria, we obtained evidence for a relationship between the structure of gRNA and the efficiency of gene editing. In particular, the GC content, purine residues in the gRNA end, and the free accessibility of the seed  region seemed to be highly important for genome editing in poplars. Based on our  findings on nine different poplar genes, efficient gRNAs can be designed for future efficient editing applications in poplars.","Populus","CRISPR / Cas9は、植物のゲノム編集で最も有望な技術の1つになり、アグロバクテリウムを介した形質転換システムを備えたポプラで非常にうまく機能します。SOC1、FULとそのパラロガス遺伝子、4つのNFP様遺伝子、TOZ19を含む12の遺伝子を、3つの異なる研究トピックに選択しました。gRNAは編集用に設計され、構成的に発現されたCas9ヌクレアーゼとともに、ポプラハイブリッドPopulus xcanescensまたはP.tremulaのいずれかに転送されました。再生された線は、さまざまなタイプの編集を示し、限られたバッククロス能​​力のために多年生種で特に興味深いいくつかのホモ接合編集イベントを明らかにしました。時系列を通じて、Cas9ヌクレアーゼの構成的発現にもかかわらず、標的領域の二次編集が起こらなかったことを示すことができました。したがって、構成的なCas9式は、追加の編集イベントにリスクをもたらすようには見えません。さまざまな基準に基づいて、gRNAの構造と遺伝子編集の効率との関係についての証拠を得ました。特に、GC含有量、gRNA末端のプリン残基、およびシード領域への自由なアクセス可能性は、ポプラのゲノム編集にとって非常に重要であるように思われました。9つの異なるポプラ遺伝子に関する我々の発見に基づいて、ポプラの将来の効率的な編集アプリケーションのために効率的なgRNAを設計することができます。"]
[120,31012023,"plant","potato","CRISPR;Cas9;","coilin","Doklady. Biochemistry and biophysics","Functional Analysis of Coilin in Virus Resistance and Stress Tolerance of Potato  Solanum tuberosum using CRISPR-Cas9 Editing.",2019,"484(1):88-91","[Makhotenko AV et al.]","Doka Gene Technologies Ltd, Moscow oblast, Russia.",31012023,"10.1134/S1607672919010241 ","The role of the nuclear protein coilin in the mechanisms of resistance of potato  Solanum tuberosum cultivar Chicago to biotic and abiotic stresses was studied using the CRISPR-Cas9 technology. For the coilin gene editing, a complex consisting of the Cas9 endonuclease and a short guide RNA was immobilized on gold or chitosan microparticles and delivered into apical meristem cells by bioballistics or vacuum infiltration methods, respectively. Editing at least one  allele of the coilin gene considerably increased the resistance of the edited lines to infection with the potato virus Y and their tolerance to salt and osmotic stress.","potato","ポテトSolanumtuberosum栽培品種シカゴの生物的および非生物的ストレスに対する耐性のメカニズムにおける核タンパク質コイリンの役割は、CRISPR-Cas9技術を使用して研究されました。コイリン遺伝子編集では、Cas9エンドヌクレアーゼとショートガイドRNAからなる複合体を金またはキトサン微粒子に固定化し、それぞれバイオバリスティックス法または真空浸透法によって頂端メリステム細胞に送達しました。コイリン遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子を編集すると、編集した系統のポテトウイルスYの感染に対する耐性と、塩分および浸透圧ストレスに対する耐性が大幅に向上しました。"]
[121,31001300,"plant","potato","CRISPR;Cas9;"," S-RNase (S-locus RNase)","Frontiers in plant science","Overcoming Self-Incompatibility in Diploid Potato Using CRISPR-Cas9.",2019,"10:376","[Enciso-Rodriguez F et al.]","Michigan State University, East Lansing, MI, USA.",31001300,"10.3389/fpls.2019.00376 ","Potato breeding can be redirected to a diploid inbred/F1 hybrid variety breeding  strategy if self-compatibility can be introduced into diploid germplasm. However, the majority of diploid potato clones (Solanum spp.) possess gametophytic self-incompatibility that is primarily controlled by a single multiallelic locus  called the S-locus which is composed of tightly linked genes, S-RNase (S-locus RNase) and multiple SLFs (S-locus F-box proteins), which are expressed in the style and pollen, respectively. Using S-RNase genes known to function in the Solanaceae gametophytic SI mechanism, we identified S-RNase alleles with flower-specific expression in two diploid self-incompatible potato lines using genome resequencing data. Consistent with the location of the S-locus in potato,  we genetically mapped the S-RNase gene using a segregating population to a region of low recombination within the pericentromere of chromosome 1. To generate self-compatible diploid potato lines, a dual single-guide RNA (sgRNA) strategy was used to target conserved exonic regions of the S-RNase gene and generate targeted knockouts (KOs) using a Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) approach. Self-compatibility was achieved in nine S-RNase KO T0 lines which contained bi-allelic and homozygous deletions/insertions in both genotypes, transmitting self compatibility to T1 progeny. This study demonstrates an efficient approach to achieve stable, consistent self-compatibility through S-RNase KO for use in diploid potato breeding approaches.","potato","自己適合性を二倍体生殖質に導入できる場合、ジャガイモ育種は二倍体近交系/ F1ハイブリッド品種育種戦略にリダイレクトすることができます。ただし、二倍体ポテトクローン（Solanum spp。）の大部分は、密接にリンクされた遺伝子であるS-RNase（S-locus RNase）とS-locusで構成されるS-locusと呼ばれる単一の多対立遺伝子座によって主に制御される配偶子母細胞の自己不適合性を持っています。それぞれスタイルと花粉で表現される複数のSLF（S-locus F-boxタンパク質）。Solanaceae配偶子母細胞SIメカニズムで機能することが知られているS-RNase遺伝子を使用して、ゲノムリシーケンシングデータを使用して、2つの二倍体自己不適合ポテト系統で花特異的発現を示すS-RNase対立遺伝子を同定しました。ジャガイモのS遺伝子座の位置と一致して、分離集団を使用してS-RNase遺伝子を染色体1のセントロメア周辺の低組換え領域に遺伝的にマッピングしました。自己適合性の2倍体ジャガイモ系統を生成するために、デュアルシングル-ガイドRNA（sgRNA）戦略を使用して、S-RNase遺伝子の保存されたエキソニック領域をターゲットにし、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート/ CRISPR関連タンパク質9（Cas9）アプローチを使用してターゲットノックアウト（KO）を生成しました。自己適合性は、両方の遺伝子型にバイアレルおよびホモ接合性の欠失/挿入を含み、自己適合性をT1子孫に伝達する9つのS-RNase KOT0系統で達成されました。この研究は、二倍体ポテト育種アプローチで使用するために、S-RNaseKOを介して安定した一貫した自己適合性を達成するための効率的なアプローチを示しています。"]
[122,30800139,"plant","potato","CRISPR;Cas9;Cpf1;TALENs;","Acetolactate synthase1 (ALS1); 5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase1 (EPSPS1); their paralogs","Frontiers in plant science","Evaluation of Methods to Assess in vivo Activity of Engineered Genome-Editing Nucleases in Protoplasts.",2019,"10:110","[Nadakuduti SS et al.]","Michigan State University, East Lansing, MI, USA.",30800139,"10.3389/fpls.2019.00110 ","Genome-editing is being implemented in increasing number of plant species using engineered sequence specific nucleases (SSNs) such as Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated systems (CRISPR/Cas9), Transcription activator like effector nucleases (TALENs), and more recently CRISPR/Cas12a. As the tissue culture and regeneration procedures to generate gene-edited events are time consuming, large-scale screening methodologies that rapidly facilitate validation of genome-editing reagents are critical. Plant protoplast cells provide a rapid platform to validate genome-editing reagents. Protoplast transfection with plasmids expressing genome-editing reagents represents an efficient and cost-effective method to screen for in vivo activity  of genome-editing constructs and resulting targeted mutagenesis. In this study, we compared three existing methods for detection of editing activity, the T7 endonuclease I assay (T7EI), PCR/restriction enzyme (PCR/RE) digestion, and amplicon-sequencing, with an alternative method which involves tagging a double-stranded oligodeoxynucleotide (dsODN) into the SSN-induced double stranded break and detection of on-target activity of gene-editing reagents by PCR and agarose gel electrophoresis. To validate these methods, multiple reagents including TALENs, CRISPR/Cas9 and Cas9 variants, eCas9(1.1) (enhanced specificity) and Cas9-HF1 (high-fidelity1) were engineered for targeted mutagenesis of Acetolactate synthase1 (ALS1), 5-Enolpyruvylshikimate- 3-phosphate synthase1 (EPSPS1) and their paralogs in potato. While all methods detected editing activity, the PCR detection of dsODN integration provided the most straightforward and easiest method to assess on-target activity of the SSN as well as a method for initial qualitative evaluation of the functionality of genome-editing constructs. Quantitative data on mutagenesis frequencies obtained  by amplicon-sequencing of ALS1 revealed that the mutagenesis frequency of CRISPR/Cas9 reagents is better than TALENs. Context-based choice of method for evaluation of gene-editing reagents in protoplast systems, along with advantages  and limitations associated with each method, are discussed.","potato","ゲノム編集は、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート/ CRISPR関連システム（CRISPR / Cas9）、エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）などの転写活性化因子などの操作された配列特異的ヌクレアーゼ（SSN）を使用して、ますます多くの植物種で実装されています。最近CRISPR / Cas12a。遺伝子編集イベントを生成するための組織培養および再生手順には時間がかかるため、ゲノム編集試薬の検証を迅速に容易にする大規模なスクリーニング方法が重要です。植物プロトプラスト細胞は、ゲノム編集試薬を検証するための迅速なプラットフォームを提供します。ゲノム編集試薬を発現するプラスミドによるプロトプラストトランスフェクションは、ゲノム編集コンストラクトのinvivo活性とその結果としての標的突然変異誘発をスクリーニングするための効率的で費用効果の高い方法です。この研究では、編集活動を検出するための3つの既存の方法、T7エンドヌクレアーゼIアッセイ（T7EI）、PCR /制限酵素（PCR / RE）消化、およびアンプリコンシーケンスを、ダブルタグ付けを含む代替方法と比較しました。鎖状オリゴデオキシヌクレオチド（dsODN）をSSN誘導二本鎖切断に挿入し、PCRおよびアガロースゲル電気泳動による遺伝子編集試薬の標的活性の検出。これらの方法を検証するために、TALEN、CRISPR / Cas9およびCas9バリアント、eCas9（1.1）（強化された特異性）およびCas9-HF1（高忠実度1）を含む複数の試薬を、アセトラクテートシンターゼ1（ALS1）、5-エノールピルビルシキメートの標的突然変異誘発のために設計しました。ジャガイモの3-リン酸シンターゼ1（EPSPS1）とそのパラログ。すべての方法で編集アクティビティが検出されましたが、dsODN統合のPCR検出は、SSNのオンターゲットアクティビティを評価するための最も簡単で簡単な方法と、ゲノム編集コンストラクトの機能を最初に定性的に評価する方法を提供しました。ALS1のアンプリコンシーケンシングによって得られた突然変異誘発頻度に関する定量的データは、CRISPR / Cas9試薬の突然変異誘発頻度がTALENよりも優れていることを明らかにしました。プロトプラストシステムにおける遺伝子編集試薬の評価のための方法のコンテキストベースの選択、および各方法に関連する利点と制限について説明します。"]
[123,31768118,"plant","potato","agroinfiltration;TALENs","SSR2","Plant biotechnology","Efficient genome engineering using Platinum TALEN in potato.",2019,"36(3):167-173","[Yasumoto S et al.]","Osaka University, Suita, Osaka, Japan.",31768118,"10.5511/plantbiotechnology.19.0805a ","Potato (Solanum tuberosum) is one of the most important crops in the world. However, it is generally difficult to breed a new variety of potato crops because they are highly heterozygous tetraploid. Steroidal glycoalkaloids (SGAs) such as  alpha-solanine and alpha-chaconine found in potato are antinutritional specialized metabolites. Because of their toxicity following intake, controlling  the SGA levels in potato varieties is critical in breeding programs. Recently, genome-editing technologies using artificial site-specific nucleases such as TALEN and CRISPR-Cas9 have been developed and used in plant sciences. In the present study, we developed a highly active Platinum TALEN expression vector construction system, and applied to reduce the SGA contents in potato. Using Agrobacterium-mediated transformation, we obtained three independent transgenic potatoes harboring the TALEN expression cassette targeting SSR2 gene, which encodes a key enzyme for SGA biosynthesis. Sequencing analysis of the target sequence indicated that all the transformants could be SSR2-knockout mutants. Reduced SGA phenotype in the mutants was confirmed by metabolic analysis using LC-MS. In vitro grown SSR2-knockout mutants exhibited no differences in morphological phenotype or yields when compared with control plants, indicating that the genome editing of SGA biosynthetic genes such as SSR2 could be a suitable strategy for controlling the levels of toxic metabolites in potato. Our  simple and powerful plant genome-editing system, developed in the present study,  provides an important step for future study in plant science.","potato","ポテト（Solanum tuberosum）は、世界で最も重要な作物の1つです。しかしながら、それらは高度にヘテロ接合性の四倍体であるため、一般に、新しい種類のジャガイモ作物を育種することは困難です。ジャガイモに含まれるアルファソラニンやアルファシャコニンなどのステロイド性糖アルカロイド（SGA）は、抗栄養に特化した代謝物です。摂取後の毒性のため、ジャガイモ品種のSGAレベルを制御することは育種プログラムにおいて重要です。最近、TALENやCRISPR-Cas9などの人工部位特異的ヌクレアーゼを使用したゲノム編集技術が開発され、植物科学で使用されています。本研究では、高活性プラチナTALEN発現ベクター構築システムを開発し、ジャガイモのSGA含有量を低減するために適用しました。アグロバクテリウムを介した形質転換を使用して、SGA生合成の重要な酵素をコードするSSR2遺伝子を標的とするTALEN発現カセットを含む3つの独立したトランスジェニックポテトを入手しました。標的配列の配列分析は、すべての形質転換体がSSR2ノックアウト変異体である可能性があることを示した。変異体におけるSGA表現型の低下は、LC-MSを使用した代謝分析によって確認されました。インビトロで増殖したSSR2ノックアウト変異体は、対照植物と比較した場合、形態学的表現型または収量に差を示さず、SSR2などのSGA生合成遺伝子のゲノム編集がジャガイモの毒性代謝物のレベルを制御するための適切な戦略である可能性があることを示しています。本研究で開発された当社のシンプルで強力な植物ゲノム編集システムは、植物科学における将来の研究のための重要なステップを提供します。"]
[124,31033104,"plant","potato","agroinfiltration;Cas9;","starch-branching enzymes (SBE1; SBE2)","Plant biotechnology journal","Cas9-mediated mutagenesis of potato starch-branching enzymes generates a range of tuber starch phenotypes.",2019,"17(12):2259-2271","[Tuncel A et al.]","John Innes Centre, Norwich, UK.",31033104,"10.1111/pbi.13137 ","We investigated whether Cas9-mediated mutagenesis of starch-branching enzymes (SBEs) in tetraploid potatoes could generate tuber starches with a range of distinct properties. Constructs containing the Cas9 gene and sgRNAs targeting SBE1, SBE2 or both genes were introduced by Agrobacterium-mediated transformation or by PEG-mediated delivery into protoplasts. Outcomes included lines with mutations in all or only some of the homoeoalleles of SBE genes and lines in which homoeoalleles carried several different mutations. DNA delivery into protoplasts resulted in mutants with no detectable Cas9 gene, suggesting the absence of foreign DNA. Selected mutants with starch granule abnormalities had reductions in tuber SBE1 and/or SBE2 protein that were broadly in line with expectations from genotype analysis. Strong reduction in both SBE isoforms created an extreme starch phenotype, as reported previously for low-SBE potato tubers. HPLC-SEC and (1) H NMR revealed a decrease in short amylopectin chains, an increase in long chains and a large reduction in branching frequency relative  to wild-type starch. Mutants with strong reductions in SBE2 protein alone had near-normal amylopectin chain-length distributions and only small reductions in branching frequency. However, starch granule initiation was enormously increased: cells contained many granules of <4 mum and granules with multiple hila. Thus, large reductions in both SBEs reduce amylopectin branching during granule growth, whereas reduction in SBE2 alone primarily affects numbers of starch granule initiations. Our results demonstrate that Cas9-mediated mutagenesis of SBE genes  has the potential to generate new, potentially valuable starch properties without integration of foreign DNA into the genome.","potato","四倍体ポテトにおけるデンプン分岐酵素（SBE）のCas9を介した突然変異誘発が、さまざまな異なる特性を持つ塊茎デンプンを生成できるかどうかを調査しました。Cas9遺伝子とSBE1、SBE2、または両方の遺伝子を標的とするsgRNAを含むコンストラクトは、アグロバクテリウムを介した形質転換またはPEGを介したプロトプラストへの送達によって導入されました。結果には、SBE遺伝子のホモエオアレルのすべてまたは一部のみに変異がある系統と、ホモエオアレルがいくつかの異なる変異を持っている系統が含まれていました。プロトプラストへのDNA送達は、検出可能なCas9遺伝子を持たない変異体をもたらし、外来DNAが存在しないことを示唆しています。デンプン粒の異常を伴う選択された変異体は、遺伝子型分析からの期待と概ね一致した塊茎SBE1および/またはSBE2タンパク質の減少を示した。低SBEジャガイモ塊茎について以前に報告されたように、両方のSBEアイソフォームの強い減少は極端なデンプン表現型を生み出しました。HPLC-SECおよび（1）H NMRは、野生型デンプンと比較して、短いアミロペクチン鎖の減少、長鎖の増加、および分岐頻度の大幅な減少を明らかにしました。SBE2タンパク質のみが大幅に減少した変異体は、ほぼ正常なアミロペクチン鎖長分布を示し、分岐頻度はわずかに減少しました。しかし、デンプン粒の開始は非常に増加しました。細胞には、4 m未満の顆粒が多数含まれ、複数のヒラを持つ顆粒が含まれていました。したがって、両方のSBEが大幅に減少すると、顆粒成長中のアミロペクチンの分岐が減少しますが、SBE2のみが減少すると、主にデンプン顆粒の開始数に影響します。私たちの結果は、Cas9を介したSBE遺伝子の突然変異誘発が、外来DNAをゲノムに組み込むことなく、新しい、潜在的に価値のあるデンプン特性を生成する可能性があることを示しています。"]
[125,30803101,"plant","potato","CRISPR;"," ","Plant biotechnology journal","Generation of virus-resistant potato plants by RNA genome targeting.",2019,"17(9):1814-1822","[Zhan X et al.]","Hubei University, Wuhan, China.",30803101,"10.1111/pbi.13102 ","CRISPR/Cas systems provide bacteria and archaea with molecular immunity against invading phages and foreign plasmids. The class 2 type VI CRISPR/Cas effector Cas13a is an RNA-targeting CRISPR effector that provides protection against RNA phages. Here we report the repurposing of CRISPR/Cas13a to protect potato plants  from a eukaryotic virus, Potato virus Y (PVY). Transgenic potato lines expressing Cas13a/sgRNA (small guide RNA) constructs showed suppressed PVY accumulation and  disease symptoms. The levels of viral resistance correlated with the expression levels of the Cas13a/sgRNA construct in the plants. Our data further demonstrate  that appropriately designed sgRNAs can specifically interfere with multiple PVY strains, while having no effect on unrelated viruses such as PVA or Potato virus  S. Our findings provide a novel and highly efficient strategy for engineering crops with resistances to viral diseases.","potato","CRISPR / Casシステムは、細菌や古細菌に侵入するファージや外来プラスミドに対する分子免疫を提供します。クラス2タイプVICRISPR / CasエフェクターCas13aは、RNAファージに対する保護を提供するRNAターゲティングCRISPRエフェクターです。ここでは、真核生物ウイルスであるポテトウイルスY（PVY）からジャガイモ植物を保護するためのCRISPR / Cas13aの転用について報告します。Cas13a / sgRNA（スモールガイドRNA）コンストラクトを発現するトランスジェニックポテトラインは、抑制されたPVY蓄積と疾患症状を示しました。ウイルス耐性のレベルは、植物におけるCas13a / sgRNAコンストラクトの発現レベルと相関していました。私たちのデータはさらに、適切に設計されたsgRNAが、PVAやポテトウイルスSなどの無関係なウイルスには影響を与えずに、複数のPVY株に特異的に干渉できることを示しています。"]
[126,31776399,"plant","potato","CRISPR;Cas9;","granular bound starch synthase gene","Scientific reports","High efficacy full allelic CRISPR/Cas9 gene editing in tetraploid potato.",2019,"9(1):17715","[Johansen IE et al.]","University of Copenhagen, Frederiksberg, Denmark.",31776399,"10.1038/s41598-019-54126-w ","CRISPR/Cas9 editing efficacies in tetraploid potato were highly improved through  the use of endogenous potato U6 promoters. Highly increased editing efficiencies  in the Granular Bound Starch Synthase gene at the protoplast level were obtained  by replacement of the Arabidopsis U6 promotor, driving expression of the CRISPR component, with endogenous potato U6 promotors. This translated at the ex-plant level into 35% full allelic gene editing. Indel Detection Amplicon Analysis was established as an efficient tool for fast assessment of gene editing in complex genomes, such as potato. Together, this warrants significant reduction of laborious cell culturing, ex-plant regeneration and screening procedures of plants with high complexity genomes.","potato","四倍体ジャガイモにおけるCRISPR / Cas9編集効率は、内因性ジャガイモU6プロモーターの使用により大幅に改善されました。プロトプラストレベルでのGranularBound Starch Synthase遺伝子の編集効率の大幅な向上は、CRISPRコンポーネントの発現を促進するArabidopsis U6プロモーターを、内因性ポテトU6プロモーターに置き換えることで得られました。これは、植物外レベルで35％の完全な対立遺伝子編集に変換されました。Indel Detection Amplicon Analysisは、ジャガイモなどの複雑なゲノムにおける遺伝子編集を迅速に評価するための効率的なツールとして確立されました。一緒に、これは、面倒な細胞培養、植物外再生、および高度に複雑なゲノムを有する植物のスクリーニング手順の大幅な削減を保証します。"]
[127,31101972,"plant","potato (Solanum tuberosum)","CRISPR;Cas9;","GBSSI","Plant cell reports","The Solanum tuberosum GBSSI gene: a target for assessing gene and base editing in tetraploid potato.",2019,"38(9):1065-1080","[Veillet F  et al.]","INRA, Universite Rennes 1, Ploudaniel, France.",31101972,"10.1007/s00299-019-02426-w ","KEY MESSAGE: The StGBSSI gene was successfully and precisely edited in the tetraploid potato using gene and base-editing strategies, leading to plants with  impaired amylose biosynthesis. Genome editing has recently become a method of choice for basic research and functional genomics, and holds great potential for  molecular plant-breeding applications. The powerful CRISPR-Cas9 system that typically produces double-strand DNA breaks is mainly used to generate knockout mutants. Recently, the development of base editors has broadened the scope of genome editing, allowing precise and efficient nucleotide substitutions. In this  study, we produced mutants in two cultivated elite cultivars of the tetraploid potato (Solanum tuberosum) using stable or transient expression of the CRISPR-Cas9 components to knock out the amylose-producing StGBSSI gene. We set up a rapid, highly sensitive and cost-effective screening strategy based on high-resolution melting analysis followed by direct Sanger sequencing and trace chromatogram analysis. Most mutations consisted of small indels, but unwanted insertions of plasmid DNA were also observed. We successfully created tetra-allelic mutants with impaired amylose biosynthesis, confirming the loss of  function of the StGBSSI protein. The second main objective of this work was to demonstrate the proof of concept of CRISPR-Cas9 base editing in the tetraploid potato by targeting two loci encoding catalytic motifs of the StGBSSI enzyme. Using a cytidine base editor (CBE), we efficiently and precisely induced DNA substitutions in the KTGGL-encoding locus, leading to discrete variation in the amino acid sequence and generating a loss-of-function allele. The successful application of base editing in the tetraploid potato opens up new avenues for genome engineering in this species.","potato (Solanum tuberosum)","重要なメッセージ：StGBSSI遺伝子は、遺伝子および塩基編集戦略を使用して4倍体ポテトで正常かつ正確に編集され、アミロース生合成が損なわれた植物につながりました。ゲノム編集は、最近、基礎研究および機能的ゲノミクスの選択方法になり、分子植物育種アプリケーションに大きな可能性を秘めています。通常、二本鎖DNA切断を生成する強力なCRISPR-Cas9システムは、主にノックアウト変異体を生成するために使用されます。最近、ベースエディタの開発により、ゲノム編集の範囲が広がり、正確で効率的なヌクレオチド置換が可能になりました。この研究では、CRISPR-Cas9成分の安定的または一過性の発現を使用してアミロース産生StGBSSI遺伝子をノックアウトし、4倍体ジャガイモ（Solanum tuberosum）の2つの栽培エリート品種で変異体を作製しました。高分解能融解分析とそれに続く直接サンガーシーケンシングおよびトレースクロマトグラム分析に基づいて、迅速で高感度で費用効果の高いスクリーニング戦略を設定しました。ほとんどの変異は小さなインデルで構成されていましたが、プラスミドDNAの不要な挿入も観察されました。我々は、アミロース生合成が損なわれたテトラアレリック変異体の作成に成功し、StGBSSIタンパク質の機能の喪失を確認しました。この作業の2番目の主な目的は、StGBSSI酵素の触媒モチーフをコードする2つの遺伝子座をターゲットにすることにより、4倍体ポテトにおけるCRISPR-Cas9ベース編集の概念の証明を実証することでした。シチジンベースエディター（CBE）を使用して、KTGGLをコードする遺伝子座に効率的かつ正確にDNA置換を誘導し、アミノ酸配列に個別の変動をもたらし、機能喪失型対立遺伝子を生成しました。四倍体ポテトでの塩基編集の適用の成功は、この種のゲノム工学の新しい道を切り開きます。"]
[128,31998338,"plant","potato (Solanum tubersoum L.)","CRISPR;Cas9;","StPPO2","Frontiers in plant science","Reduced Enzymatic Browning in Potato Tubers by Specific Editing of a Polyphenol Oxidase Gene via Ribonucleoprotein Complexes Delivery of the CRISPR/Cas9 System.",2019,"10:1649","[Gonzalez MN et al.]","Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas (CONICET), Buenos Aires, Argentina.",31998338,"10.3389/fpls.2019.01649 ","Polyphenol Oxidases (PPOs) catalyze the conversion of phenolic substrates to quinones, leading to the formation of dark-colored precipitates in fruits and vegetables. This process, known as enzymatic browning, is the cause of undesirable changes in organoleptic properties and the loss of nutritional quality in plant-derived products. In potato (Solanum tubersoum L.), PPOs are encoded by a multi-gene family with different expression patterns. Here, we have  studied the application of the CRISPR/Cas9 system to induce mutations in the StPPO2 gene in the tetraploid cultivar Desiree. We hypothesized that the specific editing of this target gene would result in a lower PPO activity in the tuber with the consequent reduction of the enzymatic browning. Ribonucleoprotein complexes (RNPs), formed by two sgRNAs and Cas9 nuclease, were transfected to potato protoplasts. Up to 68% of regenerated plants contained mutations in at least one allele of the target gene, while 24% of edited lines carried mutations  in all four alleles. No off-target mutations were identified in other analyzed StPPO genes. Mutations induced in the four alleles of StPPO2 gene, led to lines with a reduction of up to 69% in tuber PPO activity and a reduction of 73% in enzymatic browning, compared to the control. Our results demonstrate that the CRISPR/Cas9 system can be applied to develop potato varieties with reduced enzymatic browning in tubers, by the specific editing of a single member of the StPPO gene family.","potato (Solanum tubersoum L.)","ポリフェノールオキシダーゼ（PPO）は、フェノール性基質のキノンへの変換を触媒し、果物や野菜に暗色の沈殿物を形成します。酵素的褐変として知られるこのプロセスは、官能特性の望ましくない変化と植物由来製品の栄養価の低下の原因です。ジャガイモ（Solanum tubersoum L.）では、PPOは異なる発現パターンを持つ複数遺伝子ファミリーによってコード化されています。ここでは、CRISPR / Cas9システムを適用して4倍体品種DesireeのStPPO2遺伝子に変異を誘導することを研究しました。この標的遺伝子の特定の編集により、塊茎のPPO活性が低下し、その結果、酵素による褐変が減少すると仮定しました。2つのsgRNAとCas9ヌクレアーゼによって形成されたリボ核タンパク質複合体（RNP）を、ジャガイモのプロトプラストにトランスフェクトしました。再生された植物の最大68％は、標的遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子に変異を含んでいましたが、編集された系統の24％は、4つの対立遺伝子すべてに変異を持っていました。他の分析されたStPPO遺伝子では、オフターゲット変異は確認されませんでした。StPPO2遺伝子の4つの対立遺伝子に誘発された変異は、対照と比較して、塊茎PPO活性が最大69％減少し、酵素的褐変が73％減少した系統をもたらしました。私たちの結果は、CRISPR / Cas9システムを適用して、StPPO遺伝子ファミリーの単一メンバーを特定に編集することにより、塊茎の酵素的褐変を低減したジャガイモ品種を開発できることを示しています。"]
[129,31290978,"plant","pumpkin","CRISPR;Cas9;","respiratory burst oxidase homolog D (RBOHD)","Journal of experimental botany","Tissue-specific respiratory burst oxidase homolog-dependent H2O2 signaling to the plasma membrane H+-ATPase confers potassium uptake and salinity tolerance in Cucurbitaceae.",2019,"70(20):5879-5893","[Huang Y et al.]","Huazhong Agricultural University and Key Laboratory of Horticultural Plant Biology, Ministry of Education, Wuhan,  China.",31290978,"10.1093/jxb/erz328 ","Potassium (K+) is a critical determinant of salinity tolerance, and H2O2 has been recognized as an important signaling molecule that mediates many physiological responses. However, the details of how H2O2 signaling regulates K+ uptake in the  root under salt stress remain elusive. In this study, salt-sensitive cucumber and salt-tolerant pumpkin which belong to the same family, Cucurbitaceae, were used to answer the above question. We show that higher salt tolerance in pumpkin was related to its superior ability for K+ uptake and higher H2O2 accumulation in the root apex. Transcriptome analysis showed that salinity induced 5816 (3005 up- and 2811 down-) and 4679 (3965 up- and 714 down-) differentially expressed genes (DEGs) in cucumber and pumpkin, respectively. DEGs encoding NADPH oxidase (respiratory burst oxidase homolog D; RBOHD), 14-3-3 protein (GRF12), plasma membrane H+-ATPase (AHA1), and potassium transporter (HAK5) showed higher expression in pumpkin than in cucumber under salinity stress. Treatment with the  NADPH oxidase inhibitor diphenylene iodonium resulted in lower RBOHD, GRF12, AHA1, and HAK5 expression, reduced plasma membrane H+-ATPase activity, and lower  K+ uptake, leading to a loss of the salinity tolerance trait in pumpkin. The opposite results were obtained when the plants were pre-treated with exogenous H2O2. Knocking out of RBOHD in pumpkin by CRISPR/Cas9 [clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9] editing of coding sequences resulted in lower root apex H2O2 and K+ content and GRF12, AHA1, and HAK5 expression, ultimately resulting in a salt-sensitive phenotype. However, ectopic expression of pumpkin RBOHD in Arabidopsis led to the opposite effect. Taken together, this study shows that RBOHD-dependent H2O2 signaling in the root apex is important for pumpkin salt tolerance and suggests a novel mechanism that confers this trait, namely RBOHD-mediated transcriptional and post-translational activation of plasma membrane H+-ATPase operating upstream of HAK5 K+ uptake transporters.","pumpkin","カリウム（K +）は耐塩性の重要な決定要因であり、H2O2は多くの生理学的反応を媒介する重要なシグナル伝達分子として認識されています。ただし、H2O2シグナル伝達が塩ストレス下で根のK +取り込みをどのように調節するかについての詳細はとらえどころのないままです。この研究では、同じ科であるウリ科に属する耐塩性キュウリと耐塩性カボチャを使用して、上記の質問に答えました。カボチャの耐塩性が高いことは、K +の取り込み能力と根尖でのH2O2の蓄積が優れていることに関連していることを示しています。トランスクリプトーム解析では、塩分がキュウリとカボチャでそれぞれ5816（3005アップと2811ダウン）と4679（3965アップと714ダウン）の差次的発現遺伝子（DEG）を誘導することが示されました。NADPHオキシダーゼ（呼吸バーストオキシダーゼホモログD; RBOHD）、14-3-3タンパク質（GRF12）、原形質膜H + -ATPase（AHA1）、およびカリウムトランスポーター（HAK5）をコードするDEGは、塩分ストレス下のキュウリよりもカボチャで高い発現を示しました。NADPHオキシダーゼ阻害剤であるジフェニレンヨードニウムで処理すると、RBOHD、GRF12、AHA1、およびHAK5の発現が低下し、原形質膜のH + -ATPase活性が低下し、K +の取り込みが低下し、カボチャの耐塩性が失われました。植物を外因性H2O2で前処理した場合、反対の結果が得られました。CRISPR / Cas9 [クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9]によるカボチャのRBOHDのノックアウトコーディング配列の編集により、根尖のH2O2とK +の含有量が低くなり、最終的にGRF12、AHA1、HAK5の発現が生じました。塩分に敏感な表現型をもたらします。しかし、アラビドプシスにおけるカボチャRBOHDの異所性発現は、反対の効果をもたらしました。まとめると、この研究は、根尖におけるRBOHD依存性H2O2シグナル伝達がカボチャの耐塩性にとって重要であることを示し、この特性を与える新しいメカニズム、すなわち上流で動作する原形質膜H + -ATPaseのRBOHDを介した転写および翻訳後の活性化を示唆していますHAK5 K +取り込みトランスポーターの。"]
[130,31002444,"plant","red rice","CRISPR;Cas9;","red coloration gene (Rc)","Plant biotechnology journal","CRISPR/Cas9-mediated functional recovery of the recessive rc allele to develop red rice.",2019,"17(11):2096-2105","[Zhu Y et al.]","Xiamen University, Xiamen, China.",31002444,"10.1111/pbi.13125 ","Red rice contains high levels of proanthocyanidins and anthocyanins, which have been recognized as health-promoting nutrients. The red coloration of rice grains  is controlled by two complementary genes, Rc and Rd. The RcRd genotype produces red pericarp in wild species Oryza rufipogon, whereas most cultivated rice varieties produce white grains resulted from a 14-bp frame-shift deletion in the  seventh exon of the Rc gene. In the present study, we developed a CRISPR/Cas9-mediated method to functionally restore the recessive rc allele through reverting the 14-bp frame-shift deletion to in-frame mutations in which the deletions were in multiples of three bases, and successfully converted three  elite white pericarp rice varieties into red ones. Rice seeds from T1 in-frame Rc lines were measured for proanthocyanidins and anthocyanidins, and high accumulation levels of proanthocyanidins and anthocyanidins were observed in red  grains from the mutants. Moreover, there was no significant difference between wild-type and in-frame Rc mutants in major agronomic traits, indicating that restoration of Rc function had no negative effect on important agronomic traits in rice. Given that most white pericarp rice varieties are resulted from the 14-bp deletion in Rc, it is conceivable that our method could be applied to most  white pericarp rice varieties and would greatly accelerate the breeding of new red rice varieties with elite agronomic traits. In addition, our study demonstrates an effective approach to restore recessive frame-shift alleles for crop improvement.","rice","赤米には、健康増進栄養素として認められているプロアントシアニジンやアントシアニンが多く含まれています。米粒の赤色は、2つの相補的な遺伝子RcとRdによって制御されています。RcRd遺伝子型は、野生種Oryza rufipogonで赤い果皮を生成しますが、ほとんどの栽培米品種は、Rc遺伝子の7番目のエキソンの14bpフレームシフト欠失から生じる白い粒子を生成します。本研究では、CRISPR / Cas9を介した方法を開発し、14 bpのフレームシフト欠失を3塩基の倍数であるインフレーム変異に戻すことで、劣性rc対立遺伝子を機能的に復元し、正常に変換しました。 3つのエリート白果皮米品種を赤いものに。T1インフレームRc系統からの米の種子は、プロアントシアニジンとアントシアニジンについて測定され、プロアントシアニジンとアントシアニジンの高い蓄積レベルが変異体からの赤い粒で観察されました。さらに、主要な農業形質において野生型とインフレームのRc変異体の間に有意差はなく、Rc機能の回復がイネの重要な農業形質に悪影響を及ぼさなかったことを示しています。ほとんどの白果皮米品種はRcの14bpの欠失に起因することを考えると、私たちの方法はほとんどの白果皮米品種に適用でき、エリート農業特性を持つ新しい赤米品種の繁殖を大幅に加速すると考えられます。さらに、私たちの研究は、作物改良のために劣性フレームシフト対立遺伝子を回復するための効果的なアプローチを示しています。"]
[131,31192079,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","proline-rich protein (OsPRP1)","3 Biotech","Knockout of OsPRP1, a gene encoding proline-rich protein, confers enhanced cold sensitivity in rice (Oryza sativa L.) at the seedling stage.",2019,"9(7):254","[Nawaz G et al.]","Guangxi University, Nanning, China.",31192079,"10.1007/s13205-019-1787-4 ","Proline-rich proteins (PRPs) play multiple physiological and biochemical roles in plant growth and stress response. In this study, we reported that the knockout of OsPRP1 induced cold sensitivity in rice. Mutant plants were generated by CRISPR/Cas9 technology to investigate the role of OsPRP1 in cold stress and 26 mutant plants were obtained in T0 generation with the mutation rate of 85% including 15% bi-allelic, 53.3% homozygous, and 16.7% heterozygous and 16 T-DNA-free lines in T1 generation. The conserved amino acid sequence was changed  and the expression level of OsPRP1 was reduced in mutant plants. The OsPRP1 mutant plants displayed more sensitivity to cold stress and showed low survival rate with decreased root biomass than wild-type (WT) and homozygous mutant line with large fragment deletion was more sensitive to low temperature. Mutant lines  accumulated less antioxidant enzyme activity and lower levels of proline, chlorophyll, abscisic acid (ABA), and ascorbic acid (AsA) content relative to WT  under low-temperature stress. The changes of antioxidant enzymes were examined in the leaves and roots with exogenous salicylic acid (SA) treatment which resulted  in increased activity of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD), and catalase (CAT) under cold stress, while enzyme antioxidant activity was lower in  untreated seedlings which showed that exogenous SA pretreatment could alleviate the low-temperature stress in rice. Furthermore, the expression of three genes encoding antioxidant enzyme activities (SOD4, POX1, and OsCAT3) was significantly down-regulated in the mutant lines as compared to WT. These results suggested that OsPRP1 enhances cold tolerance by modulating antioxidants and maintaining cross talk through signaling pathways. Therefore, OsPRP1 gene could be exploited  for improving cold tolerance in rice and CRISPR/Cas9 technology is helpful to study the function of a gene by analyzing the phenotypes of knockout mutants generated.","rice","プロリンリッチタンパク質（PRP）は、植物の成長とストレス応答において複数の生理学的および生化学的役割を果たします。この研究では、OsPRP1のノックアウトが米の寒冷感受性を誘発したことを報告しました。変異植物は、低温ストレスにおけるOsPRP1の役割を調査するために、CRISPR / Cas9テクノロジーによって生成され、26の変異植物がT0生成で得られ、変異率は85％で、15％のバイアレル、53.3％のホモ接合、16.7％のヘテロ接合とT1世代の16のT-DNAフリー系統。保存されたアミノ酸配列が変更され、OsPRP1の発現レベルが変異植物で減少した。OsPRP1変異体植物は、低温ストレスに対してより感受性を示し、野生型（WT）よりも根のバイオマスが減少し、生存率が低く、大きな断片が欠失したホモ接合変異株は低温に対してより感受性が高かった。変異株は、低温ストレス下のWTと比較して、抗酸化酵素活性が低く、プロリン、クロロフィル、アブシジン酸（ABA）、およびアスコルビン酸（AsA）の含有量が低かった。外因性サリチル酸（SA）処理により、葉と根の抗酸化酵素の変化を調べたところ、低温ストレス下でスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、ペルオキシダーゼ（POD）、カタラーゼ（CAT）の活性が増加し、酵素抗酸化活性が得られました。未処理の苗木では低く、外因性のSA前処理が米の低温ストレスを軽減できることを示しました。さらに、抗酸化酵素活性をコードする3つの遺伝子（SOD4、POX1、およびOsCAT3）の発現は、WTと比較して変異株で有意にダウンレギュレートされました。これらの結果は、OsPRP1が抗酸化物質を調節し、シグナル伝達経路を介してクロストークを維持することにより、耐寒性を高めることを示唆しています。したがって、OsPRP1遺伝子は米の耐寒性を改善するために利用でき、CRISPR / Cas9テクノロジーは、生成されたノックアウト変異体の表現型を分析することによって遺伝子の機能を研究するのに役立ちます。"]
[132,30944805,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","3 loci","3 Biotech","Dual-targeting by CRISPR/Cas9 leads to efficient point mutagenesis but only rare  targeted deletions in the rice genome.",2019,"9(4):158","[Pathak B et al.]","University of Arkansas, Fayetteville, AR, USA.",30944805,"10.1007/s13205-019-1690-z ","The present study investigated the efficiency of CRISPR/Cas9 in creating genomic  deletions as the basis of its application in removing selection marker genes or the intergenic regions. Three loci, representing a transgene and two rice genes,  were targeted at two sites each, in separate experiments, and the deletion of the defined fragments was investigated by PCR and sequencing. Genomic deletions were  found at a low rate among the transformed callus lines that could be isolated, cultured, and regenerated into plants harboring the deletion. However, randomly regenerated plants showed mixed genomic effects, and generally did not harbor heritable genomic deletions. To determine whether point mutations occurred at each targeted site, a total of 114 plants consisting of primary transgenic lines  and their progeny were analyzed. Ninety-three plants showed targeting, 60 of which were targeted at both sites. The presence of point mutations at both sites  was correlated with the guide RNA efficiency. In summary, genomic deletions through dual-targeting by the paired-guide RNAs were generally observed in callus, while de novo point mutations at one or both sites occurred at high rates in transgenic plants and their progeny, generating a variety of insertion-deletions or single-nucleotide variations. In this study, point mutations were exceedingly favored over genomic deletions; therefore, for the recovery of plant lines harboring targeted deletions, identifying early transformed clones harboring the deletions, and isolating them for plant regeneration is recommended.","rice","本研究では、選択マーカー遺伝子または遺伝子間領域の除去におけるアプリケーションの基礎として、ゲノム欠失の作成におけるCRISPR / Cas9の効率を調査しました。トランスジーンと2つのイネ遺伝子を表す3つの遺伝子座は、別々の実験でそれぞれ2つの部位を標的とし、定義されたフラグメントの削除はPCRとシーケンシングによって調査されました。ゲノムの欠失は、単離され、培養され、そして欠失を有する植物に再生され得る形質転換されたカルス系統の間で低率で発見された。しかし、ランダムに再生された植物は混合ゲノム効果を示し、一般的に遺伝性のゲノム欠失を持っていませんでした。各標的部位で点突然変異が起こったかどうかを決定するために、一次トランスジェニック系統およびそれらの子孫からなる合計114の植物を分析した。93の植物が標的を示し、そのうち60は両方の部位を標的とした。両方の部位での点変異の存在は、ガイドRNAの効率と相関していた。要約すると、ペアガイドRNAによるデュアルターゲティングによるゲノム欠失は一般にカルスで観察されましたが、一方または両方の部位での新規点変異はトランスジェニック植物とその子孫で高率に発生し、さまざまな挿入欠失または単一ヌクレオチドのバリエーション。この研究では、点突然変異はゲノム欠失よりも非常に好まれていました。したがって、標的欠失を含む植物系統の回復には、欠失を含む初期の形質転換クローンを同定し、それらを植物再生のために単離することが推奨される。"]
[133,31877655,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","FLN2","Biomolecules","The Tolerance of Salinity in Rice Requires the Presence of a Functional Copy of FLN2.",2019,"10(1)","[Chen G et al.]","China National Rice Research Institute, Hangzhou, China.",31877655,"10.3390/biom10010017 ","A panel of ethane-methyl-sulfonate-mutagenized japonica rice lines was grown in the presence of salinity in order to identify genes required for the expression of salinity tolerance. A highly nontolerant selection proved to harbor a mutation in FLN2, a gene which encodes fructokinase-like protein2. Exposure of wild-type rice to salinity up-regulated FLN2, while a CRISPR/Cas9-generated FLN2 knockout line was hypersensitive to the stress. Both ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase activity and the abundance of the transcript generated by a number of genes encoding components of sucrose synthesis were lower in the knockout line than in wild-type plants' leaves, while the sucrose contents of the leaf and root were, respectively, markedly increased and decreased. That sugar partitioning to the roots was impaired in FLN2 knockout plants was confirmed by the observation that several genes involved in carbon transport were down-regulated in both the leaf and in the leaf sheath. The levels of sucrose synthase, acid invertase, and neutral invertase activity were distinctly lower in the knockout plants' roots than in those of wild-type plants, particularly when the plants were exposed to salinity stress. The compromised salinity tolerance exhibited by the FLN2 knockout plants was likely a consequence of an inadequate supply of the assimilate required to support growth, a problem which was rectifiable by providing an exogenous supply of sucrose. The conclusion was that  FLN2, on account of its influence over sugar metabolism, is important in the context of seedling growth and the rice plant's response to salinity stress.","rice","耐塩性の発現に必要な遺伝子を同定するために、エタン-メチル-スルホネート-変異誘発ジャポニカ米系統のパネルを塩分の存在下で成長させた。非常に非耐性の選択は、フルクトキナーゼ様タンパク質2をコードする遺伝子であるFLN2に変異があることが証明されました。野生型イネの塩分アップレギュレートされたFLN2への曝露は、CRISPR / Cas9で生成されたFLN2ノックアウトラインがストレスに対して過敏であった一方で。リブロース1,5-ビスホスフェートカルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ活性と、スクロース合成の成分をコードする多くの遺伝子によって生成された転写産物の存在量の両方が、野生型植物の葉よりもノックアウトラインで低かったが、葉のスクロース含有量はと根は、それぞれ著しく増加し、減少しました。FLN2ノックアウト植物では、根への糖の分配が損なわれていることが、炭素輸送に関与するいくつかの遺伝子が葉と葉鞘の両方でダウンレギュレートされているという観察によって確認されました。スクロースシンターゼ、酸インベルターゼ、および中性インベルターゼ活性のレベルは、特に植物が塩分ストレスにさらされた場合、野生型植物よりもノックアウト植物の根で明らかに低かった。FLN2ノックアウトプラントによって示される耐塩性の低下は、成長をサポートするために必要な同化物の不十分な供給の結果である可能性があり、この問題は、スクロースの外因性供給を提供することによって修正可能でした。結論として、FLN2は、糖代謝への影響のために、苗木の成長と塩分ストレスに対する稲の反応の文脈で重要であるということでした。"]
[134,31752697,"plant","rice","CRISPR;Cas9;"," ","BMC plant biology","Multiplex nucleotide editing by high-fidelity Cas9 variants with improved efficiency in rice.",2019,"19(1):511","[Xu W et al.]","Beijing Academy of Agriculture & Forestry Sciences, Beijing, China.",31752697,"10.1186/s12870-019-2131-1 ","BACKGROUND: Application of the CRISPR/Cas9 system or its derived base editors enables targeted genome modification, thereby providing a programmable tool to exploit gene functions and to improve crop traits. RESULTS: We report that PmCDA1 is much more efficient than rAPOBEC1 when fused to CRISPR/Cas9 nickase for the conversion of cytosine (C) to thymine (T) in rice. Three high-fidelity SpCas9 variants, eSpCas9(1.1), SpCas9-HF2 and HypaCas9, were engineered to serve with PmCDA1 (pBEs) as C-to-T base editors. These three high-fidelity editors had distinct multiplex-genome editing efficiencies. To substantially improve their base-editing efficiencies, a tandemly arrayed tRNA-modified single guide RNA (sgRNA) architecture was applied. The efficiency of eSpCas9(1.1)-pBE was enhanced up to 25.5-fold with an acceptable off-target effect. Moreover, two- to five-fold improvement was observed for knock-out mutation frequency by these high-fidelity  Cas9s under the direction of the tRNA-modified sgRNA architecture. CONCLUSIONS: We have engineered a diverse toolkit for efficient and precise genome engineering in rice, thus making genome editing for plant research and crop improvement more  flexible.","rice","背景：CRISPR / Cas9システムまたはその派生ベースエディタのアプリケーションは、ターゲットを絞ったゲノム変更を可能にし、それによって遺伝子機能を活用し、作物の特性を改善するためのプログラム可能なツールを提供します。結果：イネのシトシン（C）からチミン（T）への変換のためにCRISPR / Cas9ニッカーゼと融合した場合、PmCDA1はrAPOBEC1よりもはるかに効率的であると報告します。3つの忠実度の高いSpCas9バリアント、eSpCas9（1.1）、SpCas9-HF2、およびHypaCas9は、C-to-TベースエディターとしてPmCDA1（pBE）を使用するように設計されています。これらの3つの忠実度の高いエディターは、明確なマルチプレックスゲノム編集効率を備えていました。それらの塩基編集効率を大幅に改善するために、タンデムに配列されたtRNA修飾シングルガイドRNA（sgRNA）アーキテクチャが適用されました。eSpCas9（1.1）-pBEの効率は、許容可能なオフターゲット効果で最大25.5倍に向上しました。さらに、tRNA修飾sgRNAアーキテクチャの指示の下で、これらの忠実度の高いCas9によるノックアウト変異頻度の2〜5倍の改善が観察されました。結論：私たちは、米の効率的かつ正確なゲノム工学のための多様なツールキットを設計しました。これにより、植物研究と作物改良のためのゲノム編集がより柔軟になります。"]
[135,31510917,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","prohibitin complex 2alpha subunit (NAL8)","BMC plant biology","NAL8 encodes a prohibitin that contributes to leaf and spikelet development by regulating mitochondria and chloroplasts stability in rice.",2019,"19(1):395","[Chen K et al.]","Shanghai Institute for Biological Sciences, Chinese Academic of Sciences, Shanghai, China.",31510917,"10.1186/s12870-019-2007-4 ","BACKGROUND: Leaf morphology and spikelet number are two important traits associated with grain yield. To understand how genes coordinating with sink and sources of cereal crops is important for grain yield improvement guidance. Although many researches focus on leaf morphology or grain number in rice, the regulating molecular mechanisms are still unclear. RESULTS: In this study, we identified a prohibitin complex 2alpha subunit, NAL8, that contributes to multiple developmental process and is required for normal leaf width and spikelet number at the reproductive stage in rice. These results were consistent with the  ubiquitous expression pattern of NAL8 gene. We used genetic complementation, CRISPR/Cas9 gene editing system, RNAi gene silenced system and overexpressing system to generate transgenic plants for confirming the fuctions of NAL8. Mutation of NAL8 causes a reduction in the number of plastoglobules and shrunken  thylakoids in chloroplasts, resulting in reduced cell division. In addition, the  auxin levels in nal8 mutants are higher than in TQ, while the cytokinin levels are lower than in TQ. Moreover, RNA-sequencing and proteomics analysis shows that NAL8 is involved in multiple hormone signaling pathways as well as photosynthesis in chloroplasts and respiration in mitochondria. CONCLUSIONS: Our findings provide new insights into the way that NAL8 functions as a molecular chaperone in regulating plant leaf morphology and spikelet number through its effects on mitochondria and chloroplasts associated with cell division.","rice","背景：葉の形態と小穂数は、穀物収量に関連する2つの重要な特性です。穀物収量の改善ガイダンスにとって、穀物のシンクとソースと協調する遺伝子がどのように重要であるかを理解すること。多くの研究がイネの葉の形態や穀粒数に焦点を当てていますが、分子メカニズムの調節はまだ不明です。結果：この研究では、複数の発達過程に寄与し、米の生殖段階で正常な葉の幅とスパイクレット数に必要な、禁止複合体2alphaサブユニットNAL8を特定しました。これらの結果は、NAL8遺伝子の遍在する発現パターンと一致していました。NAL8の機能を確認するためのトランスジェニック植物を生成するために、遺伝子相補性、CRISPR / Cas9遺伝子編集システム、RNAi遺伝子サイレンシングシステム、および過剰発現システムを使用しました。NAL8の変異は、葉緑体のプラストグロブリンと収縮したチラコイドの数を減少させ、細胞分裂を減少させます。さらに、nal8変異体のオーキシンレベルはTQよりも高く、サイトキニンレベルはTQよりも低くなっています。さらに、RNAシーケンシングとプロテオミクス分析は、NAL8が葉緑体の光合成とミトコンドリアの呼吸だけでなく、複数のホルモンシグナル伝達経路に関与していることを示しています。結論：私たちの調査結果は、細胞分裂に関連するミトコンドリアと葉緑体への影響を通じて、NAL8が植物の葉の形態とスパイクレット数を調節する分子シャペロンとして機能する方法についての新しい洞察を提供します。"]
[136,31221084,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","Lysine/Histidine transporter (OsLHT1)","BMC plant biology","Disruption of an amino acid transporter LHT1 leads to growth inhibition and low yields in rice.",2019,"19(1):268","[Wang X et al.]","Guangxi University, Nanning, China.",31221084,"10.1186/s12870-019-1885-9 ","BACKGROUND: Research on plant amino acid transporters was mainly performed in Arabidopsis, while our understanding of them is generally scant in rice. OsLHT1 (Lysine/Histidine transporter) has been previously reported as a histidine transporter in yeast, but its substrate profile and function in planta are unclear. The aims of this study are to analyze the substrate selectivity of OsLHT1 and influence of its disruption on rice growth and fecundity. RESULTS: Substrate selectivity of OsLHT1 was analyzed in Xenopus oocytes using the two-electrode voltage clamp technique. The results showed that OsLHT1 could transport a broad spectrum of amino acids, including basic, neutral and acidic amino acids, and exhibited a preference for neutral and acidic amino acids. Two oslht1 mutants were generated using CRISPR/Cas9 genome-editing technology, and the loss-of-function of OsLHT1 inhibited rice root and shoot growth, thereby markedly reducing grain yields. QRT-PCR analysis indicated that OsLHT1 was expressed in various rice organs, including root, stem, flag leaf, flag leaf sheath and young panicle. Transient expression in rice protoplast suggested OsLHT1 was localized to the plasma membrane, which is consistent with its function as an amino acid transporter. CONCLUSIONS: Our results indicated that OsLHT1 is an amino acid transporter with wide substrate specificity and with preference for neutral and acidic amino acids, and disruption of OsLHT1 function  markedly inhibited rice growth and fecundity.","rice","背景：植物のアミノ酸トランスポーターの研究は主にシロイヌナズナで行われていましたが、私たちの理解は一般的にイネでは不十分です。OsLHT1（リジン/ヒスチジントランスポーター）は、酵母のヒスチジントランスポーターとして以前に報告されていますが、植物におけるその基質プロファイルと機能は不明です。この研究の目的は、OsLHT1の基質選択性と、その破壊が米の成長と繁殖力に及ぼす影響を分析することです。結果：OsLHT1の基質選択性は、2電極電圧クランプ技術を使用してXenopus卵細胞で分析されました。結果は、OsLHT1が塩基性、中性および酸性アミノ酸を含む広範囲のアミノ酸を輸送でき、中性および酸性アミノ酸に対する優先性を示したことを示した。2つのoslht1変異体は、CRISPR / Cas9ゲノム編集技術を使用して生成され、OsLHT1の機能喪失はイネの根と新芽の成長を阻害し、それによって穀粒の収量を著しく減少させました。QRT-PCR分析は、OsLHT1が根、茎、旗葉、旗葉鞘および若い毛細血管を含む様々な米器官で発現されたことを示した。イネのプロトプラストにおける一過性の発現は、OsLHT1が原形質膜に局在していることを示唆しており、これはアミノ酸トランスポーターとしての機能と一致しています。結論：私たちの結果は、OsLHT1が広い基質特異性を持ち、中性および酸性アミノ酸を優先するアミノ酸トランスポーターであり、OsLHT1機能の破壊が米の成長と繁殖力を著しく阻害することを示しました。"]
[137,30894127,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","thermo-sensitive genic male sterility (TMS5)","BMC plant biology","Generation of a new thermo-sensitive genic male sterile rice line by targeted mutagenesis of TMS5 gene through CRISPR/Cas9 system.",2019,"19(1):109","[Barman HN et al.]","China National Rice Research Institute, Hangzhou, 310006, China.",30894127,"10.1186/s12870-019-1715-0 ","BACKGROUND: Two-line hybrid rice with high yield potential is increasingly popular and the photo- and temperature-sensitive male sterile line is one of the  basic components for two-line hybrid rice breeding. The development of male sterile lines through conventional breeding is a lengthy and laborious process, whereas developing thermo-sensitive genic male sterile (TGMS) lines for two-line  hybrid breeding by editing a temperature-sensitivity gene by CRISPR/Cas9 is efficient and convenient. RESULTS: Here, thermo-sensitive genic male sterility (TGMS) was induced by employing the CRISPR/Cas9 gene editing technology to modify the gene TMS5. Two TGMS mutants, tms5-1 and tms5-2, both lacking any residual T-DNA, were generated in the indica rice cultivar Zhongjiazao17 (cv. YK17) background. When grown at a sub-optimal temperature (22 degrees C), both mutants  produced viable pollen and successfully produced grain through self-fertilization, but at temperatures 24 and 26 degrees C, their pollen was sterile and no grain was set. F1 hybrids derived from the crosses between YK17S (tms5-1) and three different restorer lines outperformed both parental lines with respect to grain yield and related traits. CONCLUSION: The YK17S generated by CRISPR/Cas9 system was proved to be a new TGMS line with superior yield potential and can be widely utilized in two-line hybrid breeding of indica rice.","rice","背景：高収量の可能性を秘めた2系統ハイブリッド米はますます人気があり、感光性および温度感受性の雄性不稔系統は2系統ハイブリッド米育種の基本的な構成要素の1つです。従来の育種による雄性不稔系統の開発は、時間と手間がかかるプロセスですが、CRISPR / Cas9で温度感受性遺伝子を編集することにより、2系統ハイブリッド育種用の熱感受性遺伝子雄性不稔（TGMS）系統を開発することは効率的で便利です。結果：ここでは、CRISPR / Cas9遺伝子編集技術を使用してTMS5遺伝子を修飾することにより、感熱性の遺伝子雄性不稔（TGMS）が誘発されました。2つのTGMS変異体、tms5-1とtms5-2は、どちらも残留T-DNAを欠いており、インディカ米の栽培品種Zhongjiazao17（cv。YK17）のバックグラウンドで生成されました。最適以下の温度（22℃）で成長させた場合、両方の変異体は生存可能な花粉を生成し、自家受精によって穀物を首尾よく生成したが、24℃および26℃の温度では、花粉は無菌であり、粒子は固まらなかった。YK17S（tms5-1）と3つの異なる復元ライン間の交配から派生したF1ハイブリッドは、穀物収量と関連する特性に関して、両方の親ラインを上回りました。結論：CRISPR / Cas9システムによって生成されたYK17Sは、優れた収量の可能性を備えた新しいTGMSラインであることが証明され、インディカ米の2ラインハイブリッド育種に広く利用できます。"]
[138,30885124,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","NO CATALASE ACTIVITY 1 (nca1a; nca1b)","BMC plant biology","Two NCA1 isoforms interact with catalase in a mutually exclusive manner to redundantly regulate its activity in rice.",2019,"19(1):105","[Liu J et al.]","South China Agricultural University, Guangzhou, Guangdong, China.",30885124,"10.1186/s12870-019-1707-0 ","BACKGROUND: NCA1 (NO CATALASE ACTIVITY 1) was recently identified in Arabidopsis  as a chaperone protein to regulate catalase (CAT) activity through maintaining the folding of CAT. The gene exists mainly in higher plants; some plants, such as Arabidopsis, contain only one NCA1 gene, whereas some others such as rice harbor  two copies. It is not yet understood whether and how both isoforms have functioned to regulate CAT activity in those two-copy-containing plant species. RESULTS: In this study, we first noticed that the spatiotemporal expression patterns of NCA1a and NCA1b were very similar in rice plants. Subsequent BiFC and yeast three-hybrid experiments demonstrated that both NCA1a and NCA1b show mutually exclusive, rather than simultaneous, interaction with CAT. For a further functional analysis, nca1a and nca1b single mutants or double mutants of rice were generated by CRISPR/Cas9. Analysis on these mutants under both normal and salinity stress conditions found that, as compared with WT, either nca1a or nca1b single mutant showed no difference at phenotypes and CAT activities, whereas the  double mutants constantly displayed very low CAT activity (about 5%) and serious  lesion phenotypes. CONCLUSIONS: These results suggest that NCA1a and NCA1b show mutually exclusive interaction with CAT to regulate CAT activity in a functionally-redundant manner in rice.","rice","背景：NCA1（カタラーゼ活性なし1）は、最近、アラビドプシスで、CATの折り畳みを維持することによってカタラーゼ（CAT）活性を調節するシャペロンタンパク質として同定されました。この遺伝子は主に高等植物に存在します。アラビドプシスなどの一部の植物にはNCA1遺伝子が1つしか含まれていませんが、イネなどの一部の植物には2つのコピーがあります。両方のアイソフォームがこれらの2コピーを含む植物種のCAT活性を調節するように機能したかどうか、またどのように機能したかはまだわかっていません。結果：この研究では、NCA1aとNCA1bの時空間的発現パターンが米植物で非常に類似していることに最初に気づきました。その後のBiFCおよび酵母の3ハイブリッド実験では、NCA1aとNCA1bの両方が、CATとの同時ではなく、相互に排他的な相互作用を示すことが示されました。さらなる機能分析のために、イネのnca1aおよびnca1b単一変異体または二重変異体がCRISPR / Cas9によって生成されました。正常および塩分ストレス条件下でのこれらの変異体の分析では、WTと比較して、nca1aまたはnca1bの単一変異体は表現型およびCAT活性に違いを示さなかったが、二重変異体は常に非常に低いCAT活性（約5％）を示し、深刻な病変の表現型。結論：これらの結果は、NCA1aとNCA1bがCATと相互に排他的な相互作用を示し、イネの機能的に冗長な方法でCAT活性を調節することを示唆しています。"]
[139,31160418,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","type-B response regulators","Development","Type-B response regulators of rice play key roles in growth, development and cytokinin signaling.",2019,"146(13)","[Worthen JM et al.]","Dartmouth College, Hanover, NH, USA.",31160418,"10.1242/dev.174870 ","Cytokinins are plant hormones with crucial roles in growth and development. Although cytokinin signaling is well characterized in the model dicot Arabidopsis, we are only beginning to understand its role in monocots, such as rice (Oryza sativa) and other cereals of agronomic importance. Here, we used primarily a CRISPR/Cas9 gene-editing approach to characterize the roles of a key  family of transcription factors, the type-B response regulators (RRs), in cytokinin signaling in rice. Results from the analysis of single rr mutants as well as higher-order rr21/22/23 mutant lines revealed functional overlap as well  as subfunctionalization within members of the gene family. Mutant phenotypes associated with decreased activity of rice type-B RRs included effects on leaf and root growth, inflorescence architecture, flower development and fertilization, trichome formation and cytokinin sensitivity. Development of the stigma brush involved in pollen capture was compromised in the rr21/22/23 mutant, whereas anther development was compromised in the rr24 mutant. Novel as well as conserved roles for type-B RRs in the growth and development of a monocot compared with dicots were identified.","rice","サイトキニンは、成長と発達に重要な役割を果たす植物ホルモンです。サイトキニンシグナル伝達はモデル双子葉植物シロイヌナズナでよく特徴付けられていますが、イネ（Oryza sativa）やその他の農業上重要な穀物などの単子葉植物におけるその役割を理解し始めたばかりです。ここでは、主にCRISPR / Cas9遺伝子編集アプローチを使用して、イネのサイトカイニンシグナル伝達における転写因子の主要なファミリーであるタイプB応答レギュレーター（RR）の役割を特徴付けました。単一のrr変異体および高次のrr21 / 22/23変異株の分析の結果から、遺伝子ファミリーのメンバー内での機能の重複とサブ機能化が明らかになりました。イネB型RRの活性低下に関連する変異表現型には、葉と根の成長、花序の構造、花の発達と施肥、毛状突起の形成、サイトキニン感受性への影響が含まれていました。花粉捕獲に関与する柱頭ブラシの発達は、rr21 / 22/23変異体で損なわれましたが、葯の発達はrr24変異体で損なわれました。ディコットと比較したモノコットの成長と発達におけるタイプBRRの新規および保存された役割が特定されました。"]
[140,31134125,"plant","rice","Cas9;","24 target sites selected randomly","Frontiers in genetics","Increasing Cytosine Base Editing Scope and Efficiency With Engineered Cas9-PmCDA1 Fusions and the Modified sgRNA in Rice.",2019,"10:379","[Wu Y et al.]","Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing, China.",31134125,"10.3389/fgene.2019.00379 ","Base editors that do not require double-stranded DNA cleavage or homology-directed repair enable higher efficiency and cleaner substitution of targeted single nucleotides in genomic DNA than conventional approaches. However, their broad applications are limited within the editing window of several base pairs from the canonical NGG protospacer adjacent motif (PAM) sequence. In this study, we fused the D10A nickase of several Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)  variants with Petromyzon marinus cytidine deaminase 1 (PmCDA1) and uracil DNA glycosylase inhibitor (UGI) and developed two new effective PmCDA1-based cytosine base editors (pBEs), SpCas9 nickase (SpCas9n)-pBE and VQR nickase (VQRn)-pBE, which expanded the scope of genome targeting for cytosine-to-thymine (C-to-T) substitutions in rice. Four of six and 12 of 18 target sites selected randomly in SpCas9n-pBE and VQRn-pBE, respectively were base edited with frequencies of 4-90% in T0 plants. The effective deaminase window typically spanned positions 1-7 within the protospacer and the single target C showed the maximum C-to-T frequency at or near position 3, counting the end distal to PAM as position 1. In addition, the modified single guide RNA (sgRNA) improved the base editing efficiencies of VQRn-pBE with 1.3- to 7.6-fold increases compared with the native sgRNA, and targets that could not be mutated using the native sgRNA were edited successfully using the modified sgRNA. These newly developed base editors can be  used to realize C-to-T substitutions and may become powerful tools for both basic scientific research and crop breeding in rice.","rice","二本鎖DNA切断または相同性指向修復を必要としないベースエディターは、従来のアプローチよりも高い効率と、ゲノムDNA内の標的単一ヌクレオチドのよりクリーンな置換を可能にします。ただし、それらの幅広いアプリケーションは、正規のNGGプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）シーケンスからのいくつかの塩基対の編集ウィンドウ内に制限されています。この研究では、いくつかのStreptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）バリアントのD10AニッカーゼをPetromyzon marinusシチジンデアミナーゼ1（PmCDA1）およびウラシルDNAグリコシラーゼ阻害剤（UGI）と融合し、2つの新しい効果的なPmCDA1ベースのシトシンベースエディター（pBE）を開発しました。 SpCas9ニッカーゼ（SpCas9n）-pBEおよびVQRニッカーゼ（VQRn）-pBEは、米のシトシンからチミン（CからT）への置換のゲノムターゲティングの範囲を拡大しました。SpCas9n-pBEおよびVQRn-pBEでそれぞれランダムに選択された6つのうち4つおよび18のターゲットサイトのうち12つは、T0植物で4〜90％の頻度でベース編集されました。有効なデアミナーゼウィンドウは通常、プロトスペーサー内の位置1〜7にまたがり、単一のターゲットCは、位置3またはその近くで最大のC-to-T頻度を示し、PAMの遠位端を位置1としてカウントしました。さらに、修正された単一ガイドRNA（sgRNA）は、VQRn-pBEのベース編集効率をネイティブsgRNAと比較して1.3〜7.6倍向上させ、ネイティブsgRNAを使用して変異できなかったターゲットは、変更されたsgRNAを使用して正常に編集されました。これらの新しく開発されたベースエディタは、CからTへの置換を実現するために使用でき、基礎的な科学研究と米の作物育種の両方のための強力なツールになる可能性があります。"]
[141,31993066,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","OsPIN5b (a panicle length gene); GS3 (a grain size gene); OsMYB30 (a cold tolerance gene)","Frontiers in plant science","Rational Improvement of Rice Yield and Cold Tolerance by Editing the Three Genes  OsPIN5b, GS3, and OsMYB30 With the CRISPR-Cas9 System.",2019,"10:1663","[Zeng Y et al.]","Wuhan University, Wuhan, China.",31993066,"10.3389/fpls.2019.01663 ","Significant increases in rice yield and stress resistance are constant demands for breeders. However, high yield and high stress resistance are often antagonistic to each other. Here, we report several new rice mutants with high yield and excellent cold tolerance that were generated by simultaneously editing  three genes, OsPIN5b (a panicle length gene), GS3 (a grain size gene) and OsMYB30 (a cold tolerance gene) with the CRISPR-Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 9) system. We edited two target sites of each gene with high efficiency: 53% for OsPIN5b-site1, 42% for OsPIN5b-site2, 66% for GS3-site1, 63% for GS3-site2, 63% for OsMYB30-site1, and 58% for OsMYB30-site2. Consequently, the ospin5b mutants, the gs3 mutants, and the osmyb30 mutants exhibited increased panicle length, enlarged grain size and increased cold tolerance, respectively. Then nine transgenic lines of the ospin5b/gs3, six lines of ospin5b/osmyb30 and six lines of gs3/osmyb30 were also  acquired, and their yield related traits and cold tolerance corresponded to the genes being edited. Additionally, we obtained eight ospin5b/gs3/osmyb30 triple mutants by editing all three genes simultaneously. Aside from the ospin5b/gs3/osmyb30-4 and ospin5b/gs3/osmyb30-25 mutants, the remaining six mutants had off-target events at the putative off-target site of OsMYB30-site1. The results also showed that the T2 generations of these two mutants exhibited higher yield and better cold tolerance compared with the wild type. Together, these results demonstrated that new and excellent rice varieties with improved yield and abiotic stress resistance can be generated through gene editing techniques and may be applied to rice breeding. Furthermore, our study proved that the comprehensive agronomic traits of rice can be improved with the CRISPR-Cas9 system.","rice","米の収量とストレス耐性の大幅な増加は、ブリーダーにとって絶え間ない要求です。しかし、高収量と高耐ストレス性はしばしば互いに拮抗します。ここでは、3つの遺伝子OsPIN5b（パニクル長遺伝子）、GS3（粒子サイズ遺伝子）、OsMYB30（耐寒性遺伝子）をCRISPRで同時に編集することによって生成された、高収量で耐寒性に優れたいくつかの新しい米変異体を報告します。 -Cas9（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート関連タンパク質9）システム。各遺伝子の2つのターゲットサイトを高効率で編集しました：OsPIN5b-site1で53％、OsPIN5b-site2で42％、GS3-site1で66％、GS3-site2で63％、OsMYB30-site1で63％、58％ OsMYB30-site2の場合。その結果、ospin5b変異体、gs3変異体、およびosmyb30変異体は、それぞれ、パニクル長の増加、粒子サイズの拡大、および耐寒性の増加を示しました。次に、ospin5b / gs3の9つのトランスジェニック系統、ospin5b / osmyb30の6系統、gs3 / osmyb30の6系統も取得され、それらの収量関連特性と耐寒性は編集中の遺伝子に対応しました。さらに、3つの遺伝子すべてを同時に編集することにより、8つのospin5b / gs3 / osmyb30トリプルミュータントを取得しました。ospin5b / gs3 / osmyb30-4およびospin5b / gs3 / osmyb30-25変異体を除いて、残りの6つの変異体はOsMYB30-site1の推定オフターゲットサイトでオフターゲットイベントを持っていました。結果はまた、これら2つの変異体のT2世代が、野生型と比較して、より高い収量とより優れた耐寒性を示したことを示しました。総合すると、これらの結果は、収量と非生物的ストレス耐性が改善された新しく優れた米品種が遺伝子編集技術によって生成され、米の育種に適用できることを示した。さらに、私たちの研究は、米の包括的な農業特性がCRISPR-Cas9システムで改善できることを証明しました。"]
[142,31616455,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","two target sites","Frontiers in plant science","Bidirectional Promoter-Based CRISPR-Cas9 Systems for Plant Genome Editing.",2019,"10:1173","[Ren Q et al.]","University of Electronic Science and Technology of China,  Chengdu, China.",31616455,"10.3389/fpls.2019.01173 ","CRISPR-Cas systems can be expressed in multiple ways, with different capabilities regarding tissue-specific expression, efficiency, and expression levels. Thus far, three expression strategies have been demonstrated in plants: mixed dual promoter systems, dual Pol II promoter systems, and single transcript unit (STU)  systems. We explored a fourth strategy to express CRISPR-Cas9 in the model and crop plant, rice, where a bidirectional promoter (BiP) is used to express Cas9 and single guide RNA (sgRNA) in opposite directions. We first tested an engineered BiP system based on double-mini 35S promoter and an Arabidopsis enhancer, which resulted in 20.7% and 52.9% genome editing efficiencies at two target sites in T0 stable transgenic rice plants. We further improved the BiP system drastically by using a rice endogenous BiP, OsBiP1. The endogenous BiP expression system had higher expression strength and led to 75.9-93.3% genome editing efficiencies in rice T0 generation, when the sgRNAs were processed by either tRNA or Csy4. We provided a proof-of-concept study of applying BiP systems for expressing two-component CRISPR-Cas9 genome editing reagents in rice. Our work could promote future research and adoption of BiP systems for CRISPR-Cas-based genome engineering in plants.","rice","CRISPR-Casシステムは、組織固有の発現、効率、および発現レベルに関するさまざまな機能を使用して、複数の方法で表現できます。これまでのところ、3つの発現戦略が植物で実証されています：混合デュアルプロモーターシステム、デュアルPol IIプロモーターシステム、およびシングルトランスクリプトユニット（STU）システム。モデルおよび作物植物である米でCRISPR-Cas9を発現させるための第4の戦略を検討しました。ここでは、双方向プロモーター（BiP）を使用してCas9とシングルガイドRNA（sgRNA）を反対方向に発現させます。最初に、ダブルミニ35Sプロモーターとシロイヌナズナエンハンサーに基づく操作されたBiPシステムをテストしました。これにより、T0安定トランスジェニックイネの2つの標的部位で20.7％と52.9％のゲノム編集効率が得られました。イネの内因性BiPであるOsBiP1を使用することにより、BiPシステムをさらに大幅に改善しました。内因性BiP発現システムは、sgRNAがtRNAまたはCsy4のいずれかによって処理された場合、より高い発現強度を持ち、米のT0生成において75.9〜93.3％のゲノム編集効率をもたらしました。イネで2成分CRISPR-Cas9ゲノム編集試薬を発現させるためにBiPシステムを適用するという概念実証研究を提供しました。私たちの仕事は、植物におけるCRISPR-CasベースのゲノムエンジニアリングのためのBiPシステムの将来の研究と採用を促進する可能性があります。"]
[143,31572408,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","OsNramp5","Frontiers in plant science","Mutation at Different Sites of Metal Transporter Gene OsNramp5 Affects Cd Accumulation and Related Agronomic Traits in Rice (Oryza sativa L.).",2019,"10:1081","[Wang T et al.]","Hunan Agricultural University, Changsha, China.",31572408,"10.3389/fpls.2019.01081 ","OsNramp5 is a key gene involved in the control of the uptake of Cd, Mn, and other metal ions by rice root cells. The functional deficiency of this gene can significantly reduce the accumulation of Cd in rice grains, but the effects of its mutation on agronomic traits such as yield and quality have not been investigated comprehensively yet. In the present study, three Huanghuazhan-based  OsNramp5 mutants [LCH1 (Low Cadmium Huanghuazhan 1), LCH2 (Low Cadmium Huanghuazhan 2), and LCH3 (Low Cadmium Huanghuazhan 3)] were obtained using clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) technology. The mutation-type analysis showed that LCH1,  LCH2, and LCH3 encoded defective OsNramp5 protein sequences containing only 76aa, 176aa, and 266aa, respectively. The determination of metal content and the statistics of related agronomic traits revealed that the functionally deficient OsNramp5 not only significantly reduced the accumulation of Cd in the grains of the mutants but also affected rice yield and quality. However, with the decrease  of OsNramp5 mutation degree, its effects on chlorenchyma Mn accumulation, yield,  and quality were also diminished. Additionally, we also found that the increase in the concentration of Mn in the soil restored the phenotype of the declined yield and quality due to the functional deficiency of OsNramp5. Our findings provide novel insights into and new materials for breeding rice varieties with low Cd accumulation and excellent agronomic traits under severe Cd pollution environment.","rice","OsNramp5は、米の根細胞によるCd、Mn、およびその他の金属イオンの取り込みの制御に関与する重要な遺伝子です。この遺伝子の機能的欠陥は、米粒中のCdの蓄積を大幅に減らすことができますが、収量や品質などの農業特性に対するその変異の影響はまだ包括的に調査されていません。本研究では、3つのHuanghuazhanベースのOsNramp5変異体[LCH1（低カドミウムHuanghuazhan 1）、LCH2（低カドミウムHuanghuazhan 2）、およびLCH3（低カドミウムHuanghuazhan 3）]が、クラスター化された規則的な間隔の短いパリンドロームリピート/ CRISPR関連を使用して取得されました。プロテイン9（CRISPR / Cas9）テクノロジー。変異型分析は、LCH1、LCH2、およびLCH3が、それぞれ76aa、176aa、および266aaのみを含む欠陥のあるOsNramp5タンパク質配列をコードしていることを示しました。金属含有量の測定と関連する農業形質の統計により、機能的に欠陥のあるOsNramp5は、突然変異体の穀粒におけるCdの蓄積を大幅に減少させるだけでなく、イネの収量と品質にも影響を与えることが明らかになりました。ただし、OsNramp5の変異度が低下すると、緑内障のMnの蓄積、収量、品質への影響も減少しました。さらに、土壌中のMn濃度の増加により、OsNramp5の機能不全による収量と品質の低下の表現型が回復することもわかりました。私たちの調査結果は、Cdの蓄積が少なく、厳しいCd汚染環境下で優れた農業形質を備えたイネ品種を育種するための新しい洞察と新しい材料を提供します。"]
[144,31428115,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","monogalactosyldiacylglycerol synthase (OsMGD2)","Frontiers in plant science","Characterization and Mutational Analysis of a Monogalactosyldiacylglycerol Synthase Gene OsMGD2 in Rice.",2019,"10:992","[Basnet R et al.]","Zhejiang University, Hangzhou, China.",31428115,"10.3389/fpls.2019.00992 ","Monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) and digalactosyldiacylglycerol (DGDG) are the two predominant galactolipids present in the photosynthetic membrane in many photosynthetic organisms, including algae and higher plants. These galactolipids  are the main constituents of thylakoid membrane and are essential for chloroplast biogenesis and photoautotrophic growth. In silico analysis revealed that rice (Oryza sativa L.) genome has three genes encoding MGDG synthase (OsMGD1, 2, and 3). Although subcellular localization analysis demonstrated that OsMGD2 is localized to chloroplast, its expression was observed mainly in anther and endosperm, suggesting that MGDG might have an important role in the development of flower and grain in rice. Knock-out mutants of OsMGD2 were generated employing the CRISPR/Cas9 system and their morphology, yield and grain quality related traits were studied. The leaf of osmgd2 mutants showed reduced MGDG ( approximately 11.6%) and DGDG ( approximately 9.5%) content with chlorophyll a content decreased by approximately 23%, consequently affecting the photosynthesis. The mutants also exhibited poor agronomic performance with plant  height and panicle length decreased by approximately 12.2 and approximately 7.3%, respectively. Similarly, the number of filled grains per panicle was reduced by 43.8%, while the 1000 grain weight was increased by approximately 6.3% in the mutants. The milled rice of mutants also had altered pasting properties and decreased linoleic acid content ( approximately 26.6%). Put together, the present study demonstrated that OsMGD2 is the predominantly expressed gene encoding MGDG  synthase in anther and grain and plays important roles in plant growth and development, as well as in grain quality.","rice","モノガラクトシルジアシルグリセロール（MGDG）とジガラクトシルジアシルグリセロール（DGDG）は、藻類や高等植物を含む多くの光合成生物の光合成膜に存在する2つの主要なガラクト脂質です。これらのガラクト脂質はチラコイド膜の主成分であり、葉緑体の生合成と光合成独立栄養成長に不可欠です。インシリコ分析により、イネ（Oryza sativa L.）のゲノムにはMGDGシンターゼをコードする3つの遺伝子（OsMGD1、2、および3）があることが明らかになりました。細胞内局在分析は、OsMGD2が葉緑体に局在することを示したが、その発現は主に葯と胚乳で観察され、MGDGがイネの花と穀粒の発達に重要な役割を果たしている可能性があることを示唆している。OsMGD2のノックアウト変異体は、CRISPR / Cas9システムを使用して生成され、それらの形態、収量、および穀粒品質に関連する特性が研究されました。osmgd2変異体の葉は、MGDG（約11.6％）とDGDG（約9.5％）の含有量が減少し、クロロフィルaの含有量が約23％減少し、その結果、光合成に影響を及ぼしました。突然変異体はまた、草丈と穂の長さがそれぞれ約12.2と約7.3％減少したという貧弱な農学的性能を示した。同様に、変異体では、パニクルあたりの充填粒子数が43.8％減少し、1000粒子重量が約6.3％増加しました。突然変異体の精米もまた、ペースト特性が変化し、リノール酸含有量が減少した（約26.6％）。まとめると、本研究は、OsMGD2が葯および穀物においてMGDGシンターゼをコードする主に発現される遺伝子であり、植物の成長および発達、ならびに穀物の品質において重要な役割を果たすことを示した。"]
[145,31244876,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","inorganic pyrophosphatase (OsPPa6)","Frontiers in plant science","Mutagenesis Reveals That the OsPPa6 Gene Is Required for Enhancing the Alkaline Tolerance in Rice.",2019,"10:759","[Wang B et al.]","Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, China.",31244876,"10.3389/fpls.2019.00759 ","Alkaline stress (AS) is one of the abiotic stressful factors limiting plant's growth and development. Inorganic pyrophosphatase is usually involved in a variety of biological processes in plant in response to the abiotic stresses. Here, to clarify the responsive regulation of inorganic pyrophosphatase in rice under AS, the mutagenesis of the OsPPa6 gene encoding an inorganic pyrophosphatase in rice cv. Kitaake (Oryza sativa L. ssp. japonica) was performed by the CRISPR/Cas9 system. Two homozygous independent mutants with cas9-free were obtained by continuously screening. qPCR reveals that the OsPPa6 gene was significantly induced by AS, and the mutagenesis of the OsPPa6 gene apparently delayed rice's growth and development, especially under AS. Measurements demonstrate that the contents of pyrophosphate in the mutants were higher than those in the wild type under AS, however, the accumulation of inorganic phosphate, ATP, chlorophyll, sucrose, and starch in the mutants were decreased significantly, and the mutagenesis of the OsPPa6 gene remarkably lowered the net  photosynthetic rate of rice mutants, thus reducing the contents of soluble sugar  and proline, but remarkably increasing MDA, osmotic potentials and Na(+)/K(+) ratio in the mutants under AS. Metabonomics measurement shows that the mutants obviously down-regulated the accumulation of phosphorylcholine, choline, anthranilic acid, apigenin, coniferol and dodecanoic acid, but up-regulated the accumulation of L-valine, alpha-ketoglutarate, phenylpyruvate and L-phenylalanine under AS. This study suggests that the OsPPa6 gene is an important osmotic regulatory factor in rice, and the gene-editing of CRISPR/Cas9-guided is an effective method evaluating the responsive regulation of the stress-induced gene, and simultaneously provides a scientific support for the application of the gene  encoding a soluble inorganic pyrophosphatase in molecular breeding.","rice","アルカリストレス（AS）は、植物の成長と発達を制限する非生物的なストレスの多い要因の1つです。無機ピロホスファターゼは通常、非生物的ストレスに応答して植物のさまざまな生物学的プロセスに関与しています。ここでは、AS下のイネにおける無機ピロホスファターゼの応答性調節を明らかにするために、イネ品種における無機ピロホスファターゼをコードするOsPPa6遺伝子の突然変異誘発。北明（Oryza sativa L.ssp。japonica）は、CRISPR / Cas9システムによって実行されました。継続的にスクリーニングすることにより、cas9を含まない2つのホモ接合性の独立した変異体が得られました。qPCRは、OsPPa6遺伝子がASによって有意に誘導され、OsPPa6遺伝子の突然変異誘発が、特にASの下で、明らかにイネの成長と発達を遅らせたことを明らかにしています。測定により、変異体のピロリン酸の含有量はAS下の野生型よりも高かったが、変異体の無機リン酸、ATP、クロロフィル、スクロース、およびデンプンの蓄積が大幅に減少し、OsPPa6の変異誘発が示された。遺伝子は、米変異体の正味の光合成速度を著しく低下させ、したがって可溶性糖およびプロリンの含有量を低下させたが、AS下の変異体におけるMDA、浸透圧ポテンシャルおよびNa（+）/ K（+）比を著しく増加させた。メタボノミクス測定は、変異体がホスホリルコリン、コリン、アントラニル酸、アピゲニン、コニフェロールおよびドデカン酸の蓄積を明らかにダウンレギュレートしたが、AS下でL-バリン、α-ケトグルタル酸、フェニルピルビン酸およびL-フェニルアラニンの蓄積をアップレギュレートしたことを示している。この研究は、OsPPa6遺伝子がイネの重要な浸透圧調節因子であることを示唆しており、CRISPR / Cas9誘導の遺伝子編集は、ストレス誘発遺伝子の応答性調節を評価する効果的な方法であり、同時に科学的サポートを提供します。分子育種における可溶性無機ピロホスファターゼをコードする遺伝子の応用。"]
[146,30778363,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","calcium-dependent protein kinase (OsCPK12)","Frontiers in plant science","Impaired Function of the Calcium-Dependent Protein Kinase, OsCPK12, Leads to Early Senescence in Rice (Oryza sativa L.).",2019,"10:52","[Wang B et al.]","China National Rice Research Institute, Hangzhou, China.",30778363,"10.3389/fpls.2019.00052 ","Premature leaf senescence affects plant yield and quality, and numerous researches about it have been conducted until now. In this study, we identified an early senescent mutant es4 in rice (Oryza sativa L.); early senescence appeared approximately at 60 dps and became increasingly senescent with the growth of es4 mutant. We detected that content of reactive oxygen species (ROS) and malondialdehyde (MDA), as well as activity of superoxide dismutase (SOD) were elevated, while chlorophyll content, soluble protein content, activity of catalase (CAT), activity of peroxidase (POD) and photosynthetic rate were reduced in the es4 mutant leaves. We mapped es4 in a 33.5 Kb physical distance on chromosome 4 by map-based cloning. Sequencing analysis in target interval indicated there was an eight bases deletion mutation in OsCPK12 which encoded a calcium-dependent protein kinase. Functional complementation of OsCPK12 in es4 completely restored the normal phenotype. We used CRISPR/Cas9 for targeted disruption of OsCPK12 in ZH8015 and all the mutants exhibited the premature senescence. All the results indicated that the phenotype of es4 was caused by the mutation of OsCPK12. Overexpression of OsCPK12 in ZH8015 enhanced the net photosynthetic rate (P n) and chlorophyll content. OsCPK12 was mainly expressed in green organs. The results of qRT-PCR analysis showed that the expression levels of some key genes involved in senescence, chlorophyll biosynthesis, and photosynthesis were significantly altered in the es4 mutant. Our results demonstrate that the mutant of OsCPK12 triggers the premature leaf senescence; however, the overexpression of OsCPK12 may delay its growth period and provide the potentially positive effect on productivity in rice.","rice","早葉の老化は植物の収量と品質に影響を及ぼし、これまで多くの研究が行われてきました。この研究では、イネ（Oryza sativa L.）の初期老化変異体es4を特定しました。初期の老化は約60dpsで現れ、es4変異体の成長とともにますます老化した。活性酸素種（ROS）とマロンジアルデヒド（MDA）の含有量、およびスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）の活性が上昇している一方で、クロロフィル含有量、可溶性タンパク質含有量、カタラーゼ（CAT）の活性、ペルオキシダーゼ（POD）の活性が検出されました。 ）および光合成速度はes4変異体の葉で減少しました。マップベースのクローニングにより、es4を染色体4の33.5Kbの物理的距離にマッピングしました。ターゲット間隔でのシーケンス分析は、カルシウム依存性プロテインキナーゼをコードするOsCPK12に8塩基の欠失変異があることを示しました。es4でのOsCPK12の機能的補完により、正常な表現型が完全に復元されました。ZH8015のOsCPK12の標的破壊にCRISPR / Cas9を使用し、すべての変異体が早期老化を示しました。すべての結果は、es4の表現型がOsCPK12の突然変異によって引き起こされたことを示しました。ZH8015でのOsCPK12の過剰発現は、正味の光合成速度（P n）とクロロフィル含有量を高めました。OsCPK12は主に緑色の器官で発現しました。qRT-PCR分析の結果は、老化、クロロフィル生合成、および光合成に関与するいくつかの重要な遺伝子の発現レベルがes4変異体で有意に変化したことを示しました。私たちの結果は、OsCPK12の変異体が時期尚早の葉の老化を引き起こすことを示しています。ただし、OsCPK12の過剰発現は、その成長期間を遅らせ、イネの生産性にプラスの影響を与える可能性があります。"]
[147,31146805,"plant","rice","Cas9;","OsGRAS19","Functional plant biology","Novel OsGRAS19 mutant, D26, positively regulates grain shape in rice (Oryza sativa).",2019,null,"[Lin Z et al.]","Huaqiao University, Xiamen, China",31146805,"10.1071/FP18266 ","Grain size is an important factor in rice yield. Several genes related to grain size have been reported, but most of them are determined by quantitative trail loci (QTL) traits. Gene D26 is a novel site mutation of OsGRAS19 and involved in  the brassinosteroid (BR) signalling pathway. However, whether D26 is involved in  the process of rice reproductive development remains unclear. Here, gene cloning  and functional analysis revealed that D26 has an obvious regulatory effect on grain size. Overexpression or CRISP/Cas9 mutant of D26 also showed that grain size was positively influenced. Cellular analyses show that D26 modulates grain size by promoting cell division and regulating the cell number in the upper epidermis of the glume. The overexpression results further suggest that the level of D26 expression positively impacts grain length and leaf angles and that the expression of several known grain size genes is involved in the regulation. Based on our results, D26, as a transcription factor, effectively improves rice grain shape.","rice","穀物のサイズは、米の収量の重要な要素です。粒子サイズに関連するいくつかの遺伝子が報告されていますが、それらのほとんどは定量的トレイル軌跡（QTL）特性によって決定されます。遺伝子D26は、OsGRAS19の新規部位変異であり、ブラシノステロイド（BR）シグナル伝達経路に関与しています。しかし、D26が米の生殖発達の過程に関与しているかどうかは不明なままです。ここで、遺伝子クローニングと機能分析により、D26が粒子サイズに明らかな調節効果を及ぼすことが明らかになりました。D26の過剰発現またはCRISP / Cas9変異体も、粒子サイズが正の影響を受けていることを示しました。細胞分析は、D26が細胞分裂を促進し、籾殻の上部表皮の細胞数を調節することによって粒子サイズを調節することを示しています。過剰発現の結果はさらに、D26発現のレベルが穀粒の長さと葉の角度にプラスの影響を及ぼし、いくつかの既知の穀粒サイズの遺伝子の発現が調節に関与していることを示唆しています。私たちの結果に基づくと、転写因子としてのD26は、米粒の形状を効果的に改善します。"]
[148,31394891,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","serine/arginine-rich locus","Genes","Multiplex CRISPR Mutagenesis of the Serine/Arginine-Rich (SR) Gene Family in Rice.",2019,"10(8)","[Butt H  et al.]","King Abdullah University of Science and Technology, Thuwal, Saudi Arabia.",31394891,"10.3390/genes10080596 ","Plant growth responds to various environmental and developmental cues via signaling cascades that influence gene expression at the level of transcription and pre-mRNA splicing. Alternative splicing of pre-mRNA increases the coding potential of the genome from multiexon genes and regulates gene expression through multiple mechanisms. Serine/arginine-rich (SR) proteins, a conserved family of splicing factors, are the key players of alternative splicing and regulate pre-mRNA splicing under stress conditions. The rice (Oryza sativa) genome encodes 22 SR proteins categorized into six subfamilies. Three of the subfamilies are plant-specific with no mammalian orthologues, and the functions of these SR proteins are not well known. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) system is a genome engineering tool that cleaves the target DNA at specific locations directed by a guide RNA (gRNA). Recent advances in CRISPR/Cas9-mediated plant genome engineering make it possible to generate single and multiple functional knockout mutants in diverse plant species. In this study, we targeted each rice SR locus and produced single knockouts. To overcome the functional redundancy within each subfamily of SR genes, we utilized a polycistronic tRNA-gRNA multiplex targeting system and targeted all loci of each subfamily. Sanger sequencing results indicated that most of the targeted loci had knockout mutations. This study provides useful resource materials for understanding the molecular role of SR proteins in plant development and biotic and abiotic stress  responses.","rice","植物の成長は、転写およびプレmRNAスプライシングのレベルで遺伝子発現に影響を与えるシグナル伝達カスケードを介して、さまざまな環境および発達の手がかりに応答します。pre-mRNAの代替スプライシングは、マルチエキソン遺伝子からのゲノムのコーディングの可能性を高め、複数のメカニズムを通じて遺伝子発現を調節します。スプライシング因子の保存されたファミリーであるセリン/アルギニンリッチ（SR）タンパク質は、代替スプライシングの主要なプレーヤーであり、ストレス条件下でプレmRNAスプライシングを調節します。イネ（Oryza sativa）のゲノムは、6つのサブファミリーに分類される22のSRタンパク質をコードしています。サブファミリーのうち3つは植物特異的であり、哺乳類のオーソログはなく、これらのSRタンパク質の機能はよく知られていません。クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9（Cas9）システムは、ガイドRNA（gRNA）によって指示された特定の場所でターゲットDNAを切断するゲノムエンジニアリングツールです。CRISPR / Cas9を介した植物ゲノム工学の最近の進歩により、多様な植物種で単一および複数の機能的なノックアウト変異体を生成することが可能になりました。この研究では、各米のSR遺伝子座をターゲットにして、シングルノックアウトを作成しました。SR遺伝子の各サブファミリー内の機能的冗長性を克服するために、ポリシストロン性tRNA-gRNAマルチプレックスターゲティングシステムを利用し、各サブファミリーのすべての遺伝子座をターゲティングしました。サンガーシーケンシングの結果は、標的遺伝子座のほとんどがノックアウト変異を持っていることを示しました。この研究は、植物の発達と生物的および非生物的ストレス応答におけるSRタンパク質の分子的役割を理解するための有用なリソース資料を提供します。"]
[149,31349852,"plant","rice","CRISPR;Cas9;"," ","Genome biology","Modulating chromatin accessibility by transactivation and targeting proximal dsgRNAs enhances Cas9 editing efficiency in vivo.",2019,"20(1):145","[Liu G et al.]","Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China.",31349852,"10.1186/s13059-019-1762-8 ","The CRISPR/Cas9 system is unable to edit all targetable genomic sites with full efficiency in vivo. We show that Cas9-mediated editing is more efficient in open  chromatin regions than in closed chromatin regions in rice. A construct (Cas9-TV) formed by fusing a synthetic transcription activation domain to Cas9 edits target sites more efficiently, even in closed chromatin regions. Moreover, combining Cas9-TV with a proximally binding dead sgRNA (dsgRNA) further improves editing efficiency up to several folds. The use of Cas9-TV/dsgRNA thus provides a novel strategy for obtaining efficient genome editing in vivo, especially at nuclease-refractory target sites.","rice","CRISPR / Cas9システムは、invivoで完全な効率ですべてのターゲティング可能なゲノムサイトを編集することはできません。Cas9を介した編集は、米の閉じたクロマチン領域よりも開いたクロマチン領域でより効率的であることを示します。合成転写活性化ドメインをCas9に融合することによって形成されたコンストラクト（Cas9-TV）は、閉じたクロマチン領域であっても、標的部位をより効率的に編集します。さらに、Cas9-TVを近位に結合する死んだsgRNA（dsgRNA）と組み合わせると、編集効率が最大数倍向上します。したがって、Cas9-TV / dsgRNAの使用は、特にヌクレアーゼ不応性の標的部位で、invivoで効率的なゲノム編集を行うための新しい戦略を提供します。"]
[150,31500108,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","OsCAF1","International journal of molecular sciences","OsCAF1, a CRM Domain Containing Protein, Influences Chloroplast Development.",2019,"20(18)","[Zhang Q  et al.]","China National Rice Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou, China.",31500108,"10.3390/ijms20184386 ","The chloroplast RNA splicing and ribosome maturation (CRM) domain proteins are involved in the splicing of chloroplast gene introns. Numerous CRM domain proteins have been reported to play key roles in chloroplast development in several plant species. However, the functions of CRM domain proteins in chloroplast development in rice remain poorly understood. In the study, we generated oscaf1 albino mutants, which eventually died at the seedling stage, through the editing of OsCAF1 with two CRM domains using CRISPR/Cas9 technology.  The mesophyll cells in oscaf1 mutant had decreased chloroplast numbers and damaged chloroplast structures. OsCAF1 was located in the chloroplast, and transcripts revealed high levels in green tissues. In addition, the OsCAF1 promoted the splicing of group IIA and group IIB introns, unlike orthologous proteins of AtCAF1 and ZmCAF1, which only affected the splicing of subgroup IIB introns. We also observed that the C-terminal of OsCAF1 interacts with OsCRS2, and OsCAF1-OsCRS2 complex may participate in the splicing of group IIA and group  IIB introns in rice chloroplasts. OsCAF1 regulates chloroplast development by influencing the splicing of group II introns.","rice","葉緑体RNAスプライシングおよびリボソーム成熟（CRM）ドメインタンパク質は、葉緑体遺伝子イントロンのスプライシングに関与しています。多数のCRMドメインタンパク質が、いくつかの植物種の葉緑体の発達に重要な役割を果たすことが報告されています。ただし、イネの葉緑体の開発におけるCRMドメインタンパク質の機能はよくわかっていないままです。この研究では、CRISPR / Cas9テクノロジーを使用して2つのCRMドメインでOsCAF1を編集することにより、最終的に苗の段階で死亡したoscaf1アルビノ変異体を生成しました。oscaf1変異体の葉肉細胞は、葉緑体数が減少し、葉緑体構造が損傷していました。OsCAF1は葉緑体に位置し、転写産物は緑色組織で高レベルを示しました。さらに、OsCAF1は、サブグループIIBイントロンのスプライシングにのみ影響を与えるAtCAF1およびZmCAF1のオーソロガスタンパク質とは異なり、グループIIAおよびグループIIBイントロンのスプライシングを促進しました。また、OsCAF1のC末端がOsCRS2と相互作用し、OsCAF1-OsCRS2複合体が米葉緑体のグループIIAおよびグループIIBイントロンのスプライシングに関与している可能性があることも観察しました。OsCAF1は、グループIIイントロンのスプライシングに影響を与えることにより、葉緑体の発達を調節します。"]
[151,30781568,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","QTL qLL9","International journal of molecular sciences","Enhanced Expression of QTL qLL9/DEP1 Facilitates the Improvement of Leaf Morphology and Grain Yield in Rice.",2019,"20(4)","[Fu X et al.]","China National Rice Research Institute, Hangzhou, China.",30781568,"10.3390/ijms20040866 ","In molecular breeding of super rice, it is essential to isolate the best quantitative trait loci (QTLs) and genes of leaf shape and explore yield potential using large germplasm collections and genetic populations. In this study, a recombinant inbred line (RIL) population was used, which was derived from a cross between the following parental lines: hybrid rice Chunyou84, that is, japonica maintainer line Chunjiang16B (CJ16); and indica restorer line Chunhui 84 (C84) with remarkable leaf morphological differences. QTLs mapping of  leaf shape traits was analyzed at the heading stage under different environmental conditions in Hainan (HN) and Hangzhou (HZ). A major QTL qLL9 for leaf length was detected and its function was studied using a population derived from a single residual heterozygote (RH), which was identified in the original population. qLL9 was delimitated to a 16.17 kb region flanked by molecular markers C-1640 and C-1642, which contained three open reading frames (ORFs). We found that the candidate gene for qLL9 is allelic to DEP1 using quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR), sequence comparison, and the clustered regularly interspaced short palindromic repeat-associated Cas9 nuclease (CRISPR/Cas9) genome editing techniques. To identify the effect of qLL9 on yield, leaf shape and grain traits were measured in near isogenic lines (NILs) NIL-qLL9(CJ16) and NIL-qLL9(C84), as well as a chromosome segment substitution line (CSSL) CSSL-qLL9(KASA) with a Kasalath introgressed segment covering qLL9 in the Wuyunjing (WYJ) 7 backgrounds. Our results showed that the flag leaf lengths  of NIL-qLL9(C84) and CSSL-qLL9(KASA) were significantly different from those of NIL-qLL9(CJ16) and WYJ 7, respectively. Compared with NIL-qLL9(CJ16), the spike length, grain size, and thousand-grain weight of NIL-qLL9(C84) were significantly higher, resulting in a significant increase in yield of 15.08%. Exploring and pyramiding beneficial genes resembling qLL9(C84) for super rice breeding could increase both the source (e.g., leaf length and leaf area) and the sink (e.g., yield traits). This study provides a foundation for future investigation of the molecular mechanisms underlying the source(-)sink balance and high-yield potential of rice, benefiting high-yield molecular design breeding for global food security.","rice","スーパーライスの分子育種では、最良の定量的形質遺伝子座（QTL）と葉の形の遺伝子を分離し、大規模な生殖質コレクションと遺伝子集団を使用して収量の可能性を探求することが不可欠です。この研究では、以下の親系統間の交配に由来する組換え近交系（RIL）集団を使用しました。ハイブリッド米Chunyou84、つまりジャポニカメンテナ系統Chunjiang16B（CJ16）。葉の形態に顕著な違いがあるインディカ修復家Chunhui84（C84）。葉の形状特性のQTLマッピングは、海南（HN）と杭州（HZ）のさまざまな環境条件下での見出し段階で分析されました。葉の長さの主要なQTLqLL9が検出され、元の集団で特定された単一の残留ヘテロ接合体（RH）に由来する集団を使用してその機能が研究されました。qLL9は、分子マーカーC-1640およびC-1642が隣接する16.17 kbの領域に区切られ、3つのオープンリーディングフレーム（ORF）が含まれていました。qLL9の候補遺伝子は、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）、配列比較、およびクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドローム反復関連Cas9ヌクレアーゼ（CRISPR / Cas9）ゲノム編集技術を使用してDEP1に対立遺伝子であることがわかりました。収量に対するqLL9の影響を特定するために、葉の形状と粒子特性を同質遺伝子に近い線（NIL）NIL-qLL9（CJ16）とNIL-qLL9（C84）、および染色体セグメント置換線（CSSL）CSSL-で測定しました。 qLL9（KASA）は、Wuyunjing（WYJ）7のバックグラウンドでqLL9をカバーするKasalathの導入セグメントを備えています。NIL-qLL9（C84）とCSSL-qLL9（KASA）の旗葉の長さは、それぞれNIL-qLL9（CJ16）とWYJ7の旗葉の長さとは大きく異なることがわかりました。NIL-qLL9（CJ16）と比較して、NIL-qLL9（C84）のスパイク長、粒子サイズ、および千粒子重量は大幅に高く、15.08％の収率の大幅な増加をもたらしました。スーパーライス育種のためのqLL9（C84）に似た有益な遺伝子を探索してピラミッド化すると、ソース（葉の長さや葉の面積など）とシンク（収量特性など）の両方が増加する可能性があります。この研究は、米のソース（-）シンクバランスと高収量の可能性の根底にある分子メカニズムの将来の調査の基礎を提供し、世界的な食品安全のための高収量の分子設計育種に利益をもたらします。"]
[152,31553599,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","phospholipase D","Journal of agricultural and food chemistry","Mutational Analysis of OsPLDalpha1 Reveals Its Involvement in Phytic Acid Biosynthesis in Rice Grains.",2019,"67(41):11436-11443","[Khan MSS et al.]","Zhejiang University, Hangzhou, China.",31553599,"10.1021/acs.jafc.9b05052 ","Phospholipids and phytic acid are important phosphorus (P)-containing compounds in rice grains. Phytic acid is considered as a major antinutrient, because the negatively charged phytic acid chelates cations, including essential micronutrients, and decreases their bioavailability to human beings and monogastric animals. To gain an insight into the interplay of these two kinds of  phosphorus-containing metabolites, we used the CRISPR/Cas9 system to generate mutants of a phospholipase D gene (OsPLDalpha1) and analyzed the mutational effect on metabolites, including phytic acid in rice grains. Metabolic profiling  of two ospldalpha1 mutants revealed depletion in the phosphatidic acid production and lower accumulation of cytidine diphosphate diacylglycerol and phosphatidylinositol. The mutants also showed significantly reduced phytic acid content as compared to their wild-type parent, and the expression of the key genes involved in the phytic acid biosynthesis was altered in the mutants. These  results demonstrate that OsPLDalpha1 not only plays an important role in phospholipid metabolism but also is involved in phytic acid biosynthesis, most probably through the lipid-dependent pathway, and thus revealed a potential new route to regulate phytic acid biosynthesis in rice.","rice","リン脂質とフィチン酸は、米粒中の重要なリン（P）含有化合物です。負に帯電したフィチン酸は、必須微量栄養素を含むカチオンをキレート化し、人間や単胃動物への生物学的利用能を低下させるため、フィチン酸は主要な反栄養素と見なされています。これら2種類のリン含有代謝物の相互作用についての洞察を得るために、CRISPR / Cas9システムを使用してホスホリパーゼD遺伝子（OsPLDalpha1）の変異体を生成し、米粒中のフィチン酸を含む代謝物に対する変異効果を分析しました。2つのospldalpha1変異体の代謝プロファイリングにより、ホスファチジン酸産生の枯渇と、シチジン二リン酸ジアシルグリセロールおよびホスファチジルイノシトールの蓄積の低下が明らかになりました。変異体はまた、野生型の親と比較して有意に減少したフィチン酸含有量を示し、フィチン酸生合成に関与する重要な遺伝子の発現が変異体で変化した。これらの結果は、OsPLDalpha1がリン脂質代謝に重要な役割を果たすだけでなく、おそらく脂質依存性経路を介してフィチン酸生合成にも関与していることを示しており、イネのフィチン酸生合成を調節する潜在的な新しい経路を明らかにしました。"]
[153,31244201,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","Heme Oxygenase 1 (PE-1)","Journal of agricultural and food chemistry","PE-1, Encoding Heme Oxygenase 1, Impacts Heading Date and Chloroplast Development in Rice ( Oryza sativa L.).",2019,"67(26):7249-7257","[Rao Y  et al.]","Zhejiang Normal University, Jinhua, Zhejiang, China.",31244201,"10.1021/acs.jafc.9b01676 ","The duration of the rice growth phase has always been an important target trait.  The identification of mutations in rice that alter these processes and result in  a shorter growth phase could have potential benefits for crop production. In this study, we isolated an early aging rice mutant, pe-1, with light green leaves, using gamma-mutated indica rice cultivar and subsequent screening methods, which  is known as the phytochrome synthesis factor Se5 that controls rice flowering. The pe-1 plant is accompanied by a decreased chlorophyll content, an enhanced photosynthesis, and a decreased pollen fertility. PE-1, a close homologue of HY1, is localized in the chloroplast. Expression pattern analysis indicated that PE-1  was mainly expressed in roots, stems, leaves, leaf sheaths, and young panicles. The knockout of PE-1 using the CRISPR/Cas9 system decreased the chlorophyll content and downregulated the expression of PE-1-related genes. Furthermore, the  chloroplasts of pe-1 were filled with many large-sized starch grains, and the number of osmiophilic granules (a chloroplast lipid reservoir) was significantly  decreased. Altogether, our findings suggest that PE-1 functions as a master regulator to mediate in chlorophyll biosynthesis and photosynthetic pathways.","rice","米の成長期の期間は、常に重要な目標特性でした。これらのプロセスを変更し、より短い成長段階をもたらす米の突然変異の特定は、作物生産に潜在的な利益をもたらす可能性があります。本研究では、ガンマ変異インディカ米品種とその後のスクリーニング法（イネの開花を制御するフィトクロム合成因子Se5として知られる）を使用して、薄緑色の葉を持つ早期老化イネ変異体pe-1を単離しました。pe-1植物は、クロロフィル含有量の減少、光合成の強化、および花粉の稔性の低下を伴います。HY1の密接な相同体であるPE-1は葉緑体に局在しています。発現パターン分析は、PE-1が主に根、茎、葉、葉鞘、および若い穂で発現されたことを示した。CRISPR / Cas9システムを使用したPE-1のノックアウトは、クロロフィル含有量を減少させ、PE-1関連遺伝子の発現をダウンレギュレートしました。さらに、pe-1の葉緑体は多くの大型デンプン粒で満たされ、浸透圧性顆粒（葉緑体脂質貯蔵庫）の数は大幅に減少しました。まとめると、我々の発見は、PE-1がクロロフィル生合成と光合成経路を仲介するマスターレギュレーターとして機能することを示唆している。"]
[154,31034557,"plant","rice","Cas9;","APETALA1 (AP1)/FRUITFULL (FUL)-like transcription factor OsMADS18","Journal of experimental botany","OsMADS18, a membrane-bound MADS-box transcription factor, modulates plant architecture and the abscisic acid response in rice.",2019,"70(15):3895-3909","[Yin X et al.]","Wuhan University, Wuhan, China.",31034557,"10.1093/jxb/erz198 ","The APETALA1 (AP1)/FRUITFULL (FUL)-like transcription factor OsMADS18 plays diverse functions in rice development, but the underlying molecular mechanisms are far from fully understood. Here, we report that down-regulation of OsMADS18 expression in RNAi lines caused a delay in seed germination and young seedling growth, whereas the overexpression of OsMADS18 produced plants with fewer tillers. In targeted OsMADS18 genome-edited mutants (osmads18-cas9), an increased number of tillers, altered panicle size, and reduced seed setting were observed.  The EYFP-OsMADS18 (full-length) protein was localized to the nucleus and plasma membrane but the EYFP-OsMADS18-N (N-terminus) protein mainly localized to the nucleus. The expression of OsMADS18 could be stimulated by abscisic acid (ABA), and ABA stimulation triggered the cleavage of HA-OsMADS18 and the translocation of OsMADS18 from the plasma membrane to the nucleus. The inhibitory effect of ABA on seedling growth was less effective in the OsMADS18-overexpressing plants. The  expression of a set of ABA-responsive genes was significantly reduced in the overexpressing plants. The phenotypes of transgenic plants expressing EYFP-OsMADS18-N resembled those observed in the osmads18-cas9 mutants. Analysis of the interaction of OsMADS18 with OsMADS14, OsMADS15, and OsMADS57 strongly suggests an essential role for OsMADS18 in rice development.","rice","APETALA1（AP1）/ FRUITFULL（FUL）のような転写因子OsMADS18は、米の発育において多様な機能を果たしますが、根本的な分子メカニズムは完全には理解されていません。ここでは、RNAi系統におけるOsMADS18発現のダウンレギュレーションが種子の発芽と若い苗木の成長の遅延を引き起こしたのに対し、OsMADS18の過剰発現は分げつが少ない植物を生産したことを報告します。対象となるOsMADS18ゲノム編集変異体（osmads18-cas9）では、分げつ数の増加、穂のサイズの変化、種子の設定の減少が観察されました。EYFP-OsMADS18（全長）タンパク質は核と原形質膜に局在していたが、EYFP-OsMADS18-N（N末端）タンパク質は主に核に局在していた。OsMADS18の発現は、アブシジン酸（ABA）によって刺激される可能性があり、ABA刺激は、HA-OsMADS18の切断と、原形質膜から核へのOsMADS18の移行を引き起こしました。苗木の成長に対するABAの抑制効果は、OsMADS18を過剰発現する植物ではあまり効果的ではありませんでした。一連のABA応答性遺伝子の発現は、過剰発現する植物で有意に減少しました。EYFP-OsMADS18-Nを発現するトランスジェニック植物の表現型は、osmads18-cas9変異体で観察されたものと類似していた。OsMADS18とOsMADS14、OsMADS15、およびOsMADS57との相互作用の分析は、米の開発におけるOsMADS18の重要な役割を強く示唆しています。"]
[155,30810167,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase (OsACS)","Journal of experimental botany","Editing of the OsACS locus alters phosphate deficiency-induced adaptive responses in rice seedlings.",2019,"70(6):1927-1940","[Lee HY et al.]","Purdue University, West Lafayette, IN,  USA.",30810167,"10.1093/jxb/erz074 ","Phosphate (Pi) deficiency severely influences the growth and reproduction of plants. To cope with Pi deficiency, plants initiate morphological and biochemical adaptive responses upon sensing low Pi in the soil, and the plant hormone ethylene plays a crucial role during this process. However, how regulation of ethylene biosynthesis influences the Pi-induced adaptive responses remains unclear. Here, we determine the roles of rice 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) synthase (ACS), the rate-limiting enzymes in ethylene biosynthesis, in response to Pi deficiency. Through analysis of tissue-specific expression of OsACS in response to Pi deficiency and OsACS mutants generated by CRISPR/Cas9 [clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9] genome editing, we found that two members of the OsACS family, i.e. OsACS1 and OsACS2, are involved but differed in their importance in controlling the remodeling of root system architecture, transcriptional regulation of Pi starvation-induced genes, and cellular phosphorus homeostasis. Interestingly, in contrast to the known inhibitory role of ethylene on root elongation, both OsACS mutants, especially OsACS1, almost fail to promote lateral root growth in response to Pi deficiency, demonstrating a stimulatory role for ethylene in lateral root development under Pi-deficient conditions. Together, this study provides new insights into the roles of ethylene in Pi deficiency response in rice seedlings and the isoform-specific function of  OsACS genes in this process.","rice","リン酸塩（Pi）の欠乏は、植物の成長と繁殖に深刻な影響を及ぼします。Pi欠乏症に対処するために、植物は土壌中の低Piを感知すると形態学的および生化学的適応応答を開始し、植物ホルモンであるエチレンはこのプロセス中に重要な役割を果たします。ただし、エチレン生合成の調節がPi誘発適応応答にどのように影響するかは不明なままです。ここでは、Pi欠乏に応答して、エチレン生合成における律速酵素である米1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸（ACC）シンターゼ（ACS）の役割を決定します。Pi欠損症に応答したOsACSの組織特異的発現とCRISPR / Cas9 [クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9]ゲノム編集によって生成されたOsACS変異体の分析を通じて、OsACSの2つのメンバーが見つかりましたファミリー、すなわちOsACS1とOsACS2が関与していますが、ルートシステムアーキテクチャのリモデリング、Pi飢餓誘発遺伝子の転写調節、および細胞のリンホメオスタシスの制御における重要性が異なります。興味深いことに、根の伸長に対するエチレンの既知の阻害的役割とは対照的に、両方のOsACS変異体、特にOsACS1は、Pi欠乏に応答して側根成長を促進することがほとんどできず、Pi欠乏条件下での側根発達におけるエチレンの刺激的役割を示しています。 。一緒に、この研究は、米苗のPi欠乏反応におけるエチレンの役割とこのプロセスにおけるOsACS遺伝子のアイソフォーム特異的機能への新しい洞察を提供します。"]
[156,30623600,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","TMS5; Pi21; Xa13","Journal of integrative plant biology","Developing disease-resistant thermosensitive male sterile rice by multiplex gene  editing.",2019,"61(12):1201-1205","[Li S et al.]","China National Rice Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou, China.",30623600,"10.1111/jipb.12774 ","High-quality and disease-resistant male sterile lines have great potential for applications in hybrid rice breeding. We introduced specific mutations into the TMS5, Pi21, and Xa13 genes in Pinzhan intermediate breeding material using the CRISPR/Cas9 multiplex genome editing system. We found that the transgene-free homozygous triple tms5/pi21/xa13 mutants obtained in the T1 generation displayed  characteristics of thermosensitive genic male sterility (TGMS) with enhanced resistance to rice blast and bacterial blight. Our study provides a convenient and effective way of converting breeding intermediate material into TGMS lines through multiplex gene editing, which could significantly accelerate the breeding of sterile lines.","rice","高品質で耐病性のある雄性不稔系統は、ハイブリッド米育種への応用に大きな可能性を秘めています。CRISPR / Cas9マルチプレックスゲノム編集システムを使用して、ピンザン中間育種材料のTMS5、Pi21、およびXa13遺伝子に特定の変異を導入しました。T1世代で得られた導入遺伝子を含まないホモ接合性トリプルtms5 / pi21 / xa13変異体は、イネいもち菌および細菌性枯病に対する耐性が強化された感熱性雄性不稔（TGMS）の特性を示すことがわかりました。私たちの研究は、マルチプレックス遺伝子編集を通じて育種中間材料をTGMS系統に変換する便利で効果的な方法を提供します。これにより、無菌系統の育種を大幅に加速することができます。"]
[157,30697955,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","OsSPO11-1; OsREC8; OsOSD1; OsMATL","Journal of integrative plant biology","A strategy for generating rice apomixis by gene editing.",2019,"61(8):911-916","[Xie E et al.]","Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China.",30697955,"10.1111/jipb.12785 ","Apomixis is an asexual reproduction way of plants that can produce clonal offspring through seeds. In this study, we introduced apomixis into rice (Oryza sativa) by mutating OsSPO11-1, OsREC8, OsOSD1, and OsMATL through a CRISPR/Cas9 system. The quadruple mutant showed a transformation from meiosis to mitosis and  produced clonal diploid gametes. With mutated Osmatl, which gives rise to haploid induction in plants, the quadruple mutant is expected to be able to be produced apomictic diploid offspring. We named this quadruple mutant as AOP (Apomictic Offspring Producer) for its ability to produce apomictic offspring.","rice","Apomixisは、種子を介してクローンの子孫を生み出すことができる植物の無性生殖方法です。この研究では、CRISPR / Cas9システムを介してOsSPO11-1、OsREC8、OsOSD1、およびOsMATLを変異させることにより、アポミキシスを米（Oryza sativa）に導入しました。四重変異体は、減数分裂から有糸分裂への変化を示し、クローン二倍体配偶子を生成した。植物に一倍体の誘導を引き起こす変異オスマトルを用いて、四重変異体はアポミック二倍体の子孫を生み出すことができると期待されています。この4重変異体は、アポミック子孫を生成する能力があるため、AOP（アポミック子孫プロデューサー）と名付けました。"]
[158,30144351,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","LEAF INCLINATION 4","Journal of integrative plant biology","Rice miR394 suppresses leaf inclination through targeting an F-box gene, LEAF INCLINATION 4.",2019,"61(4):406-416","[Qu L et al.]","Shanghai Institute of Plant Physiology and Ecology, the Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China.",30144351,"10.1111/jipb.12713 ","Rice leaf inclination is an important agronomic trait, closely related to plant architecture and yield. Identification of genes controlling leaf inclination would assist in crop improvement. Although various factors, including the plant hormones auxin and brassinosteroids, have been shown to regulate lamina joint development, the role of microRNAs in regulating leaf inclination remains largely unknown. Here, we functionally characterize the role of rice miR394 and its target, LEAF INCLINCATION 4 (LC4), which encodes an F-box protein, in the regulation of leaf inclination. We show that miR394 and LC4 work, antagonistically, to regulate leaf lamina joint development and rice architecture, by modulating expansion and elongation of adaxial parenchyma cells. Suppressed expression of miR394, or enhanced expression of LC4, results in enlarged leaf angles, whereas reducing LC4 expression by CRISPR/Cas9 leads to reduced leaf inclination, suggesting LC4 as candidate for use in rice architecture improvement. LC4 interacts with SKP1, a component of the SCF E3 ubiquitin ligase complex, and transcription of both miR394 and LC4 are regulated  by auxin. Rice plants with altered expression of miR394 or LC4 have altered auxin responses, indicating that the miR394-LC4 module mediates auxin effects important for determining rice leaf inclination and architecture.","rice","イネの葉の傾きは重要な農業形質であり、植物の構造と収量に密接に関連しています。葉の傾きを制御する遺伝子の同定は、作物の改善に役立ちます。植物ホルモンのオーキシンやブラシノステロイドを含むさまざまな要因が椎弓板の関節の発達を調節することが示されていますが、葉の傾きの調節におけるマイクロRNAの役割はほとんどわかっていません。ここでは、葉の傾きの調節における、米miR394とそのターゲットであるF-boxタンパク質をコードするLEAF INCLINCATION 4（LC4）の役割を機能的に特徴付けます。miR394とLC4が拮抗的に作用し、向軸性実質細胞の拡大と伸長を調節することにより、葉の薄層関節の発達と米の構造を調節することを示します。miR394の発現が抑制されるか、LC4の発現が増強されると、葉の角度が大きくなりますが、CRISPR / Cas9によってLC4の発現が減少すると、葉の傾きが減少し、米の構造改善に使用する候補としてLC4が示唆されます。LC4はSCFE3ユビキチンリガーゼ複合体の成分であるSKP1と相互作用し、miR394とLC4の両方の転写はオーキシンによって調節されます。miR394またはLC4の発現が変化した米植物は、オーキシン応答が変化しており、miR394-LC4モジュールが米の葉の傾斜と構造を決定するために重要なオーキシン効果を媒介することを示しています。"]
[159,30530202,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","OsBIG","Journal of plant physiology","Rice BIG gene is required for seedling viability.",2019,"232:39-50","[Cheng R et al.]","Wuhan University, Wuhan, China.",30530202,"10.1016/j.jplph.2018.11.006 ","Arabidopsis BIG (AtBIG) gene encodes an enormous protein that is required for auxin transport. Loss of AtBIG function not only profoundly changes plant architecture but also alters plant adaptability to environmental stimuli. A putative homolog of AtBIG exists in the rice genome, but no function has been ascribed to it. In this study, we focus on the characterization of the gene structure and function of OsBIG. Sequence and phylogenetic analysis shows that the homologs of OsBIG have high amino acid conservation in several domains across species. Transgenic rice plants in which the expression of OsBIG was disrupted through the CRISPR/Cas9 system-mediated genome editing were used for phenotypic analysis. The Osbig/- plants show high levels of cell death, enhanced electrolyte leakage and membrane lipid peroxidation, and reduced chlorophyll content, which likely accounted for the seedling lethality. Moreover, gene expression between Osbig/- and wild-type plants analyzed by RNA-seq indicates that a number of metabolic and hormonal pathways including ribosome, DNA replication, photosynthesis, and chlorophyll metabolism were significantly perturbed by OsBIG  deficiency. In summary, OsBIG gene is integral to the normal growth and development in rice.","rice","シロイヌナズナのBIG（AtBIG）遺伝子は、オーキシンの輸送に必要な巨大なタンパク質をコードしています。AtBIG機能の喪失は、植物の構造を大きく変えるだけでなく、環境刺激に対する植物の適応性も変えます。AtBIGの推定ホモログは米のゲノムに存在しますが、機能はありません。この研究では、OsBIGの遺伝子構造と機能の特性評価に焦点を当てます。配列および系統発生分析は、OsBIGのホモログが種全体のいくつかのドメインで高いアミノ酸保存を持っていることを示しています。OsBIGの発現がCRISPR / Cas9システムを介したゲノム編集によって破壊されたトランスジェニックイネを表現型分析に使用しました。Osbig /-植物は、高レベルの細胞死、電解質漏出と膜脂質過酸化の増強、およびクロロフィル含有量の減少を示し、これが実生の致死性の原因である可能性があります。さらに、RNA-seqによって分析されたOsbig /-と野生型植物の間の遺伝子発現は、リボソーム、DNA複製、光合成、およびクロロフィル代謝を含む多くの代謝およびホルモン経路がOsBIG欠損によって著しく乱されたことを示しています。要約すると、OsBIG遺伝子はイネの正常な成長と発達に不​​可欠です。"]
[160,31493565,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","putative sugar transporter genes (OsSWEET11; OsSWEET14; OsSWEET13)","Molecular plant","Engineering Broad-Spectrum Bacterial Blight Resistance by Simultaneously Disrupting Variable TALE-Binding Elements of Multiple Susceptibility Genes in Rice.",2019,"12(11):1434-1446","[Xu Z et al.]","Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China.",31493565,"10.1016/j.molp.2019.08.006 ","Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), the causal agent of bacterial blight of rice, employs the transcription activator-like effectors (TALEs) to induce the expression of the OsSWEET family of putative sugar transporter genes, which function in conferring disease susceptibility (S) in rice plants. To engineer broad-spectrum bacterial blight resistance, we used CRISPR/Cas9-mediated gene editing to disrupt the TALE-binding elements (EBEs) of two S genes, OsSWEET11 and OsSWEET14, in rice cv. Kitaake, which harbors the recessive resistance allele of  Xa25/OsSWEET13. The engineered rice line MS14K exhibited broad-spectrum resistance to most Xoo strains with a few exceptions, suggesting that the compatible strains may contain new TALEs. We identified two PthXo2-like TALEs, Tal5LN18 and Tal7PXO61, as major virulence factors in the compatible Xoo strains  LN18 and PXO61, respectively, and found that Xoo encodes at least five types of PthXo2-like effectors. Given that PthXo2/PthXo2.1 target OsSWEET13 for transcriptional activation, the genomes of 3000 rice varieties were analyzed for  EBE variationsin the OsSWEET13 promoter, and 10 Xa25-like haplotypes were identified. We found that Tal5LN18 and Tal7PXO61 bind slightly different EBE sequences in the OsSWEET13 promoter to activate its expression. CRISPR/Cas9 technology was then used to generate InDels in the EBE of the OsSWEET13 promoter  in MS14K to creat a new germplasm with three edited OsSWEET EBEs and broad-spectrum resistance against all Xoo strains tested. Collectively, our findings illustrate how to disarm TALE-S co-evolved loci to generate broad-spectrum resistance through the loss of effector-triggered susceptibility in plants.","rice","Xanthomonas oryzaepv。米の青枯病の原因物質であるオリザエ（Xoo）は、転写活性化因子様エフェクター（TALE）を使用して、米植物に疾患感受性（S）を与える働きをする推定糖輸送遺伝子のOsSWEETファミリーの発現を誘導します。 。広域スペクトルの細菌性枯病抵抗性を操作するために、CRISPR / Cas9を介した遺伝子編集を使用して、米cvの2つのS遺伝子OsSWEET11とOsSWEET14のTALE結合要素（EBE）を破壊しました。Xa25 / OsSWEET13の劣性抵抗性対立遺伝子を宿す北明。人工米系統MS14Kは、いくつかの例外を除いて、ほとんどのXoo菌株に対して幅広い耐性を示し、互換性のある菌株に新しいTALEが含まれている可能性があることを示唆しています。2つのPthXo2のようなTALE、Tal5LN18とTal7PXO61を、それぞれ互換性のあるXoo株LN18とPXO61の主要な毒性因子として特定し、Xooが少なくとも5種類のPthXo2のようなエフェクターをエンコードすることを発見しました。PthXo2 / PthXo2.1が転写活性化のためにOsSWEET13を標的とすることを考えると、3000の米品種のゲノムがOsSWEET13プロモーターのEBE変動について分析され、10のXa25様ハプロタイプが同定されました。Tal5LN18とTal7PXO61は、OsSWEET13プロモーターのわずかに異なるEBE配列に結合して、その発現を活性化することがわかりました。次に、CRISPR / Cas9テクノロジーを使用してMS14KのOsSWEET13プロモーターのEBEでInDelsを生成し、3つの編集されたOsSWEETEBEとテストされたすべてのXoo株に対する広域スペクトル耐性を備えた新しい生殖質を作成しました。まとめると、私たちの調査結果は、TALE-Sの共進化遺伝子座を武装解除して、植物のエフェクター誘発感受性の喪失を通じて広域スペクトル耐性を生成する方法を示しています。"]
[161,30928637,"plant","rice","Cas9;","16 possible NGN PAM (protospacer adjacent motif) combinations","Molecular plant","Improving Plant Genome Editing with High-Fidelity xCas9 and Non-canonical PAM-Targeting Cas9-NG.",2019,"12(7):1027-1036","[Zhong Z et al.]","University of Electronic Science and Technology of China,  Chengdu, China.",30928637,"10.1016/j.molp.2019.03.011 ","Two recently engineered SpCas9 variants, namely xCas9 and Cas9-NG, show promising potential in improving targeting specificity and broadening the targeting range.  In this study, we evaluated these Cas9 variants in the model and crop plant, rice. We first tested xCas9-3.7, the most effective xCas9 variant in mammalian cells, for targeted mutagenesis at 16 possible NGN PAM (protospacer adjacent motif) combinations in duplicates. xCas9 exhibited nearly equivalent editing efficiency to wild-type Cas9 (Cas9-WT) at most canonical NGG PAM sites tested, whereas it showed limited activity at non-canonical NGH (H = A, C, T) PAM sites.  High editing efficiency of xCas9 at NGG PAMs was further demonstrated with C to T base editing by both rAPOBEC1 and PmCDA1 cytidine deaminases. With mismatched sgRNAs, we found that xCas9 had improved targeting specificity over the Cas9-WT.  Furthermore, we tested two Cas9-NG variants, Cas9-NGv1 and Cas9-NG, for targeting NGN PAMs. Both Cas9-NG variants showed higher editing efficiency at most non-canonical NG PAM sites tested, and enabled much more efficient editing than xCas9 at AT-rich PAM sites such as GAT, GAA, and CAA. Nevertheless, we found that Cas9-NG variants showed significant reduced activity at the canonical NGG PAM sites. In stable transgenic rice lines, we demonstrated that Cas9-NG had much higher editing efficiency than Cas9-NGv1 and xCas9 at NG PAM sites. To expand the base-editing scope, we developed an efficient C to T base-editing system by making fusion of Cas9-NG nickase (D10A version), PmCDA1, and UGI. Taken together, our work benchmarked xCas9 as a high-fidelity nuclease for targeting canonical NGG PAMs and Cas9-NG as a preferred variant for targeting relaxed PAMs for plant  genome editing.","rice","最近設計された2つのSpCas9バリアント、つまりxCas9とCas9-NGは、ターゲティングの特異性を改善し、ターゲティング範囲を広げるという有望な可能性を示しています。この研究では、モデルおよび作物植物である米でこれらのCas9バリアントを評価しました。最初に、哺乳類細胞で最も効果的なxCas9バリアントであるxCas9-3.7を、16の可能なNGN PAM（プロトスペーサー隣接モチーフ）の組み合わせでの標的突然変異誘発について重複してテストしました。xCas9は、テストしたほとんどの正規NGG PAMサイトで野生型Cas9（Cas9-WT）とほぼ同等の編集効率を示しましたが、非正規NGH（H = A、C、T）PAMサイトでは限られたアクティビティを示しました。NGG PAMでのxCas9の高い編集効率は、rAPOBEC1とPmCDA1の両方のシチジンデアミナーゼによるCからTへの塩基編集でさらに実証されました。sgRNAが一致しない場合、xCas9はCas9-WTよりもターゲティング特異性が向上していることがわかりました。さらに、NGN PAMをターゲットにするために、2つのCas9-NGバリアント、Cas9-NGv1とCas9-NGをテストしました。両方のCas9-NGバリアントは、テストされたほとんどの非正規NG PAMサイトで高い編集効率を示し、GAT、GAA、CAAなどのATが豊富なPAMサイトでxCas9よりもはるかに効率的な編集を可能にしました。それにもかかわらず、Cas9-NGバリアントは標準的なNGGPAMサイトで大幅に低下した活性を示すことがわかりました。安定したトランスジェニック米系統では、NGPAMサイトでCas9-NGがCas9-NGv1およびxCas9よりもはるかに高い編集効率を持っていることを示しました。ベース編集の範囲を拡大するために、Cas9-NGニッカーゼ（D10Aバージョン）、PmCDA1、およびUGIを融合させることにより、効率的なCからTへのベース編集システムを開発しました。まとめると、私たちの研究は、標準的なNGG PAMをターゲットとする高忠実度のヌクレアーゼとしてxCas9をベンチマークし、植物ゲノム編集のためにリラックスしたPAMをターゲットとする好ましいバリアントとしてCas9-NGをベンチマークしました。"]
[162,30928636,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","target sites with NG and GAT PAM sequences","Molecular plant","Genome Engineering in Rice Using Cas9 Variants that Recognize NG PAM Sequences.",2019,"12(7):1003-1014","[Hua K et al.]","Shanghai Center for Plant Stress Biology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China.",30928636,"10.1016/j.molp.2019.03.009 ","CRISPR/Cas9 genome editing relies on sgRNA-target DNA base pairing and a short downstream PAM sequence to recognize target DNA. The strict protospacer adjacent  motif (PAM) requirement hinders applications of the CRISPR/Cas9 system since it restricts the targetable sites in the genomes. xCas9 and SpCas9-NG are two recently engineered SpCas9 variants that can recognize more relaxed NG PAMs, implying a great potential in addressing the issue of PAM constraint. Here we use stable transgenic lines to evaluate the efficacies of xCas9 and SpCas9-NG in performing gene editing and base editing in rice. We found that xCas9 can efficiently induce mutations at target sites with NG and GAT PAM sequences in rice. However, base editors containing xCas9 failed to edit most of the tested target sites. SpCas9-NG exhibited a robust editing activity at sites with various NG PAMs without showing any preference for the third nucleotide after NG. Moreover, we showed that xCas9 and SpCas9-NG have higher specificity than SpCas9  at the CGG PAM site. We further demonstrated that different forms of cytosine or  adenine base editors containing SpCas9-NG worked efficiently in rice with broadened PAM compatibility. Taken together, our work has yielded versatile genome-engineering tools that will significantly expand the target scope in rice  and other crops.","rice","CRISPR / Cas9ゲノム編集は、sgRNA-ターゲットDNAベースペアリングと短いダウンストリームPAMシーケンスに依存してターゲットDNAを認識します。厳密なプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の要件は、ゲノム内のターゲット可能なサイトを制限するため、CRISPR / Cas9システムのアプリケーションを妨げます。xCas9とSpCas9-NGは、よりリラックスしたNG PAMを認識できる最近設計された2つのSpCas9バリアントであり、PAM制約の問題に対処する大きな可能性を示唆しています。ここでは、安定したトランスジェニック系統を使用して、米の遺伝子編集と塩基編集の実行におけるxCas9とSpCas9-NGの有効性を評価します。xCas9は、イネのNGおよびGATPAM配列を持つ標的部位で効率的に突然変異を誘発できることがわかりました。ただし、xCas9を含むベースエディタは、テストされたターゲットサイトのほとんどを編集できませんでした。SpCas9-NGは、さまざまなNG PAMのあるサイトで強力な編集アクティビティを示しましたが、NG後の3番目のヌクレオチドに対する優先度は示されませんでした。さらに、CGGPAMサイトでxCas9とSpCas9-NGがSpCas9よりも高い特異性を持っていることを示しました。さらに、SpCas9-NGを含むさまざまな形態のシトシンまたはアデニンベースエディターが、PAMの互換性が拡張された米で効率的に機能することを実証しました。まとめると、私たちの仕事は、米や他の作物の対象範囲を大幅に拡大する多用途のゲノムエンジニアリングツールを生み出しました。"]
[163,30928635,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","OsBZR1","Molecular plant","Cas9-NG Greatly Expands the Targeting Scope of the Genome-Editing Toolkit by Recognizing NG and Other Atypical PAMs in Rice.",2019,"12(7):1015-1026","[Ren B et al.]","Sichuan University, Chengdu, China.",30928635,"10.1016/j.molp.2019.03.010 ","CRISPR technologies enabling precise genome manipulation are valuable for gene function studies and molecular crop breeding. However, the requirement of a protospacer adjacent motif (PAM), such as NGG and TTN, for Cas protein recognition restricts the selection of targetable genomic loci in practical applications of CRISPR technologies. Recently Cas9-NG, which recognizes a minimal NG PAM, was reported to expand the targeting space of genome editing in human cells, but it remains unclear whether this Cas9 variant can be used in plants. In this study, we evaluated the nuclease activity of Cas9-NG toward various NGN PAMs by targeting endogenous genes in transgenic rice. We found that Cas9-NG edits all NGG, NGA, NGT, and NGC sites with impaired activity, while the gene-edited plants were dominated by monoallelic mutations. Cas9-NG-engineered base editors were then developed and used to generate OsBZR1 gain-of-function plants that can not be created by other available Cas9-engineered base editors. Moreover, we showed that a Cas9-NG-based transcriptional activator efficiently upregulated the expression of endogenous target genes in rice. In addition, we discovered that Cas9-NG recognizes NAC, NTG, NTT, and NCG apart from NG PAM. Together, these findings demonstrate that Cas9-NG can greatly expand the targeting scope of genome-editing tools, showing great potential for targeted genome editing, base editing, and genome regulation in plants.","rice","正確なゲノム操作を可能にするCRISPRテクノロジーは、遺伝子機能の研究や分子作物の育種に役立ちます。ただし、Casタンパク質認識のためのNGGやTTNなどのプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の要件は、CRISPRテクノロジーの実際のアプリケーションでのターゲット可能なゲノム遺伝子座の選択を制限します。最近、最小限のNG PAMを認識するCas9-NGが、ヒト細胞におけるゲノム編集のターゲティング空間を拡大することが報告されましたが、このCas9バリアントが植物で使用できるかどうかは不明です。この研究では、トランスジェニックイネの内因性遺伝子を標的とすることにより、さまざまなNGNPAMに対するCas9-NGのヌクレアーゼ活性を評価しました。Cas9-NGは、活動が損なわれたすべてのNGG、NGA、NGT、およびNGCサイトを編集しますが、遺伝子編集された植物は単対立遺伝子変異によって支配されていることがわかりました。次に、Cas9-NGで設計されたベースエディターが開発され、他の利用可能なCas9で設計されたベースエディターでは作成できないOsBZR1機能獲得プラントを生成するために使用されました。さらに、Cas9-NGベースの転写活性化因子がイネの内因性標的遺伝子の発現を効率的にアップレギュレートすることを示しました。さらに、Cas9-NGはNG PAMとは別に、NAC、NTG、NTT、およびNCGを認識することを発見しました。総合すると、これらの調査結果は、Cas9-NGがゲノム編集ツールのターゲティング範囲を大幅に拡大できることを示しており、植物におけるターゲットゲノム編集、塩基編集、およびゲノム調節の大きな可能性を示しています。"]
[164,31607684,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","vacuolar invertase (osvin2-1; osvin2-3)","Molecules and cells","The Role of Rice Vacuolar Invertase2 in Seed Size Control.",2019,"42(10):711-720","[Lee DW et al.]","Kyung Hee University, Yongin, Korea.",31607684,"10.14348/molcells.2019.0109 ","Sink strength optimizes sucrose import, which is fundamental to support developing seed grains and increase crop yields, including those of rice (Oryza sativa). In this regard, little is known about the function of vacuolar invertase (VIN) in controlling sink strength and thereby seed size. Here, in rice we analyzed mutants of two VINs, OsVIN1 and OsVIN2, to examine their role during seed development. In a phenotypic analysis of the T-DNA insertion mutants, only the OsVIN2 mutant osvin2-1 exhibited reduced seed size and grain weight. Scanning electron microscopy analysis revealed that the small seed grains of osvin2-1 can  be attributed to a reduction in spikelet size. A significant decrease in VIN activity and hexose level in the osvin2-1 spikelets interfered with spikelet growth. In addition, significant reduction in starch and increase in sucrose, which are characteristic features of reduced turnover and flux of sucrose due to  impaired sink strength, were evident in the pre-storage stage of osvin2-1 developing grains. In situ hybridization analysis found that expression of OsVIN2 was predominant in the endocarp of developing grains. A genetically complemented  line with a native genomic clone of OsVIN2 rescued reduced VIN activity and seed  size. Two additional mutants, osvin2-2 and osvin2-3 generated by the CRISPR/Cas9  method, exhibited phenotypes similar to those of osvin2-1 in spikelet and seed size, VIN activity, and sugar metabolites. These results clearly demonstrate an important role of OsVIN2 as sink strength modulator that is critical for the maintenance of sucrose flux into developing seed grains.","rice","シンク強度は、スクロースの輸入を最適化します。これは、種子粒の発達をサポートし、米（Oryza sativa）を含む作物の収量を増やすための基本です。この点に関して、シンク強度を制御し、それによって種子サイズを制御する際の空胞インベルターゼ（VIN）の機能についてはほとんど知られていない。ここでは、米で2つのVIN、OsVIN1とOsVIN2の変異体を分析し、種子の発育中のそれらの役割を調べました。T-DNA挿入変異体の表現型分析では、OsVIN2変異体osvin2-1のみが種子サイズと粒子重量の減少を示しました。走査型電子顕微鏡分析により、osvin2-1の小さな種子粒子はスパイクレットサイズの減少に起因する可能性があることが明らかになりました。osvin2-1小穂のVIN活性とヘキソースレベルの有意な減少は、小穂の成長を妨げました。さらに、シンク強度の低下によるショ糖のターンオーバーとフラックスの減少の特徴であるデンプンの大幅な減少とショ糖の増加は、osvin2-1の発育中の穀物の貯蔵前の段階で明らかでした。インサイチュハイブリダイゼーション分析は、OsVIN2の発現が発育中の穀物の内果皮で優勢であることを発見した。OsVIN2のネイティブゲノムクローンで遺伝的に補完された系統は、VIN活性と種子サイズの低下を救いました。CRISPR / Cas9メソッドによって生成された2つの追加の変異体、osvin2-2とosvin2-3は、小穂と種子のサイズ、VIN活性、および糖代謝物においてosvin2-1と同様の表現型を示しました。これらの結果は、発育中の種子粒子へのスクロースフラックスの維持に重要なシンク強度モジュレーターとしてのOsVIN2の重要な役割を明確に示しています。"]
[165,31659338,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","effector-binding elements in SWEET gene promoters","Nature biotechnology","Diagnostic kit for rice blight resistance.",2019,"37(11):1372-1379","[Eom JS et al.]","Heinrich Heine University of Dusseldorf, Dusseldorf, Germany.",31659338,"10.1038/s41587-019-0268-y ","Blight-resistant rice lines are the most effective solution for bacterial blight, caused by Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo). Key resistance mechanisms involve  SWEET genes as susceptibility factors. Bacterial transcription activator-like (TAL) effectors bind to effector-binding elements (EBEs) in SWEET gene promoters  and induce SWEET genes. EBE variants that cannot be recognized by TAL effectors abrogate induction, causing resistance. Here we describe a diagnostic kit to enable analysis of bacterial blight in the field and identification of suitable resistant lines. Specifically, we include a SWEET promoter database, RT-PCR primers for detecting SWEET induction, engineered reporter rice lines to visualize SWEET protein accumulation and knock-out rice lines to identify virulence mechanisms in bacterial isolates. We also developed CRISPR-Cas9 genome-edited Kitaake rice to evaluate the efficacy of EBE mutations in resistance, software to predict the optimal resistance gene set for a specific geographic region, and two resistant 'mega' rice lines that will empower farmers  to plant lines that are most likely to resist rice blight.","rice","Xanthomonas oryzae pvによって引き起こされる細菌性枯病の最も効果的な解決策は、耐病性の米系統です。oryzae（Xoo）。主要な耐性メカニズムには、感受性因子としてSWEET遺伝子が関与しています。細菌転写活性化因子様（TAL）エフェクターは、SWEET遺伝子プロモーターのエフェクター結合要素（EBE）に結合し、SWEET遺伝子を誘導します。TALエフェクターが認識できないEBEバリアントは誘導を無効にし、耐性を引き起こします。ここでは、フィールドでの細菌の枯死の分析と適切な耐性系統の識別を可能にする診断キットについて説明します。具体的には、SWEETプロモーターデータベース、SWEET誘導を検出するためのRT-PCRプライマー、SWEETタンパク質の蓄積を視覚化するための人工レポーターライスライン、細菌分離株の毒性メカニズムを特定するためのノックアウトライスラインが含まれます。また、CRISPR-Cas9ゲノム編集キタケイネを開発して、耐性におけるEBE変異の有効性を評価し、特定の地理的地域に最適な耐性遺伝子セットを予測するソフトウェア、および農家が系統を植えることができる2つの耐性「メガ」イネ系統を開発しました。イネの枯死に抵抗する可能性が最も高いです。"]
[166,31659337,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","sucrose transporter genes (SWEET11; SWEET13; SWEET14 gene promoters)","Nature biotechnology","Broad-spectrum resistance to bacterial blight in rice using genome editing.",2019,"37(11):1344-1350","[Oliva R  et al.]","International Rice Research Institute, Metro Manila, Philippines.",31659337,"10.1038/s41587-019-0267-z ","Bacterial blight of rice is an important disease in Asia and Africa. The pathogen, Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), secretes one or more of six known  transcription-activator-like effectors (TALes) that bind specific promoter sequences and induce, at minimum, one of the three host sucrose transporter genes SWEET11, SWEET13 and SWEET14, the expression of which is required for disease susceptibility. We used CRISPR-Cas9-mediated genome editing to introduce mutations in all three SWEET gene promoters. Editing was further informed by sequence analyses of TALe genes in 63 Xoo strains, which revealed multiple TALe variants for SWEET13 alleles. Mutations were also created in SWEET14, which is also targeted by two TALes from an African Xoo lineage. A total of five promoter  mutations were simultaneously introduced into the rice line Kitaake and the elite mega varieties IR64 and Ciherang-Sub1. Paddy trials showed that genome-edited SWEET promoters endow rice lines with robust, broad-spectrum resistance.","rice","イネの細菌性枯病は、アジアとアフリカの重要な病気です。病原体、Xanthomonas oryzaepv。oryzae（Xoo）は、特定のプロモーター配列に結合し、少なくとも3つの宿主スクローストランスポーター遺伝子SWEET11、SWEET13、およびSWEET14の1つを誘導する、6つの既知の転写活性化因子様エフェクター（TALes）の1つ以上を分泌します。病気の感受性のために必要です。CRISPR-Cas9を介したゲノム編集を使用して、3つすべてのSWEET遺伝子プロモーターに変異を導入しました。編集は、63のXoo株のTALe遺伝子の配列分析によってさらに通知され、SWEET13対立遺伝子の複数のTALeバリアントが明らかになりました。変異はSWEET14でも作成されました。これも、アフリカのXoo系統の2つのTALのターゲットです。合計5つのプロモーター変異がイネの北明とエリートメガ品種IR64およびCiherang-Sub1に同時に導入されました。水田試験では、ゲノム編集されたSWEETプロモーターが、強力で幅広いスペクトルの耐性を米系統に与えることが示されました。"]
[167,30886437,"plant","rice","CRISPR;Cpf1;","acetolactate synthase (ALS)","Nature biotechnology","Precise gene replacement in rice by RNA transcript-templated homologous recombination.",2019,"37(4):445-450","[Li S et al.]","Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, China.",30886437,"10.1038/s41587-019-0065-7 ","One of the main obstacles to gene replacement in plants is efficient delivery of  a donor repair template (DRT) into the nucleus for homology-directed DNA repair (HDR) of double-stranded DNA breaks. Production of RNA templates in vivo for transcript-templated HDR (TT-HDR) could overcome this problem, but primary transcripts are often processed and transported to the cytosol, rendering them unavailable for HDR. We show that coupling CRISPR-Cpf1 (CRISPR from Prevotella and Francisella 1) to a CRISPR RNA (crRNA) array flanked with ribozymes, along with a DRT flanked with either ribozymes or crRNA targets, produces primary transcripts that self-process to release the crRNAs and DRT inside the nucleus. We replaced the rice acetolactate synthase gene (ALS) with a mutated version using a DNA-free ribonucleoprotein complex that contains the recombinant Cpf1, crRNAs, and DRT transcripts. We also produced stable lines with two desired mutations in the ALS gene using TT-HDR.","rice","植物における遺伝子置換の主な障害の1つは、二本鎖DNA切断の相同性指向DNA修復（HDR）のためのドナー修復テンプレート（DRT）の核への効率的な送達です。転写物テンプレートHDR（TT-HDR）用のRNAテンプレートをin vivoで作成すると、この問題を克服できますが、一次転写物は処理されて細胞質ゾルに輸送されることが多く、HDRで使用できなくなります。CRISPR-Cpf1（PrevotellaおよびFrancisella 1のCRISPR）をリボザイムまたはcrRNAターゲットのいずれかが隣接するDRTとともに、リボザイムが隣接するCRISPR RNA（crRNA）アレイに結合すると、自己処理してcrRNAを放出する一次転写産物が生成されることを示します。核内のDRT。組換えCpf1、crRNA、およびDRT転写産物を含むDNAを含まないリボヌクレオプロテイン複合体を使用して、米アセト乳酸シンターゼ遺伝子（ALS）を変異バージョンに置き換えました。また、TT-HDRを使用して、ALS遺伝子に2つの望ましい変異を持つ安定した系統を作成しました。"]
[168,30610223,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","REC8; PAIR1; OSD1; MATRILINEAL (MTL) ","Nature biotechnology","Clonal seeds from hybrid rice by simultaneous genome engineering of meiosis and fertilization genes.",2019,"37(3):283-286","[Wang C et al.]","China National Rice Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou, China.",30610223,"10.1038/s41587-018-0003-0 ","Heterosis, or hybrid vigor, is exploited by breeders to produce elite high-yielding crop lines, but beneficial phenotypes are lost in subsequent generations owing to genetic segregation. Clonal propagation through seeds would  enable self-propagation of F1 hybrids. Here we report a strategy to enable clonal reproduction of F1 rice hybrids through seeds. We fixed the heterozygosity of F1  hybrid rice by multiplex CRISPR-Cas9 genome editing of the REC8, PAIR1 and OSD1 meiotic genes to produce clonal diploid gametes and tetraploid seeds. Next, we demonstrated that editing the MATRILINEAL (MTL) gene (involved in fertilization)  could induce formation of haploid seeds in hybrid rice. Finally, we combined fixation of heterozygosity and haploid induction by simultaneous editing of all four genes (REC8, PAIR1, OSD1 and MTL) in hybrid rice and obtained plants that could propagate clonally through seeds. Application of our method may enable self-propagation of a broad range of elite F1 hybrid crops.","rice","ヘテロシス、またはハイブリッド活力は、エリートの高収量作物系統を生産するために育種家によって利用されますが、有益な表現型は、遺伝的分離のために次の世代で失われます。種子を介したクローン増殖は、F1ハイブリッドの自己増殖を可能にします。ここでは、種子を介してF1ライスハイブリッドのクローン複製を可能にする戦略を報告します。REC8、PAIR1、OSD1減数分裂遺伝子のマルチプレックスCRISPR-Cas9ゲノム編集により、F1ハイブリッドライスのヘテロ接合性を修正し、クローンの2倍体配偶子と4倍体種子を生成しました。次に、MATRILINEAL（MTL）遺伝子（施肥に関与）を編集すると、ハイブリッド米で半数体種子の形成が誘導される可能性があることを示しました。最後に、ハイブリッド米の4つの遺伝子すべて（REC8、PAIR1、OSD1、MTL）を同時に編集することにより、ヘテロ接合性の固定と半数体誘導を組み合わせ、種子を介してクローン的に増殖できる植物を得ました。私たちの方法を適用することで、幅広いエリートF1ハイブリッド作物の自己増殖が可能になるかもしれません。"]
[169,30911123,"plant","rice","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;"," ","Nature plants","An efficient DNA- and selectable-marker-free genome-editing system using zygotes  in rice.",2019,"5(4):363-368","[Toda E  et al.]","RIKEN Cluster for Science, Yokohama, Japan.",30911123,"10.1038/s41477-019-0386-z ","Technology involving the targeted mutagenesis of plants using programmable nucleases has been developing rapidly and has enormous potential in next-generation plant breeding. Notably, the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein-9 nuclease (Cas9) (CRISPR-Cas9) system has paved the way for the development of rapid and cost-effective procedures to create new mutant populations in plants(1,2). Although genome-edited plants from multiple species have been produced successfully using a method in which a Cas9-guide RNA (gRNA) expression cassette  and selectable marker are integrated into the genomic DNA by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation or particle bombardment(3), CRISPR-Cas9 integration increases the chance of off-target modifications(4), and foreign DNA  sequences cause legislative concerns about genetically modified organisms(5). Therefore, DNA-free genome editing has been developed, involving the delivery of  preassembled Cas9-gRNA ribonucleoproteins (RNPs) into protoplasts derived from somatic tissues by polyethylene glycol-calcium (PEG-Ca(2+))-mediated transfection in tobacco, Arabidopsis, lettuce, rice(6), Petunia(7), grapevine, apple(8) and potato(9), or into embryo cells by biolistic bombardment in maize(10) and wheat(11). However, the isolation and culture of protoplasts is not feasible in most plant species and the frequency of obtaining genome-edited plants through biolistic bombardment is relatively low. Here, we report a genome-editing system  via direct delivery of Cas9-gRNA RNPs into plant zygotes. Cas9-gRNA RNPs were transfected into rice zygotes produced by in vitro fertilization of isolated gametes(12) and the zygotes were cultured into mature plants in the absence of selection agents, resulting in the regeneration of rice plants with targeted mutations in around 14-64% of plants. This efficient plant-genome-editing system  has enormous potential for the improvement of rice as well as other important crop species.","rice","プログラム可能なヌクレアーゼを使用した植物の標的突然変異誘発を含む技術は急速に発展しており、次世代の植物育種において大きな可能性を秘めています。特に、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）-CRISPR関連タンパク質-9ヌクレアーゼ（Cas9）（CRISPR-Cas9）システムは、植物に新しい変異体集団を作成するための迅速で費用効果の高い手順の開発への道を開きました（1,2）。複数の種からのゲノム編集植物は、Cas9-guide RNA（gRNA）発現カセットと選択可能なマーカーがAgrobacterium tumefaciensを介した形質転換または粒子衝撃（3）、CRISPRによってゲノムDNAに組み込まれる方法を使用して成功裏に生産されています。 -Cas9の統合により、オフターゲット修飾の可能性が高まり（4）、外来DNA配列により、遺伝子組み換え生物に関する法的な懸念が生じます（5）。したがって、DNAを含まないゲノム編集が開発され、事前に組み立てられたCas9-gRNAリボヌクレオプロテイン（RNP）が、タバコ、アラビドプシスでのポリエチレングリコールカルシウム（PEG-Ca（2+））を介したトランスフェクションによって体細胞由来のプロトプラストに送達されます。 、レタス、ライス（6）、ペチュニア（7）、グレープバイン、アップル（8）、ポテト（9）、またはトウモロコシ（10）と小麦（11）への生物的衝撃による胚細胞への侵入。ただし、プロトプラストの分離と培養はほとんどの植物種で実行可能ではなく、生物的衝撃によってゲノム編集された植物を取得する頻度は比較的低いです。ここでは、Cas9-gRNARNPを植物接合子に直接送達することによるゲノム編集システムについて報告します。Cas9-gRNA RNPは、単離された配偶子のin vitro施肥によって生成されたイネザイゴットにトランスフェクトされ（12）、ザイゴットは選択剤の非存在下で成熟植物に培養され、約14〜64の標的変異を有するイネ植物の再生をもたらしました。植物の％。この効率的な植物ゲノム編集システムは、米やその他の重要な作物種の改善に大きな可能性を秘めています。"]
[170,31264225,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","OsOPR7","New phytologist","OsPEX5 regulates rice spikelet development through modulating jasmonic acid biosynthesis.",2019,"224(2):712-724","[You X et al.]","Nanjing Agricultural University, Nanjing, China.",31264225,"10.1111/nph.16037 ","Spikelet is the primary reproductive structure and a critical determinant of grain yield in rice. The molecular mechanisms regulating rice spikelet development still remain largely unclear. Here, we report that mutations in OsPEX5, which encodes a peroxisomal targeting sequence 1 (PTS1) receptor protein, cause abnormal spikelet morphology. We show that OsPEX5 can physically interact with OsOPR7, an enzyme involved in jasmonic acid (JA) biosynthesis and is required for its import into peroxisome. Similar to Ospex5 mutant, the knockout mutant of OsOPR7 generated via CRISPR-Cas9 technology has reduced levels of endogenous JA and also displays an abnormal spikelet phenotype. Application of exogenous JA can partially rescue the abnormal spikelet phenotype of Ospex5 and Osopr7. Furthermore, we show that OsMYC2 directly binds to the promoters of OsMADS1, OsMADS7 and OsMADS14 to activate their expression, and subsequently regulate spikelet development. Our results suggest that OsPEX5 plays a critical role in regulating spikelet development through mediating peroxisomal import of OsOPR7, therefore providing new insights into regulation of JA biosynthesis in plants and expanding our understanding of the biological role of JA in regulating rice reproduction.","rice","スパイクレットは主要な生殖構造であり、米の穀物収量の重要な決定要因です。米のスパイクレットの発達を調節する分子メカニズムは、まだほとんど不明なままです。ここでは、ペルオキシソームターゲティング配列1（PTS1）受容体タンパク質をコードするOsPEX5の変異が、異常なスパイクレット形態を引き起こすことを報告します。OsPEX5は、ジャスモン酸（JA）生合成に関与し、ペルオキシソームへのインポートに必要な酵素であるOsOPR7と物理的に相互作用できることを示しています。Ospex5変異体と同様に、CRISPR-Cas9テクノロジーを介して生成されたOsOPR7のノックアウト変異体は、内因性JAのレベルが低下し、異常なスパイクレット表現型も示します。外因性JAの適用は、Ospex5およびOsopr7の異常なスパイクレット表現型を部分的に救済することができます。さらに、OsMYC2がOsMADS1、OsMADS7、およびOsMADS14のプロモーターに直接結合してそれらの発現を活性化し、その後スパイクレットの発達を調節することを示します。私たちの結果は、OsPEX5がOsOPR7のペルオキシソーム輸入を媒介することにより小穂の発達を調節する上で重要な役割を果たし、したがって植物におけるJA生合成の調節に新しい洞察を提供し、イネの生殖の調節におけるJAの生物学的役割の理解を拡大することを示唆しています。"]
[171,30967012,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","nucleotide-binding leucine-rich repeat  gene (Pizh-1; Pizh-2)","Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences","A nucleotide-binding site-leucine-rich repeat receptor pair confers broad-spectrum disease resistance through physical association in rice.",2019,"374(1767):20180308","[Xie Z et al.]","Shanghai Institute of Plant Physiology and Ecology,  Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China.",30967012,"10.1098/rstb.2018.0308 ","Rice blast caused by Magnaporthe oryzae is the most destructive fungal disease in crops, greatly threatening rice production and food security worldwide. The identification and utilization of broad-spectrum resistance genes are considered  to be the most economic and effective method to control the disease. In the past  decade, many blast resistance ( R) genes have been identified, which mainly encode nucleotide-binding leucine-rich repeat (NLR) receptor family and confer limited race-specific resistance to the fungal pathogen. Resistance genes conferring broad-spectrum blast resistance are still largely lacking. In this study, we carried out a map-based cloning of the new blast R locus Pizh in variety ZH11. A bacterial artificial chromosome (BAC) clone of 165 kb spanning the Pizh locus was sequenced and identified 9 NLR genes, among which only Pizh-1  and Pizh-2 were expressed. Genetic complementation experiments indicated that Pizh-1 but not Pizh-2 alone could confer blast resistance. Intriguingly, both mutations on Pizh-1 and Pizh-2 by CRISPR-Cas9 abolished the Pizh-mediated resistance. We also observed that Pizh-1-mediated resistance was partially dependent on Pizh-2. Pizh-1 and Pizh-2 form a complex of NLRs through direct interaction. This suggests that Pizh-1 may function as the executor NLR and Pizh-2 as a 'helper' NLR that shares functional redundancy with other NLRs. Our current study provides not only a good tool for rice disease resistance breeding  but also deep insight into NLR association and function in plant immunity. This article is part of the theme issue 'Biotic signalling sheds light on smart pest management'.","rice","Magnaporthe oryzaeによって引き起こされる米の爆発は、作物の中で最も破壊的な真菌性疾患であり、世界中の米の生産と食品の安全を大きく脅かしています。広域スペクトル耐性遺伝子の同定と利用は、病気を制御するための最も経済的で効果的な方法であると考えられています。過去10年間で、多くの爆風耐性（R）遺伝子が同定されました。これらは主にヌクレオチド結合ロイシンリッチリピート（NLR）受容体ファミリーをコードし、真菌病原体に対して限定的な人種特異的耐性を付与します。広域スペクトルの爆風耐性を与える耐性遺伝子は、まだ大部分が欠けています。この研究では、品種ZH11の新しいブラストR遺伝子座Pizhのマップベースのクローニングを実施しました。Pizh遺伝子座にまたがる165kbの細菌人工染色体（BAC）クローンが配列決定され、9つのNLR遺伝子が同定され、そのうちPizh-1とPizh-2のみが発現しました。遺伝的補完実験は、Pizh-2だけではなくPizh-1が爆風耐性を与えることができることを示しました。興味深いことに、CRISPR-Cas9によるPizh-1とPizh-2の両方の変異は、Pizhを介した耐性を無効にしました。また、Pizh-1を介した耐性がPizh-2に部分的に依存していることも観察しました。Pizh-1とPizh-2は、直接的な相互作用を通じてNLRの複合体を形成します。これは、Pizh-1がエグゼキュータNLRとして機能し、Pizh-2が他のNLRと機能的な冗長性を共有する「ヘルパー」NLRとして機能する可能性があることを示唆しています。私たちの現在の研究は、米病抵抗性育種のための優れたツールであるだけでなく、NLRの関連性と植物免疫における機能についての深い洞察も提供します。この記事は、テーマの問題「生物的信号がスマートな害虫管理に光を当てる」の一部です。"]
[172,31410483,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","pin1a, pin1b, pin1c, pin1d","Plant & cell physiology","Functional Divergence of PIN1 Paralogous Genes in Rice.",2019,"60(12):2720-2732","[Li Y et al.]","Zhejiang University, Hangzhou, China.",31410483,"10.1093/pcp/pcz159 ","Auxin is a phytohormone that plays an important role in plant growth and development by forming local concentration gradients. The regulation of auxin levels is determined by the activity of auxin efflux carrier protein PIN-formed (PIN). In Arabidopsis thaliana, PIN-formed1 (PIN1) functions in inflorescence and root development. In rice (Oryza sativa L.), there are four PIN1 homologs (OsPIN1a-1d), but their functions remain largely unexplored. Hence, in this study, we created mutant alleles of PIN1 gene-pin1a, pin1b, pin1c, pin1d, pin1a pin1b and pin1c pin1d- using CRISPR/Cas9 technology and used them to study the functions of the four OsPIN1 paralogs in rice. In wild-type rice, all four OsPIN1 genes were relatively highly expressed in the root than in other tissues. Compared with the wild type, the OsPIN1 single mutants had no dramatic phenotypes, but the pin1a pin1b double mutant had shorter shoots and primary roots, fewer crown roots, reduced root gravitropism, longer root hairs and larger panicle branch angle. Furthermore, the pin1c pin1d double mutant showed no observable phenotype at the seedling stage, but showed naked, pin-shape inflorescence at flowering. These data suggest that OsPIN1a and OsPIN1b are involved in root, shoot and inflorescence development in rice, whereas OsPIN1c and OsPIN1d mainly function in panicle formation. Our study provides basic knowledge that will facilitate the study of auxin transport and signaling in rice.","rice","オーキシンは、局所的な濃度勾配を形成することにより、植物の成長と発達に重要な役割を果たす植物ホルモンです。オーキシンレベルの調節は、オーキシン排出キャリアタンパク質PIN形成（PIN）の活性によって決定されます。Arabidopsis thalianaでは、PIN-formed1（PIN1）は花序と根の発達に機能します。イネ（Oryza sativa L.）には、4つのPIN1ホモログ（OsPIN1a-1d）がありますが、それらの機能はほとんど解明されていません。したがって、この研究では、CRISPR / Cas9テクノロジーを使用してPIN1遺伝子の変異対立遺伝子（pin1a、pin1b、pin1c、pin1d、pin1a pin1b、pin1c pin1d）を作成し、それらを使用して米の4つのOsPIN1パラログの機能を研究しました。野生型イネでは、4つすべてのOsPIN1遺伝子が他の組織よりも根で比較的高度に発現していました。野生型と比較して、OsPIN1単一変異体には劇的な表現型はありませんでしたが、pin1a pin1b二重変異体は、シュートと一次根が短く、冠根が少なく、根の重力向性が低下し、根毛が長く、毛細血管の枝角が大きくなりました。さらに、pin1c pin1d二重変異体は、苗の段階では観察可能な表現型を示さなかったが、開花時に裸のピン型の花序を示した。これらのデータは、OsPIN1aとOsPIN1bが米の根、芽、花序の発達に関与しているのに対し、OsPIN1cとOsPIN1dは主にパニクル形成に関与していることを示唆しています。私たちの研究は、米におけるオーキシンの輸送とシグナル伝達の研究を容易にする基本的な知識を提供します。"]
[173,30690508,"plant","rice","CRISPR;Cas9","Large grain","Plant & cell physiology","LARGE GRAIN Encodes a Putative RNA-Binding Protein that Regulates Spikelet Hull Length in Rice.",2019,"60(3):503-515","[Chiou WY et al.]","Okayama University, Okayama, Japan.",30690508,"10.1093/pcp/pcz014 ","Grain size is a key determiner of grain weight, one of the yield components in rice (Oryza sativa). Therefore, to increase grain yield, it is important to elucidate the detailed mechanisms regulating grain size. The Large grain (Lgg) mutant, found in the nonautonomous DNA-based active rice transposon1 (nDart1)-tagged lines of Koshihikari, is caused by a truncated nDart1-3 and 355 bp deletion in the 5' untranslated region of LGG, which encodes a putative RNA-binding protein, through transposon display and cosegregation analysis between grain length and LGG genotype in F2 and F3. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9-mediated knockout and overexpression of LGG led to longer and shorter grains than wild type, respectively, showing that LGG regulates spikelet hull length. Expression of LGG  was highest in the 0.6-mm-long young panicle and gradually decreased as the panicle elongated. LGG was also expressed in roots and leaves. These results show that LGG functions at the very early stage of panicle development. Longitudinal cell numbers of spikelet hulls of Lgg, knockout and overexpressed plants were significantly different from those of the wild type, suggesting that LGG might regulate longitudinal cell proliferation in the spikelet hull. RNA-Seq analysis of 1-mm-long young panicles from LGG knockout and overexpressing plants revealed  that the expressions of many cell cycle-related genes were reduced in knockout plants relative to LGG-overexpressing plants and wild type, whereas some genes for cell proliferation were highly expressed in knockout plants. Taken together,  these results suggest that LGG might be a regulator of cell cycle and cell division in the rice spikelet hull.","rice","粒の大きさは、米（Oryza sativa）の収量構成要素の1つである粒重の重要な決定要因です。したがって、穀物の収量を増やすには、穀物のサイズを制御する詳細なメカニズムを解明することが重要です。コシヒカリの非自律的DNAベースの活性イネトランスポゾン1（nDart1）タグ付き系統に見られる大粒（Lgg）変異体は、LGGの5 '非翻訳領域での切り捨てられたnDart1-3および355bpの欠失によって引き起こされます。トランスポゾンディスプレイおよびF2とF3の粒長とLGG遺伝子型の間の共分離分析による推定RNA結合タンパク質。クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート/ CRISPR関連の9を介したノックアウトとLGGの過剰発現は、それぞれ野生型よりも長い粒子と短い粒子をもたらし、LGGがスパイクレットの船体の長さを調節することを示しています。LGGの発現は、長さ0.6 mmの若い穂で最も高く、穂が伸びるにつれて徐々に減少した。LGGは根や葉にも発現していました。これらの結果は、LGGがパニクル発達の非常に早い段階で機能することを示しています。Lgg、ノックアウト、および過剰発現植物のスパイクレットハルの縦方向の細胞数は、野生型のものとは有意に異なり、LGGがスパイクレットハルの縦方向の細胞増殖を調節する可能性があることを示唆しています。LGGノックアウトおよび過剰発現植物からの長さ1mmの若いパニックのRNA-Seq分析により、ノックアウト植物では、LGG過剰発現植物および野生型と比較して、多くの細胞周期関連遺伝子の発現が減少したが、細胞増殖の一部の遺伝子が減少したことが明らかになりました。ノックアウト植物で高度に発現された。まとめると、これらの結果は、LGGが米の小穂の外皮における細胞周期と細胞分裂の調節因子である可能性があることを示唆しています。"]
[174,31742855,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","Partial Resistance gene 1 (PiPR1)","Plant biotechnology journal","Genome-wide association study identifies an NLR gene that confers partial resistance to Magnaporthe oryzae in rice.",2019,null,"[Liu MH et al.]","Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, China.",31742855,"10.1111/pbi.13300 ","Because of the frequent breakdown of major resistance (R) genes, identification of new partial R genes against rice blast disease is an important goal of rice breeding. In this study, we used a core collection of the Rice Diversity Panel II (C-RDP-II), which contains 584 rice accessions and are genotyped with 700 000 single-nucleotide polymorphism (SNP) markers. The C-RDP-II accessions were inoculated with three blast strains collected from different rice-growing regions in China. Genome-wide association study identified 27 loci associated with rice blast resistance (LABRs). Among them, 22 LABRs were not associated with any known blast R genes or QTLs. Interestingly, a nucleotide-binding site leucine-rich repeat (NLR) gene cluster exists in the LABR12 region on chromosome 4. One of the NLR genes is highly conserved in multiple partially resistant rice cultivars, and its expression is significantly up-regulated at the early stages of rice blast infection. Knockout of this gene via CRISPR-Cas9 in transgenic plants partially reduced blast resistance to four blast strains. The identification of this new non-strain specific partial R gene, tentatively named rice blast Partial Resistance gene 1 (PiPR1), provides genetic material that will be useful for understanding the partial resistance mechanism and for breeding durably resistant cultivars against blast disease of rice.","rice","主要な耐性（R）遺伝子が頻繁に分解されるため、米芽球病に対する新しい部分R遺伝子の同定は米育種の重要な目標です。この研究では、584の米系統を含み、700 000の単一ヌクレオチド多型（SNP）マーカーで遺伝子型が決定されたRice Diversity Panel II（C-RDP-II）のコアコレクションを使用しました。C-RDP-IIアクセッションには、中国のさまざまな稲作地域から収集された3つの爆風株が接種されました。ゲノム全体の関連研究により、イネブラスト耐性（LABR）に関連する27の遺伝子座が特定されました。それらの中で、22のLABRは既知のブラストR遺伝子またはQTLと関連していませんでした。興味深いことに、ヌクレオチド結合部位であるロイシンリッチリピート（NLR）遺伝子クラスターは、染色体4のLABR12領域に存在します。NLR遺伝子の1つは、複数の部分的に耐性のあるイネ栽培品種で高度に保存されており、その発現は米芽球感染の初期段階。トランスジェニック植物におけるCRISPR-Cas9を介したこの遺伝子のノックアウトは、4つの爆風株に対する爆風耐性を部分的に低下させました。この新しい非系統特異的部分R遺伝子の同定は、暫定的に米芽球部分耐性遺伝子1（PiPR1）と名付けられ、部分耐性メカニズムを理解し、米の芽球病に対して永続的に耐性のある品種を育てるのに役立つ遺伝物質を提供します。"]
[175,31469505,"plant","rice","Cas9;"," ","Plant biotechnology journal","Simplified adenine base editors improve adenine base editing efficiency in rice.",2019,null,"[Hua K et al.]","Shanghai Center for Plant Stress Biology, CAS Center of Excellence in Molecular Plant Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China.",31469505,"10.1111/pbi.13244 ","Adenine base editors (ABEs) have been exploited to introduce targeted adenine (A) to guanine (G) base conversions in various plant genomes, including rice, wheat and Arabidopsis. However, the ABEs reported thus far are all quite inefficient at many target sites in rice, which hampers their applications in plant genome engineering and crop breeding. Here, we show that unlike in the mammalian system, a simplified base editor ABE-P1S (Adenine Base Editor-Plant version 1 Simplified) containing the ecTadA*7.10-nSpCas9 (D10A) fusion has much higher editing efficiency in rice compared to the widely used ABE-P1 consisting of the ecTadA-ecTadA*7.10-nSpCas9 (D10A) fusion. We found that the protein expression level of ABE-P1S is higher than that of ABE-P1 in rice calli and protoplasts, which may explain the higher editing efficiency of ABE-P1S in different rice varieties. Moreover, we demonstrate that the ecTadA*7.10-nCas9 fusion can be used to improve the editing efficiency of other ABEs containing SaCas9 or the engineered SaKKH-Cas9 variant. These more efficient ABEs will help advance trait  improvements in rice and other crops.","rice","アデニンベースエディター（ABE）は、米、小麦、アラビドプシスなどのさまざまな植物ゲノムに、ターゲットを絞ったアデニン（A）からグアニン（G）ベースへの変換を導入するために利用されています。しかし、これまでに報告されたABEはすべて、イネの多くの標的部位で非常に非効率的であり、植物ゲノム工学や作物育種への応用を妨げています。ここでは、哺乳類のシステムとは異なり、ecTadA * 7.10-nSpCas9（D10A）融合を含む簡略化されたベースエディタABE-P1S（Adenine Base Editor-Plant version 1 Simplified）が、広く使用されているものと比較して、米の編集効率がはるかに高いことを示します。 ecTadA-ecTadA * 7.10-nSpCas9（D10A）フュージョンで構成されるABE-P1を使用しました。ABE-P1Sのタンパク質発現レベルは、イネのカルスおよびプロトプラストにおいてABE-P1のタンパク質発現レベルよりも高いことがわかりました。これは、さまざまなイネ品種におけるABE-P1Sの編集効率が高いことを説明している可能性があります。さらに、ecTadA * 7.10-nCas9フュージョンを使用して、SaCas9または操作されたSaKKH-Cas9バリアントを含む他のABEの編集効率を向上できることを示します。これらのより効率的なABEは、米やその他の作物の特性改善を促進するのに役立ちます。"]
[176,30628157,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","OsPIL15","Plant biotechnology journal","The basic helix-loop-helix transcription factor, OsPIL15, regulates grain size via directly targeting a purine permease gene OsPUP7 in rice.",2019,"17(8):1527-1537","[Ji X et al.]","Henan Agricultural University, Zhengzhou, China.",30628157,"10.1111/pbi.13075 ","As members of the basic helix-loop-helix transcription factor families, phytochrome-interacting factors regulate an array of developmental responses ranging from seed germination to plant growth. However, little is known about their roles in modulating grain development. Here, we firstly analyzed the expression pattern of rice OsPIL genes in grains and found that OsPIL15 may play  an important role in grain development. We then generated knockout (KO) OsPIL15 lines in rice using CRISPR/Cas9 technology, the silencing expression of OsPIL15 led to increased numbers of cells, which thus enhanced grain size and weight. Moreover, overexpression and suppression of OsPIL15 in the rice endosperm resulted in brown rice showing grain sizes and weights that were decreased and increased respectively. Further studies indicated that OsPIL15 binds to N1-box (CACGCG) motifs of the purine permease gene OsPUP7 promoter. Measurement of isopentenyl adenosine, a bioactive form of cytokinin (CTK), revealed increased contents in the OsPIL15-KO spikelets compared with the wild-type. Overall, our results demonstrate a possible pathway whereby OsPIL15 directly targets OsPUP7, affecting CTK transport and thereby influencing cell division and subsequent grain size. These findings provide a valuable insight into the molecular functions of OsPIL15 in rice grains, highlighting a useful genetic improvement leading to increased rice yield.","rice","基本的なヘリックス-ループ-ヘリックス転写因子ファミリーのメンバーとして、フィトクロム相互作用因子は、種子の発芽から植物の成長に至るまでの一連の発達反応を調節します。しかし、穀物の発達を調節する上でのそれらの役割についてはほとんど知られていない。ここでは、まず穀物中の米OsPIL遺伝子の発現パターンを分析し、OsPIL15が穀物の発達に重要な役割を果たす可能性があることを発見しました。次に、CRISPR / Cas9テクノロジーを使用して米にノックアウト（KO）OsPIL15系統を生成しました。これにより、OsPIL15のサイレンシング発現により細胞数が増加し、粒子サイズと重量が増加しました。さらに、米内精子におけるOsPIL15の過剰発現と抑制により、褐色米はそれぞれ減少および増加した粒子サイズと重量を示しました。さらなる研究により、OsPIL15はプリンパーミアーゼ遺伝子OsPUP7プロモーターのN1ボックス（CACGCG）モチーフに結合することが示されました。サイトカイニン（CTK）の生物活性型であるイソペンテニルアデノシンの測定により、野生型と比較してOsPIL15-KO小穂の含有量が増加していることが明らかになりました。全体として、私たちの結果は、OsPIL15がOsPUP7を直接標的とし、CTK輸送に影響を与え、それによって細胞分裂とその後の粒子サイズに影響を与える可能性のある経路を示しています。これらの発見は、米粒中のOsPIL15の分子機能への貴重な洞察を提供し、米の収量の増加につながる有用な遺伝的改善を強調しています。"]
[177,30582769,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","ATP-citrate lyases (OsACL-A2)","Plant biotechnology journal","OsACL-A2 negatively regulates cell death and disease resistance in rice.",2019,"17(7):1344-1356","[Ruan B et al.]","China National Rice Research Institute, Hangzhou, Zhejiang, China.",30582769,"10.1111/pbi.13058 ","ATP-citrate lyases (ACL) play critical roles in tumour cell propagation, foetal development and growth, and histone acetylation in human and animals. Here, we report a novel function of ACL in cell death-mediated pathogen defence responses  in rice. Using ethyl methanesulphonate (EMS) mutagenesis and map-based cloning, we identified an Oryza sativa ACL-A2 mutant allele, termed spotted leaf 30-1 (spl30-1), in which an A-to-T transversion converts an Asn at position 343 to a Tyr (N343Y), causing a recessive mutation that led to a lesion mimic phenotype. Compared to wild-type plants, spl30-1 significantly reduces ACL enzymatic activity, accumulates high reactive oxygen species and increases degradation rate of nuclear deoxyribonucleic acids. CRISPR/Cas9-mediated insertion/deletion mutation analysis and complementation assay confirmed that the phenotype of spl30-1 resulted from the defective function of OsACL-A2 protein. We further biochemically identified that the N343Y mutation caused a significant degradation of SPL30(N343Y) in a ubiquitin-26S proteasome system (UPS)-dependent manner without alteration in transcripts of OsACL-A2 in spl30-1. Transcriptome analysis  identified a number of up-regulated genes associated with pathogen defence responses in recessive mutants of OsACL-A2, implying its role in innate immunity. Suppressor mutant screen suggested that OsSL, which encodes a P450 monooxygenase  protein, acted as a downstream key regulator in spl30-1-mediated pathogen defence responses. Taken together, our study discovered a novel role of OsACL-A2 in negatively regulating innate immune responses in rice.","rice","ATP-クエン酸リアーゼ（ACL）は、腫瘍細胞の増殖、胎児の発育と成長、およびヒトと動物のヒストンアセチル化において重要な役割を果たします。ここでは、米の細胞死を介した病原体防御反応におけるACLの新しい機能を報告します。メタンスルホン酸エチル（EMS）変異誘発とマップベースのクローニングを使用して、AからTへの変換が位置でAsnを変換する、斑点葉30-1（spl30-1）と呼ばれるOryza sativaACL-A2変異対立遺伝子を特定しました。 343からTyr（N343Y）まで、劣性突然変異を引き起こし、病変模倣表現型をもたらしました。野生型植物と比較して、spl30-1はACL酵素活性を大幅に低下させ、高反応性酸素種を蓄積し、核デオキシリボ核酸の分解速度を増加させます。CRISPR / Cas9を介した挿入/削除変異分析および補完アッセイにより、spl30-1の表現型がOsACL-A2タンパク質の機能不全に起因することが確認されました。さらに、N343Y変異が、spl30-1のOsACL-A2の転写産物を変化させることなく、ユビキチン-26Sプロテアソームシステム（UPS）依存的にSPL30（N343Y）の有意な分解を引き起こすことを生化学的に確認しました。トランスクリプトーム分析により、OsACL-A2の劣性変異体における病原体防御応答に関連する多数の上方制御された遺伝子が特定され、先天性免疫におけるその役割が示唆されました。サプレッサー変異体スクリーニングは、P450モノオキシゲナーゼタンパク質をコードするOsSLが、spl30-1を介した病原体防御応答における下流の重要な調節因子として作用することを示唆しました。まとめると、私たちの研究は、イネの自然免疫応答を負に調節する上でのOsACL-A2の新しい役割を発見しました。"]
[178,30582653,"plant","rice","CRISPR;Cas9;Cpf1;"," ","Plant biotechnology journal","Single transcript unit CRISPR 2.0 systems for robust Cas9 and Cas12a mediated plant genome editing.",2019,"17(7):1431-1445","[Tang X et al.]","University of Electronic Science and Technology of China, Chengdu, China.",30582653,"10.1111/pbi.13068 ","CRISPR-Cas9 and Cas12a are two powerful genome editing systems. Expression of CRISPR in plants is typically achieved with a mixed dual promoter system, in which Cas protein is expressed by a Pol II promoter and a guide RNA is expressed  by a species-specific Pol III promoter such as U6 or U3. To achieve coordinated expression and compact vector packaging, it is desirable to express both CRISPR components under a single Pol II promoter. Previously, we demonstrated a first-generation single transcript unit (STU)-Cas9 system, STU-Cas9-RZ, which is  based on hammerhead ribozyme for processing single guide RNAs (sgRNAs). In this study, we developed two new STU-Cas9 systems and one STU-Cas12a system for applications in plants, collectively called the STU CRISPR 2.0 systems. We demonstrated these systems for genome editing in rice with both transient expression and stable transgenesis. The two STU-Cas9 2.0 systems process the sgRNAs with Csy4 ribonuclease and endogenous tRNA processing system respectively. Both STU-Cas9-Csy4 and STU-Cas9-tRNA systems showed more robust genome editing efficiencies than our first-generation STU-Cas9-RZ system and the conventional mixed dual promoter system. We further applied the STU-Cas9-tRNA system to compare two C to T base editing systems based on rAPOBEC1 and PmCDA1 cytidine deaminases. The results suggest STU-based PmCDA1 base editor system is highly efficient in rice. The STU-Cas12a system, based on Cas12a' self-processing of a CRISPR RNA (crRNA) array, was also developed and demonstrated for expression of a single crRNA and four crRNAs. Altogether, our STU CRISPR 2.0 systems further expanded the CRISPR toolbox for plant genome editing and other applications.","rice","CRISPR-Cas9とCas12aは2つの強力なゲノム編集システムです。植物におけるCRISPRの発現は、通常、Casタンパク質がPol IIプロモーターによって発現され、ガイドRNAがU6やU3などの種特異的なPolIIIプロモーターによって発現される混合デュアルプロモーターシステムで達成されます。協調的な発現とコンパクトなベクターパッケージングを実現するには、単一のPolIIプロモーターの下で両方のCRISPRコンポーネントを発現させることが望ましいです。以前、シングルガイドRNA（sgRNA）を処理するためのハンマーヘッドリボザイムに基づく第1世代のシングルトランスクリプトユニット（STU）-Cas9システムであるSTU-Cas9-RZのデモを行いました。この研究では、2つの新しいSTU-Cas9システムと1つのSTU-Cas12aシステムを開発し、まとめてSTU CRISPR2.0システムと呼びます。一過性の発現と安定した遺伝子導入の両方を備えたイネのゲノム編集のためのこれらのシステムを実証しました。2つのSTU-Cas92.0システムは、それぞれCsy4リボヌクレアーゼと内因性tRNA処理システムでsgRNAを処理します。STU-Cas9-Csy4システムとSTU-Cas9-tRNAシステムはどちらも、第1世代のSTU-Cas9-RZシステムおよび従来の混合デュアルプロモーターシステムよりも堅牢なゲノム編集効率を示しました。さらに、STU-Cas9-tRNAシステムを適用して、rAPOBEC1およびPmCDA1シチジンデアミナーゼに基づく2つのCからTへの塩基編集システムを比較しました。結果は、STUベースのPmCDA1ベースエディタシステムが米で非常に効率的であることを示唆しています。CRISPR RNA（crRNA）アレイのCas12aの自己処理に基づくSTU-Cas12aシステムも開発され、単一のcrRNAと4つのcrRNAの発現について実証されました。全体として、当社のSTU CRISPR 2.0システムは、植物ゲノム編集およびその他のアプリケーション用のCRISPRツールボックスをさらに拡張しました。"]
[179,30160362,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","type B heterotrimeric G protein gamma subunit (zrgg2-1; zrgg2-2)","Plant biotechnology journal","Mutation of RGG2, which encodes a type B heterotrimeric G protein gamma subunit,  increases grain size and yield production in rice.",2019,"17(3):650-664","[Miao J  et al.]","Yangzhou University, Yangzhou, China.",30160362,"10.1111/pbi.13005 ","Heterotrimeric G proteins, which consist of Galpha , Gbeta and Ggamma subunits, function as molecular switches that regulate a wide range of developmental processes in plants. In this study, we characterised the function of rice RGG2, which encodes a type B Ggamma subunit, in regulating grain size and yield production. The expression levels of RGG2 were significantly higher than those of other rice Ggamma -encoding genes in all tissues tested, suggesting that RGG2 plays essential roles in rice growth and development. By regulating cell expansion, overexpression of RGG2 in Nipponbare (NIP) led to reduced plant height and decreased grain size. By contrast, two mutants generated by the clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) system in the Zhenshan 97 (ZS97) background, zrgg2-1 and zrgg2-2, exhibited enhanced growth, including elongated internodes, increased 1000-grain weight and plant biomass and enhanced grain yield per plant (+11.8% and 16.0%, respectively). These results demonstrate that RGG2 acts as a negative  regulator of plant growth and organ size in rice. By measuring the length of the  second leaf sheath after gibberellin (GA3 ) treatment and the GA-induced alpha-amylase activity of seeds, we found that RGG2 is also involved in GA signalling. In summary, we propose that RGG2 may regulate grain and organ size via the GA pathway and that manipulation of RGG2 may provide a novel strategy for rice grain yield enhancement.","rice","Galpha、Gbeta、Ggammaサブユニットで構成されるヘテロ三量体Gタンパク質は、植物のさまざまな発達過程を調節する分子スイッチとして機能します。この研究では、B型GgammaサブユニットをコードするイネRGG2の、粒径と収量生産の調節における機能を特徴づけました。RGG2の発現レベルは、テストしたすべての組織で他のイネのGgammaをコードする遺伝子の発現レベルよりも有意に高く、RGG2がイネの成長と発達に重要な役割を果たしていることを示唆しています。細胞増殖を調節することにより、日本晴（NIP）でのRGG2の過剰発現は、草丈の低下と粒子サイズの減少をもたらしました。対照的に、Zhenshan 97（ZS97）バックグラウンドのクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9（Cas9）システムによって生成された2つの変異体、zrgg2-1およびzrgg2-2は、成長の増強を示しました。細長い節間、1000粒の重量と植物バイオマスの増加、植物あたりの粒収量の向上（それぞれ+ 11.8％と16.0％）を含みます。これらの結果は、RGG2がイネの植物成長と器官サイズの負の調節因子として作用することを示しています。ジベレリン（GA3）処理後の2番目の葉鞘の長さと種子のGA誘導α-アミラーゼ活性を測定することにより、RGG2もGAシグナル伝達に関与していることがわかりました。要約すると、RGG2はGA経路を介して穀物と臓器のサイズを調節する可能性があり、RGG2の操作は米粒の収量を高めるための新しい戦略を提供する可能性があることを提案します。"]
[180,30051586,"plant","rice","Cas9;"," ","Plant biotechnology journal","Expanding the base editing scope in rice by using Cas9 variants.",2019,"17(2):499-504","[Hua K et al.]","Shanghai Center for Plant Stress Biology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China.",30051586,"10.1111/pbi.12993 ","Base editing is a novel genome editing strategy that enables irreversible base conversion at target loci without the need for double stranded break induction or homology-directed repair. Here, we developed new adenine and cytosine base editors with engineered SpCas9 and SaCas9 variants that substantially expand the  targetable sites in the rice genome. These new base editors can edit endogenous genes in the rice genome with various efficiencies. Moreover, we show that adenine and cytosine base editing can be simultaneously executed in rice. The new base editors described here will be useful in rice functional genomics research and will advance precision molecular breeding in crops.","rice","塩基編集は、二本鎖切断誘導または相同性指向修復を必要とせずに、標的遺伝子座での不可逆的な塩基変換を可能にする新しいゲノム編集戦略です。ここでは、米ゲノムの標的部位を大幅に拡大する、設計されたSpCas9およびSaCas9バリアントを使用した新しいアデニンおよびシトシンベースエディターを開発しました。これらの新しいベースエディターは、さまざまな効率で米ゲノムの内因性遺伝子を編集できます。さらに、アデニンとシトシンの塩基編集がイネで同時に実行できることを示します。ここで説明する新しいベースエディターは、米の機能ゲノミクス研究に役立ち、作物の精密分子育種を進歩させます。"]
[181,30886126,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","DEACETYLASE ON ARABINOSYL SIDECHAIN OF XYLAN1 (DARX1)","Plant cell","Arabinosyl Deacetylase Modulates the Arabinoxylan Acetylation Profile and Secondary Wall Formation.",2019,"31(5):1113-1126","[Zhang L  et al.]","Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China.",30886126,"10.1105/tpc.18.00894 ","Acetylation, a prevalent modification of cell-wall polymers, is a tightly controlled regulatory process that orchestrates plant growth and environmental adaptation. However, due to limited characterization of the enzymes involved, it  is unclear how plants establish and dynamically regulate the acetylation pattern  in response to growth requirements. In this study, we identified a rice (Oryza sativa) GDSL esterase that deacetylates the side chain of the major rice hemicellulose, arabinoxylan. Acetyl esterases involved in arabinoxylan modification were screened using enzymatic assays combined with mass spectrometry analysis. One candidate, DEACETYLASE ON ARABINOSYL SIDECHAIN OF XYLAN1 (DARX1), is specific for arabinosyl residues. Disruption of DARX1 via Tos17 insertion and  CRISPR/Cas9 approaches resulted in the accumulation of acetates on the xylan arabinosyl side chains. Recombinant DARX1 abolished the excess acetyl groups on arabinoxylan-derived oligosaccharides of the darx1 mutants in vitro. Moreover, DARX1 is localized to the Golgi apparatus. Two-dimensional (13)C-(13)C correlation spectroscopy and atomic force microscopy further revealed that the abnormal acetylation pattern observed in darx1 interrupts arabinoxylan conformation and cellulose microfibril orientation, resulting in compromised secondary wall patterning and reduced mechanical strength. This study provides insight into the mechanism controlling the acetylation pattern on arabinoxylan side chains and suggests a strategy to breed robust elite crops.","rice","細胞壁ポリマーの一般的な修飾であるアセチル化は、植物の成長と環境への適応を調整する厳密に制御された規制プロセスです。ただし、関与する酵素の特性が限られているため、植物が成長要件に応じてアセチル化パターンを確立し、動的に調節する方法は不明です。この研究では、主要な米ヘミセルロースであるアラビノキシランの側鎖を脱アセチル化する米（Oryza sativa）GDSLエステラーゼを同定しました。アラビノキシラン修飾に関与するアセチルエステラーゼは、質量分析と組み合わせた酵素アッセイを使用してスクリーニングされました。1つの候補であるXYLAN1のアラビノシル側鎖上の脱アセチル化酵素（DARX1）は、アラビノシル残基に特異的です。Tos17挿入およびCRISPR / Cas9アプローチによるDARX1の破壊により、キシランアラビノシル側鎖にアセテートが蓄積しました。組換えDARX1は、invitroでdarx1変異体のアラビノキシラン由来オリゴ糖の過剰なアセチル基を廃止しました。さらに、DARX1はGolgi装置にローカライズされています。二次元（13）C-（13）C相関分光法と原子力顕微鏡法により、darx1で観察された異常なアセチル化パターンがアラビノキシランのコンフォメーションとセルロースミクロフィブリルの配向を妨害し、二次壁のパターン形成が損なわれ、機械的強度が低下することがさらに明らかになりました。この研究は、アラビノキシラン側鎖のアセチル化パターンを制御するメカニズムへの洞察を提供し、堅牢なエリート作物を育種するための戦略を示唆しています。"]
[182,30903268,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","indole-3-acetic acid glucosyltransferase (OsIAAGLU)","Plant cell reports","Overexpression of OsIAAGLU reveals a role for IAA-glucose conjugation in modulating rice plant architecture.",2019,"38(6):731-739","[Yu XL et al.]","South China Agricultural University, Guangzhou, China.",30903268,"10.1007/s00299-019-02402-4 ","KEY MESSAGE: OsIAAGLU could catalyze the reaction of IAA with glucose to generate IAA-glucose. Overexpression of OsIAAGLU in rice resulted in altered rice shoot architecture and root gravitropism. The distribution and levels of indole-3-acetic acid (IAA) within plant tissues are well known to play vital roles in plant growth and development. An important mechanism of regulating free  IAA levels in monocots is formation of IAA ester conjugates. In this study, a cytosol-localized protein encoded by the rice gene of indole-3-acetic acid glucosyltransferase (OsIAAGLU) was found to catalyze the reaction of free IAA with glucose to generate IAA-glucose. Expression of OsIAAGLU could be induced by  IAA and NAA. The number of tillers and leaf angle was significantly increased with a concomitant decrease in plant height and panicle length in the transgenic  rice lines overexpressing OsIAAGLU compared to the wild-type (WT) plants. Phenotypes of iaaglu mutants constructed using the CRISPR/Cas9 system had no obvious differences with WT plants. Furthermore, overexpression of OsIAAGLU resulted in reduced sensitivity to IAA/NAA and altered gravitropic response of the roots in the transgenic plants. Free IAA contents in the leaves, root tips, and lamina joint of OsIAAGLU-overexpressing transgenic lines were lower than those of WT plants. These results support that OsIAAGLU could play a regulatory role in IAA homeostasis and rice architecture.","rice","重要なメッセージ：OsIAAGLUは、IAAとグルコースの反応を触媒してIAA-グルコースを生成する可能性があります。米におけるOsIAAGLUの過剰発現は、米の芽の構造と根の重力向性の変化をもたらしました。植物組織内のインドール-3-酢酸（IAA）の分布とレベルは、植物の成長と発達に重要な役割を果たすことがよく知られています。モノコットの遊離IAAレベルを調節する重要なメカニズムは、IAAエステルコンジュゲートの形成です。この研究では、インドール-3-酢酸グルコシルトランスフェラーゼ（OsIAAGLU）の米遺伝子によってコードされるサイトゾルに局在するタンパク質が、遊離IAAとグルコースとの反応を触媒してIAA-グルコースを生成することが見出された。OsIAAGLUの発現は、IAAおよびNAAによって誘発される可能性があります。OsIAAGLUを過剰発現するトランスジェニックイネ系統では、野生型（WT）植物と比較して、分げつ数と葉の角度が有意に増加し、同時に草丈と穂長が減少しました。CRISPR / Cas9システムを使用して構築されたiaaglu変異体の表現型は、WT植物との明らかな違いはありませんでした。さらに、OsIAAGLUの過剰発現は、IAA / NAAに対する感受性の低下と、トランスジェニック植物の根の重力応答の変化をもたらしました。OsIAAGLUを過剰発現するトランスジェニック系統の葉、根端、および椎弓板関節の遊離IAA含有量は、WT植物のものよりも低かった。これらの結果は、OsIAAGLUがIAAホメオスタシスと米の構造において規制の役割を果たす可能性があることを裏付けています。"]
[183,30783736,"plant","rice","CRISPR;Cas9;"," ","Plant cell reports","Development of methods for effective identification of CRISPR/Cas9-induced indels in rice.",2019,"38(4):503-510","[Biswas S et al.]","Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China.",30783736,"10.1007/s00299-019-02392-3 ","KEY MESSAGE: Two methods, PCR and amplicon labeling based, were developed and successfully applied to reliably detect CRISPR/Cas9 induced indels in rice. The use of CRISPR/Cas9 has emerged as a powerful nuclease-based genome editing tool in several model organisms including plants for mutagenesis by inducing precise gene editing through efficient double strand DNA breaks (DSBs) at the target site and subsequent error-prone non-homologous end joining (NHEJ) repair, leading to indel mutations. Different molecular methods including enzymatic mismatch cleavage (EMC), high-resolution melting curve analysis (HRMA) and conventional polymerase chain reaction (PCR) combined with ligation detection reaction (LDR) have been developed to quick identify CRISPR/Cas9 induced mutations. However, their intrinsic drawbacks limit their application in the identification of indel  mutants in plants. Here we present two methods (one simple PCR based and the other amplicon labeling based) for effective and sensitive detection of CRISPR/Cas9 induced indels in rice. In PCR-based method, targets were amplified using two pairs of primers for each target locus and visualized on gel electrophoresis, while in amplicon labeling-based method, targets were amplified  using tri-primers (with one a universal 6-FAM 5'-labelled) and detected by DNA capillary electrophoresis. Both methods can accurately define indel sizes down to +/- 1 bp, and are amenable for high throughput analysis, therefore, will significantly facilitate the identification of indel mutants generated by CRISPR/Cas9 for further functional analysis and breeding in rice and other plants.","rice","重要なメッセージ：PCRとアンプリコンラベリングベースの2つの方法が開発され、米のCRISPR / Cas9誘導インデルを確実に検出するためにうまく適用されました。CRISPR / Cas9の使用は、標的部位での効率的な二本鎖DNA切断（DSB）とそれに続くエラーが発生しやすい非の正確な遺伝子編集を誘発することにより、突然変異誘発のための植物を含むいくつかのモデル生物における強力なヌクレアーゼベースのゲノム編集ツールとして浮上しています。相同末端結合（NHEJ）修復、インデル変異につながる。CRISPR / Cas9誘発変異を迅速に特定するために、酵素的ミスマッチ切断（EMC）、高分解能融解曲線分析（HRMA）、およびライゲーション検出反応（LDR）と組み合わせた従来のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を含むさまざまな分子法が開発されました。ただし、それらの固有の欠点は、植物のインデル変異体の同定におけるそれらの適用を制限します。ここでは、米のCRISPR / Cas9誘導インデルを効果的かつ高感度に検出するための2つの方法（1つは単純なPCRベース、もう1つはアンプリコンラベリングベース）を紹介します。PCRベースの方法では、ターゲットは各ターゲット遺伝子座に対して2対のプライマーを使用して増幅され、ゲル電気泳動で視覚化されました。一方、アンプリコンラベリングベースの方法では、ターゲットはトライプライマー（1つはユニバーサル6-FAM 5'-ラベル付き）およびDNAキャピラリー電気泳動によって検出されます。どちらの方法でも、+ / -1 bpまでのインデルサイズを正確に定義でき、ハイスループット分析に適しているため、CRISPR / Cas9によって生成されたインデル変異体の識別が大幅に容易になり、米や他の植物でのさらなる機能分析と繁殖が可能になります。"]
[184,30465094,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","Tos17 retrotransposon","Plant cell reports","Targeted deletion of rice retrotransposon Tos17 via CRISPR/Cas9.",2019,"38(4):455-458","[Saika H  et al.]","Institute of Agrobiological Sciences, National Agriculture and Food Research Organization, Tsukuba, Ibaraki, Japan.",30465094,"10.1007/s00299-018-2357-7 ","KEY MESSAGE: A successful example of transposon deletion via CRISPR/Cas9-mediated genome editing suggests a novel alternative approach to plant breeding. Transposition of transposable elements (TEs) can affect adjacent genes, leading to changes in genetic traits. Expression levels and patterns, splicing and epigenetic status, and function of genes located in, or near, the inserted/excised locus can be affected. Artificial modification of loci adjacent  to TEs, or TEs themselves, by genome editing could mimic the translocation of TEs that occurs in nature, suggesting that it might be possible to produce novel plants by modification of TEs via genome editing. To our knowledge, there are no  reports thus far of modification of TEs by genome editing in plants. In this study, we performed targeted deletion of the Tos17 retrotransposon, which is flanked at both ends by long terminal repeat (LTR) sequences, via genome editing  in rice. We succeeded in targeted mutagenesis of the LTR, and targeted deletion between LTRs, in calli transformed with CRISPR/Cas9 vectors for the Tos17 LTR. Moreover, we also successfully obtained regenerated plants derived from transformed calli and plants homozygous for lacking Tos17 in the next generation. Taken together, our results demonstrate successful deletion of the Tos17 retrotransposon from the rice genome by targeted mutagenesis using CRISPR/Cas9. We believe that this strategy could be applied to other TEs in many plant species, providing a rapid breeding technology as an alternative means to re-activate expression of agronomically important genes that have been inactivated by TE insertion, especially in plants such as fruit trees, in which it is difficult to maintain parental agronomical traits by cross-breeding due to  high heterozygosity.","rice","重要なメッセージ：CRISPR / Cas9を介したゲノム編集によるトランスポゾン削除の成功例は、植物育種への新しい代替アプローチを示唆しています。転移因子（TE）の転位は、隣接する遺伝子に影響を及ぼし、遺伝的形質の変化につながる可能性があります。発現レベルとパターン、スプライシングとエピジェネティックな状態、および挿入/切除された遺伝子座内またはその近くにある遺伝子の機能が影響を受ける可能性があります。ゲノム編集によるTEに隣接する遺伝子座の人工的改変、またはTE自体は、自然界で発生するTEの転座を​​模倣する可能性があり、ゲノム編集によるTEの改変によって新規植物を生産できる可能性があることを示唆している。私たちの知る限り、植物のゲノム編集によるTEの改変に関する報告はこれまでありません。この研究では、米のゲノム編集を介して、両端に長いターミナルリピート（LTR）シーケンスが隣接するTos17レトロトランスポゾンのターゲット削除を実行しました。Tos17LTR用のCRISPR / Cas9ベクターで形質転換されたカルスにおいて、LTRの標的変異誘発、およびLTR間の標的欠失に成功しました。また、形質転換されたカルス由来の再生植物や、次世代のTos17を欠くホモ接合性の植物の入手にも成功しました。まとめると、我々の結果は、CRISPR / Cas9を使用した標的突然変異誘発による米ゲノムからのTos17レトロトランスポゾンの削除の成功を示しています。この戦略は、多くの植物種の他のTEに適用でき、特に果樹などの植物において、TE挿入によって不活性化された農業的に重要な遺伝子の発現を再活性化する代替手段として迅速な繁殖技術を提供できると考えています。ヘテロ接合性が高いため、交配によって親の農業特性を維持することは困難です。"]
[185,30159598,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","OsGS3; OsGW2; OsGn1a","Plant cell reports","Multiplex QTL editing of grain-related genes improves yield in elite rice varieties.",2019,"38(4):475-485","[Zhou J et al.]","University of Electronic Science and Technology of China, Chengdu, China.",30159598,"10.1007/s00299-018-2340-3 ","KEY MESSAGE: Significant yield increase has been achieved by simultaneous introduction of three trait-related QTLs in three rice varieties with multiplex editing by CRISPR-Cas9. Using traditional breeding approaches to develop new elite rice varieties with high yield and superior quality is challenging. It usually requires introduction of multiple trait-related quantitative trait loci (QTLs) into an elite background through multiple rounds of crossing and selection. CRISPR-Cas9-based multiplex editing of QTLs represents a new breeding  strategy that is straightforward and cost effective. To test this approach, we simultaneously targeted three yield-related QTLs for editing in three elite rice  varieties, namely J809, L237 and CNXJ. The chosen yield-related QTL genes are OsGS3, OsGW2 and OsGn1a, which have been identified to negatively regulate the grain size, width and weight, and number, respectively. Our approach rapidly generated all seven combinations of single, double and triple mutants for the target genes in elite backgrounds. Detailed analysis of these mutants revealed differential contributions of QTL mutations to yield performance such as grain length, width, number and 1000-grain weight. Overall, the contributions are additive, resulting in 68 and 30% yield per panicle increase in triple mutants of J809 and L237, respectively. Our data hence demonstrates a promising genome editing approach for rapid breeding of QTLs in elite crop varieties.","rice","重要なメッセージ：CRISPR-Cas9によるマルチプレックス編集により、3つのイネ品種に3つの形質関連QTLを同時に導入することにより、大幅な収量の増加が達成されました。伝統的な育種アプローチを使用して、高収量で高品質の新しいエリート米品種を開発することは困難です。通常、複数回の交差と選択を通じて、エリートの背景に複数の特性関連の定量的特性遺伝子座（QTL）を導入する必要があります。CRISPR-Cas9ベースのQTLのマルチプレックス編集は、簡単で費用効果の高い新しい育種戦略を表しています。このアプローチをテストするために、3つのエリート米品種、すなわちJ809、L237、およびCNXJで編集するために、3つの収量関連QTLを同時にターゲットにしました。選択された収量関連のQTL遺伝子は、OsGS3、OsGW2、およびOsGn1aであり、それぞれ、粒子のサイズ、幅、重量、および数を負に調節することが確認されています。私たちのアプローチは、エリートバックグラウンドのターゲット遺伝子のシングル、ダブル、トリプルミュータントの7つの組み合わせすべてを迅速に生成しました。これらの変異体の詳細な分析により、QTL変異が、粒子の長さ、幅、数、1000粒子の重量などの性能を生み出すための異なる寄与を明らかにしました。全体として、寄与は相加的であり、J809とL237の三重変異体でそれぞれ68％と30％のパニクルあたりの収量の増加をもたらします。したがって、私たちのデータは、エリート作物品種におけるQTLの迅速な育種のための有望なゲノム編集アプローチを示しています。"]
[186,30715580,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","Waxy (Wx) locus encoding granule-bound starch synthase I","Plant cell reports","CRISPR/Cas9 mutations in the rice Waxy/GBSSI gene induce allele-specific and zygosity-dependent feedback effects on endosperm starch biosynthesis.",2019,"38(3):417-433","[Perez L  et al.]","University of Lleida-Agrotecnio Center, Lleida, Spain.",30715580,"10.1007/s00299-019-02388-z ","KEY MESSAGE: Induced mutations in the waxy locus in rice endosperm did not abolish GBSS activity completely. Compensatory mechanisms in endosperm and leaves caused a major reprogramming of the starch biosynthetic machinery. The mutation of genes in the starch biosynthesis pathway has a profound effect on starch quality and quantity and is an important target for plant breeders. Mutations in  endosperm starch biosynthetic genes may impact starch metabolism in vegetative tissues such as leaves in unexpected ways due to the complex feedback mechanisms  regulating the pathway. Surprisingly this aspect of global starch metabolism has  received little attention. We used CRISPR/Cas9 to introduce mutations affecting the Waxy (Wx) locus encoding granule-bound starch synthase I (GBSSI) in rice endosperm. Our specific objective was to develop a mechanistic understanding of how the endogenous starch biosynthetic machinery might be affected at the transcriptional level following the targeted knock out of GBSSI in the endosperm. We found that the mutations reduced but did not abolish GBSS activity in seeds due to partial compensation caused by the upregulation of GBSSII. The GBSS activity in the mutants was 61-71% of wild-type levels, similarly to two irradiation mutants, but the amylose content declined to 8-12% in heterozygous seeds and to as low as 5% in homozygous seeds, accompanied by abnormal cellular organization in the aleurone layer and amorphous starch grain structures. Expression of many other starch biosynthetic genes was modulated in seeds and leaves. This modulation of gene expression resulted in changes in AGPase and sucrose synthase activity that explained the corresponding levels of starch and soluble sugars.","rice","重要なメッセージ：米内精子のワックス状遺伝子座に誘発された変異は、GBSS活性を完全に無効にしませんでした。内胚葉と葉の代償メカニズムは、デンプン生合成機構の主要な再プログラミングを引き起こしました。でんぷん生合成経路の遺伝子の変異は、でんぷんの質と量に大きな影響を及ぼし、植物育種家にとって重要な標的です。内胚葉デンプン生合成遺伝子の変異は、経路を調節する複雑なフィードバックメカニズムのために、葉などの栄養組織のデンプン代謝に予期しない方法で影響を与える可能性があります。驚くべきことに、世界的なデンプン代謝のこの側面はほとんど注目されていません。CRISPR / Cas9を使用して、米内精子の顆粒結合デンプンシンターゼI（GBSSI）をコードするWaxy（Wx）遺伝子座に影響を与える変異を導入しました。私たちの具体的な目的は、内因性デンプン生合成機構が、胚乳におけるGBSSIの標的ノックアウトに続いて、転写レベルでどのように影響を受けるかについての機構的理解を深めることでした。GBSSIIのアップレギュレーションによって引き起こされた部分的な補償のために、変異は減少したが、種子のGBSS活性を無効にしなかったことがわかった。変異体のGBSS活性は、2つの照射変異体と同様に、野生型レベルの61〜71％でしたが、アミロース含有量は、ヘテロ接合種子では8〜12％に、ホモ接合種子では5％に低下し、異常を伴いました。アリューロン層の細胞組織とアモルファスデンプン粒構造。他の多くのデンプン生合成遺伝子の発現は、種子と葉で調節されました。遺伝子発現のこの調節は、AGPaseおよびスクロースシンターゼ活性の変化をもたらし、これは、デンプンおよび可溶性糖の対応するレベルを説明した。"]
[187,31404128,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","2 loci","Plant direct","Heat-shock-inducible CRISPR/Cas9 system generates heritable mutations in rice.",2019,"3(5):e00145","[Nandy S et al.]","University of Arkansas, Fayetteville, AR, USA.",31404128,"10.1002/pld3.145 ","Transient expression of CRISPR/Cas9 is an effective approach for limiting its activities and improving its precision in genome editing. Here, we describe the heat-shock-inducible CRISPR/Cas9 for controlled genome editing, and demonstrate its efficiency in the model crop, rice. Using the soybean heat-shock protein gene promoter and the rice U3 promoter to express Cas9 and sgRNA, respectively, we developed the heat-shock (HS)-inducible CRISPR/Cas9 system, and tested its efficacy in targeted mutagenesis. Two loci were targeted in rice, and the presence of targeted mutations was determined before and after the HS treatment.  Only a low rate of targeted mutagenesis was detected before HS (~16%), but an increased rate of mutagenesis was observed after the HS treatment among the transgenic lines (50-63%). Analysis of regenerated plants harboring HS-CRISPR/Cas9 revealed that targeted mutagenesis was suppressed in the plants but induced by HS, which was detectable by Sanger sequencing after a few weeks of HS treatments. Most importantly, the HS-induced mutations were transmitted to the progeny at a high rate, generating monoallelic and biallelic mutations that independently segregated from the Cas9 gene. Additionally, off-target mutations were either undetectable or found at a lower rate in HS-CRISPR/Cas9 lines as compared to the constitutive-overexpression CRISPR/Cas9 lines. Taken together, this work shows that HS-CRISPR/Cas9 is a controlled and reasonably efficient platform for genome editing, and therefore, a promising tool for limiting genome-wide off-target effects and improving the precision of genome editing.","rice","CRISPR / Cas9の一過性発現は、その活動を制限し、ゲノム編集の精度を向上させるための効果的なアプローチです。ここでは、制御されたゲノム編集のための熱ショック誘導性CRISPR / Cas9について説明し、モデル作物であるイネにおけるその効率を示します。大豆熱ショックタンパク質遺伝子プロモーターと米U3プロモーターをそれぞれCas9とsgRNAを発現させるために使用して、熱ショック（HS）誘導性CRISPR / Cas9システムを開発し、標的突然変異誘発におけるその有効性をテストしました。イネでは2つの遺伝子座が標的にされ、HS治療の前後に標的変異の存在が確認されました。HSの前に検出された標的突然変異誘発率は低かった（〜16％）が、トランスジェニック系統ではHS治療後に突然変異誘発率の増加が観察された（50-63％）。HS-CRISPR / Cas9を含む再生植物の分析により、標的突然変異誘発は植物では抑制されたが、HSによって誘導されたことが明らかになりました。HSは、HS処理の数週間後にサンガーシーケンシングによって検出可能でした。最も重要なことは、HSによって誘発された突然変異が高率で子孫に伝達され、Cas9遺伝子から独立して分離された単対立遺伝子および二対立遺伝子の突然変異を生成したことです。さらに、HS-CRISPR / Cas9系統では、構成的過剰発現CRISPR / Cas9系統と比較して、オフターゲット変異が検出されないか、検出率が低くなっています。まとめると、この作業は、HS-CRISPR / Cas9がゲノム編集のための制御された合理的に効率的なプラットフォームであり、したがって、ゲノム全体のオフターゲット効果を制限し、ゲノム編集の精度を向上させるための有望なツールであることを示しています。"]
[188,30773774,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","OsMYB108","Plant journal","OsMYB108 loss-of-function enriches p-coumaroylated and tricin lignin units in rice cell walls.",2019,"98(6):975-987","[Miyamoto T  et al.]","Kyoto University, Uji, Kyoto, Japan.",30773774,"10.1111/tpj.14290 ","Breeding approaches to enrich lignins in biomass could be beneficial to improving the biorefinery process because lignins increase biomass heating value and represent a potent source of valuable aromatic chemicals. However, despite the fact that grasses are promising lignocellulose feedstocks, limited information is yet available for molecular-breeding approaches to upregulate lignin biosynthesis in grass species. In this study, we generated lignin-enriched transgenic rice (Oryza sativa), a model grass species, via targeted mutagenesis of the transcriptional repressor OsMYB108 using CRISPR/Cas9-mediated genome editing. The OsMYB108-knockout rice mutants displayed increased expressions of lignin biosynthetic genes and enhanced lignin deposition in culm cell walls. Chemical and two-dimensional nuclear magnetic resonance (NMR) analyses revealed that the mutant cell walls were preferentially enriched in gamma-p-coumaroylated and tricin lignin units, both of which are typical and unique components in grass lignins. NMR analysis also showed that the relative abundances of major lignin linkage types were altered in the OsMYB108 mutants.","rice","リグニンはバイオマス加熱値を増加させ、貴重な芳香化学物質の強力な供給源となるため、バイオマス中のリグニンを濃縮するための育種アプローチは、バイオリファイナリープロセスの改善に有益である可能性があります。しかし、草がリグノセルロース原料として有望であるという事実にもかかわらず、草種のリグニン生合成をアップレギュレートするための分子育種アプローチについては、まだ限られた情報しか利用できません。この研究では、CRISPR / Cas9を介したゲノム編集を使用した転写リプレッサーOsMYB108の標的突然変異誘発により、モデル草種であるリグニンに富むトランスジェニックイネ（Oryza sativa）を生成しました。OsMYB108ノックアウト米変異体は、リグニン生合成遺伝子の発現の増加と、カルム細胞壁におけるリグニン沈着の増強を示した。化学的および二次元核磁気共鳴（NMR）分析により、変異細胞壁は、ガンマ-p-クマロイル化およびトリシンリグニンユニットが優先的に濃縮されていることが明らかになりました。これらは両方とも、グラスリグニンの典型的でユニークな成分です。NMR分析はまた、主要なリグニン結合タイプの相対的な存在量がOsMYB108変異体で変化したことを示しました。"]
[189,30375064,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","coniferaldehyde 5-hydroxylase (OsCAld5H1)","Plant journal","Lignin characterization of rice CONIFERALDEHYDE 5-HYDROXYLASE loss-of-function mutants generated with the CRISPR/Cas9 system.",2019,"97(3):543-554","[Takeda Y et al.]","Kyoto University, Uji, Kyoto, Japan.",30375064,"10.1111/tpj.14141 ","The aromatic composition of lignin is an important trait that greatly affects the usability of lignocellulosic biomass. We previously identified a rice (Oryza sativa) gene encoding coniferaldehyde 5-hydroxylase (OsCAld5H1), which was effective in modulating syringyl (S)/guaiacyl (G) lignin composition ratio in rice, a model grass species. Previously characterized OsCAld5H1-knockdown rice lines, which were produced via an RNA-interference approach, showed augmented G lignin units yet contained considerable amounts of residual S lignin units. In this study, to further investigate the effect of suppression of OsCAld5H1 on rice lignin structure, we generated loss-of-function mutants of OsCAld5H1 using the CRISPR/Cas9-mediated genome editing system. Homozygous OsCAld5H1-knockout lines harboring anticipated frame-shift mutations in OsCAld5H1 were successfully obtained. A series of wet-chemical and two-dimensional NMR analyses on cell walls demonstrated that although lignins in the mutant were predictably enriched in G units all the tested mutant lines produced considerable numbers of S units. Intriguingly, lignin gamma-p-coumaroylation analysis by the derivatization followed by reductive cleavage method revealed that enrichment of G units in lignins of the mutants was limited to the non-gamma-p-coumaroylated units, whereas grass-specific gamma-p-coumaroylated lignin units were almost unaffected. Gene expression analysis indicated that no homologous genes of OsCAld5H1 were overexpressed in the mutants. These data suggested that CAld5H is mainly involved in the production of non-gamma-p-coumaroylated S lignin units, common in both eudicots and grasses, but not in the production of grass-specific gamma-p-coumaroylated S units in rice.","rice","リグニンの芳香組成は、リグノセルロース系バイオマスの有用性に大きく影響する重要な特性です。モデルグラス種であるイネのシリンギル（S）/グアヤシル（G）リグニン組成比の調節に有効なコニフェルアルデヒド5-ヒドロキシラーゼ（OsCAld5H1）をコードするイネ（Oryza sativa）遺伝子を以前に同定しました。RNA干渉アプローチを介して生産された以前に特徴付けられたOsCAld5H1ノックダウンライスラインは、増強されたGリグニンユニットを示したが、かなりの量の残留Sリグニンユニットを含んでいた。この研究では、OsCAld5H1の抑制が米リグニン構造に及ぼす影響をさらに調査するために、CRISPR / Cas9を介したゲノム編集システムを使用してOsCAld5H1の機能喪失型変異体を生成しました。OsCAld5H1で予想されるフレームシフト変異を含むホモ接合型OsCAld5H1-ノックアウトラインが正常に取得されました。細胞壁の一連の湿式化学および二次元NMR分析は、変異体のリグニンが予想通りGユニットに富んでいるにもかかわらず、テストされたすべての変異株がかなりの数のSユニットを生成することを示しました。興味深いことに、誘導体化とそれに続く還元的切断法によるリグニンガンマ-p-クマロイル化分析は、変異体のリグニンにおけるGユニットの濃縮が非ガンマ-p-クマロイル化ユニットに限定されているのに対し、草特異的ガンマ-p-クマロイル化リグニンユニットはほとんど影響を受けませんでした。遺伝子発現分析は、OsCAld5H1の相同遺伝子が変異体で過剰発現されていないことを示した。これらのデータは、CAld5Hが主に非ガンマp-クマロイル化Sリグニンユニットの生成に関与し、ユージコットと草の両方に共通であるが、米における草特異的なガンマ-p-クマロイル化Sユニットの生成には関与しないことを示唆しました。"]
[190,31872309,"plant","rice","CRISPR;","OsLOGL5","Plant molecular biology","A cytokinin-activation enzyme-like gene improves grain yield under various field  conditions in rice.",2019,null,"[Wang C et al.]","Sinobioway Bio-Agriculture Group Co., Ltd, Beijing, China.",31872309,"10.1007/s11103-019-00952-5 ","KEY MESSAGE: CRISPR-edited variants at the 3'-end of OsLOGL5's coding sequence (CDS), significantly increased rice grain yield under well-watered, drought, normal nitrogen, and low nitrogen field conditions at multiple geographical locations. Cytokinins impact numerous aspects of plant growth and development. This study reports that constitutive ectopic overexpression of a rice cytokinin-activation enzyme-like gene, OsLOGL5, significantly reduced primary root growth, tiller number, and yield. Conversely, mutations at the 3'-end of OsLOGL5 CDS resulted in normal rice plant morphology but with increased grain yield under well-watered, drought, normal nitrogen, and low nitrogen field conditions at multiple geographical locations. Six gene edited variants (Edit A to F) were created and tested in the field. Edit-B and Edit-F plants increased, but Edit-D and Edit-E plants decreased, the panicle number per plant. All OsLOGL5-edited plants significantly increased seed setting rate, total grain numbers, full-filled grain numbers per panicle, and thousand seed weight under drought conditions, suggesting that OsLOGL5 is likely involved in the regulation  of both seed development and grain filling processes. Our results indicate that the C-terminal end of OsLOGL5 protein plays an important role in regulating rice  yield improvement under different abiotic stress conditions, and OsLOGL5 is important for rice yield enhancement and stability.","rice","重要なメッセージ：OsLOGL5のコード配列（CDS）の3 '末端にあるCRISPRで編集された変異体は、複数の地理的位置で、十分に水を与えられた干ばつ、通常の窒素、および低窒素の圃場条件下で米粒収量を大幅に増加させました。サイトキニンは、植物の成長と発達の多くの側面に影響を与えます。この研究は、イネのサイトカイニン活性化酵素様遺伝子であるOsLOGL5の構成的異所性過剰発現が、一次根の成長、分げつ数、および収量を大幅に減少させたことを報告しています。逆に、OsLOGL5 CDSの3 '末端の突然変異は、通常のイネの形態をもたらしましたが、複数の地理的位置で、十分に水を与えられ、干ばつ、通常の窒素、および低窒素の圃場条件下で穀物収量が増加しました。6つの遺伝子編集バリアント（編集AからF）が作成され、フィールドでテストされました。Edit-BおよびEdit-Fプラントは増加しましたが、Edit-DおよびEdit-Eプラントは減少し、プラントあたりのパニクル数が減少しました。OsLOGL5で編集されたすべての植物は、干ばつ条件下で種子の定着率、総粒子数、パニクルあたりの完全充填粒子数、および千種子重量を大幅に増加させ、OsLOGL5が種子発達と粒子充填プロセスの両方の調節に関与している可能性が高いことを示唆しています。我々の結果は、OsLOGL5タンパク質のC末端が、さまざまな非生物的ストレス条件下での米の収量改善の調節に重要な役割を果たし、OsLOGL5が米の収量の向上と安定性に重要であることを示しています。"]
[191,31004275,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","OsIAA23","Plant molecular biology","Different knockout genotypes of OsIAA23 in rice using CRISPR/Cas9 generating different phenotypes.",2019,"100(4-5):467-479","[Jiang M et al.]","Nanjing University, Nanjing, China.",31004275,"10.1007/s11103-019-00871-5 ","KEY MESSAGE: We have isolated several Osiaa23 rice mutants with different knockout genotypes, resulting in different phenotypes, which suggested that different genetic backgrounds or mutation types influence gene function. The Auxin/Indole-3-Acetic Acid (Aux/IAA) gene family performs critical roles in auxin signal transduction in plants. In rice, the gene OsIAA23 (Os06t0597000) is known  to affect development of roots and shoots, but previous knockouts in OsIAA23 have been sterile and difficult for research continuously. Here, we isolate new Osiaa23 mutants using the CRISPR/Cas9 system in japonica (Wuyunjing24) and indica (Kasalath) rice, with extensive genome re-sequencing to confirm the absence of off-target effects. In Kasalath, mutants with a 13-amino acid deletion showed profoundly greater dwarfing, lateral root developmental disorder, and fertility deficiency, relative to mutants with a single amino acid deletion, demonstrating  that those 13 amino acids in Kasalath are essential to gene function. In Wuyunjing24, we predicted that mutants with a single base-pair frameshift insertion would experience premature termination and strong phenotypic defects, but instead these lines exhibited negligible phenotypic difference and normal fertility. Through RNA-seq, we show here that new mosaic transcripts of OsIAA23 were produced de novo, which circumvented the premature termination and thereby preserved the wild-type phenotype. This finding is a notable demonstration in plants that mutants can mask loss of function CRISPR/Cas9 editing of the target gene through de novo changes in alternative splicing.","rice","重要なメッセージ：ノックアウト遺伝子型が異なるいくつかのOsiaa23米変異体を単離し、異なる表現型をもたらしました。これは、異なる遺伝的背景または変異型が遺伝子機能に影響を与えることを示唆しています。Auxin / Indole-3-Acetic Acid（Aux / IAA）遺伝子ファミリーは、植物のオーキシンシグナル伝達において重要な役割を果たします。米では、遺伝子OsIAA23（Os06t0597000）が根や芽の発達に影響を与えることが知られていますが、OsIAA23の以前のノックアウトは無菌であり、継続的な研究が困難です。ここでは、ジャポニカ（Wuyunjing24）とインディカ（Kasalath）の米でCRISPR / Cas9システムを使用して、新しいOsiaa23変異体を分離し、オフターゲット効果がないことを確認するために広範なゲノムリシーケンスを行います。カサラスでは、13アミノ酸の欠失を持つ変異体は、単一のアミノ酸欠失を持つ変異体と比較して、矮小化、側根発達障害、および生殖能力の欠如が著しく大きく、カサラスのこれらの13アミノ酸が遺伝子機能に不可欠であることを示しています。Wuyunjing24では、単一の塩基対フレームシフト挿入を伴う変異体は、早期終了と強い表現型の欠陥を経験すると予測しましたが、代わりにこれらの系統は無視できる表現型の違いと正常な受精能を示しました。RNA-seqを通じて、OsIAA23の新しいモザイク転写産物が新たに生成されたことを示します。これにより、早期終了が回避され、野生型の表現型が維持されました。この発見は、変異体が選択的スプライシングの新たな変化を通じて標的遺伝子のCRISPR / Cas9編集機能の喪失を隠すことができるという植物の注目すべき実証です。"]
[192,30645710,"plant","rice","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","rice AP2 domain-containing protein gene Os01g04020","Plant molecular biology","CRISPR/Cas9-mediated targeted T-DNA integration in rice.",2019,"99(4-5):317-328","[Lee K et al.]"," Iowa State University, Ames, IA, USA.",30645710,"10.1007/s11103-018-00819-1 ","KEY MESSAGE: Combining with a CRISPR/Cas9 system, Agrobacterium-mediated transformation can lead to precise targeted T-DNA integration in the rice genome. Agrobacterium-mediated T-DNA integration into the plant genomes is random, which  often causes variable transgene expression and insertional mutagenesis. Because T-DNA preferentially integrates into double-strand DNA breaks, we adapted a CRISPR/Cas9 system to demonstrate that targeted T-DNA integration can be achieved in the rice genome. Using a standard Agrobacterium binary vector, we constructed  a T-DNA that contains a CRISPR/Cas9 system using SpCas9 and a gRNA targeting the  exon of the rice AP2 domain-containing protein gene Os01g04020. The T-DNA also carried a red fluorescent protein and a hygromycin resistance (hptII) gene. One version of the vector had hptII expression driven by an OsAct2 promoter. In an effort to detect targeted T-DNA insertion events, we built another T-DNA with a promoterless hptII gene adjacent to the T-DNA right border such that integration  of T-DNA into the targeted exon sequence in-frame with the hptII gene would allow hptII expression. Our results showed that these constructs could produce targeted T-DNA insertions with frequencies ranging between 4 and 5.3% of transgenic callus events, in addition to generating a high frequency (50-80%) of targeted indel mutations. Sequencing analyses showed that four out of five sequenced T-DNA/gDNA  junctions carry a single copy of full-length T-DNA at the target site. Our results indicate that Agrobacterium-mediated transformation combined with a CRISPR/Cas9 system can efficiently generate targeted T-DNA insertions.","rice","重要なメッセージ：CRISPR / Cas9システムと組み合わせることで、アグロバクテリウムを介した形質転換は、米ゲノムへの正確な標的T-DNA統合につながる可能性があります。アグロバクテリウムを介した植物ゲノムへのT-DNAの組み込みはランダムであり、これはしばしば可変の導入遺伝子発現と挿入変異を引き起こします。T-DNAは二本鎖DNA切断に優先的に統合されるため、CRISPR / Cas9システムを採用して、イネのゲノムでターゲットを絞ったT-DNA統合を実現できることを実証しました。標準のAgrobacteriumバイナリベクターを使用して、SpCas9と米AP2ドメイン含有タンパク質遺伝子Os01g04020のエキソンを標的とするgRNAを使用したCRISPR / Cas9システムを含むT-DNAを構築しました。T-DNAは、赤色蛍光タンパク質とハイグロマイシン耐性（hptII）遺伝子も持っていました。ベクターの1つのバージョンには、OsAct2プロモーターによって駆動されるhptII発現がありました。標的となるT-DNA挿入イベントを検出するために、HptII遺伝子とインフレームで標的となるエキソン配列にT-DNAを組み込むように、T-DNAの右境界に隣接するプロモーターのないhptII遺伝子を持つ別のT-DNAを構築しました。 hptII式を許可します。私たちの結果は、これらのコンストラクトが、高頻度（50-80％）の標的インデル変異を生成することに加えて、トランスジェニックカルスイベントの4〜5.3％の範囲の頻度で標的T-DNA挿入を生成できることを示しました。シーケンス分析では、シーケンスされた5つのT-DNA / gDNAジャンクションのうち4つが、ターゲットサイトに完全長T-DNAの単一コピーを持っていることが示されました。私たちの結果は、CRISPR / Cas9システムと組み合わせたアグロバクテリウムを介した形質転換が標的T-DNA挿入を効率的に生成できることを示しています。"]
[193,30610522,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","OsMS1","Plant molecular biology","OsMS1 functions as a transcriptional activator to regulate programmed tapetum development and pollen exine formation in rice.",2019,"99(1-2):175-191","[Yang Z et al.]","China National Rice Research Institute, Hangzhou, China.",30610522,"10.1007/s11103-018-0811-0 ","KEY MESSAGE: OsMS1 functions as a transcriptional activator and interacts with known tapetal regulatory factors through its plant homeodomain (PHD) regulating tapetal programmed cell death (PCD) and pollen exine formation in rice. The tapetum, a hallmark tissue in the stamen, undergoes degradation triggered by PCD  during post-meiotic anther development. This degradation process is indispensable for anther cuticle and pollen exine formation. Previous study has shown that PTC1 plays a critical role in the regulation of tapetal PCD. However, it remained unclear how this occurs. To further investigate the role of this gene in rice, we used CRISPR/Cas9 system to generate the homozygous mutant named as osms1, which showed complete male sterility with slightly yellow and small anthers, as well as invisible pollen grains. In addition, cytological observation revealed delayed tapetal PCD, defective pollen exine formation and a lack of DNA fragmentation according to a TUNEL analysis in the anthers of osms1 mutant. OsMS1, which encodes a PHD finger protein, was located in the nucleus of rice protoplasts and  functioned as a transcription factor with transcriptional activation activity. Y2H and BiFC assays demonstrated that OsMS1 can interact with OsMADS15 and TDR INTERACTING PROTEIN2 (TIP2). It has been reported that TIP2 coordinated with TDR  to modulate the expression of EAT1 and further regulated tapetal PCD in rice. Results of qPCR suggested that the expression of the genes associated with tapetal PCD and pollen wall biosynthesis, such as EAT1, AP37, AP25, OsC6 and OsC4, were significantly reduced in osms1 mutant. Taken together, our results demonstrate that the interaction of OsMS1 with known tapetal regulatory factors through its PHD finger regulates tapetal PCD and pollen exine formation in rice.","rice","重要なメッセージ：OsMS1は転写活性化因子として機能し、タペタルプログラム細胞死（PCD）とイネの花粉外皮形成を調節する植物ホメオドメイン（PHD）を介して既知のタペタル調節因子と相互作用します。雄しべの特徴的な組織であるタペタムは、減数分裂後の葯の発達中にPCDによって引き起こされる分解を受けます。この分解プロセスは、葯のキューティクルと花粉の外皮の形成に不可欠です。以前の研究では、PTC1がタペタルPCDの調節に重要な役割を果たすことが示されています。ただし、これがどのように発生するかは不明なままでした。米におけるこの遺伝子の役割をさらに調査するために、CRISPR / Cas9システムを使用して、osms1という名前のホモ接合変異体を生成しました。これは、わずかに黄色で小さな葯、および目に見えない花粉粒を伴う完全な雄性不稔を示しました。さらに、細胞学的観察により、osms1変異体の葯におけるTUNEL分析によると、タペタルPCDの遅延、花粉外皮形成の欠陥、およびDNA断片化の欠如が明らかになりました。PHDフィンガータンパク質をコードするOsMS1は、イネのプロトプラストの核に位置し、転写活性化活性を持つ転写因子として機能しました。Y2HおよびBiFCアッセイは、OsMS1がOsMADS15およびTDR INTERACTING PROTEIN2（TIP2）と相互作用できることを示しました。TIP2はTDRと協調して、EAT1の発現を調節し、米のタペタルPCDをさらに調節することが報告されています。qPCRの結果は、EAT1、AP37、AP25、OsC6、OsC4などのタペタルPCDおよび花粉壁生合成に関連する遺伝子の発現がosms1変異体で有意に減少したことを示唆しました。まとめると、我々の結果は、OsMS1とそのPHDフィンガーを介した既知のタペタル調節因子との相互作用が、イネのタペタルPCDおよび花粉外皮形成を調節することを示しています。"]
[194,31519786,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","grain-filling rate1","Plant physiology","Favorable Alleles of GRAIN-FILLING RATE1 Increase the Grain-Filling Rate and Yield of Rice.",2019,"181(3):1207-1222","[Liu E et al.]","Nanjing Agricultural University, Nanjing, China.",31519786,"10.1104/pp.19.00413 ","Hybrid rice (Oryza sativa) has been cultivated commercially for 42 years in China. However, poor grain filling still limits the development of hybrid japonica rice. We report here the map-based cloning and characterization of the GRAIN-FILLING RATE1 (GFR1) gene present at a major-effect quantitative trait locus. We elucidated and confirmed the function of GFR1 via genetic complementation experiments and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) gene editing in combination with genetic and molecular biological analyses. In addition, we conducted haplotype association analysis to mine the elite alleles of GFR1 among 117 rice accessions. We observed that GFR1 was constitutively expressed and encoded a membrane-localized protein. The allele of the rice accession Ludao (GFR1 (Ludao)) improved the grain-filling rate of rice by increasing Rubisco initial activity in the Calvin cycle. Moreover, the increased expression of the cell wall invertase gene OsCIN1 in the near isogenic line NIL-GFR1 (Ludao) promoted the unloading of  Suc during the rice grain-filling stage. A yeast two-hybrid assay indicated that  the Rubisco small subunit interacts with GFR1, possibly in the regulation of the  rice grain-filling rate. Evaluation of the grain-filling rate and grain yield of  F1 plants harboring GFR1 (Ludao) and the alleles of 20 hybrids widely cultivated  commercially confirmed that favorable alleles of GFR1 can be used to further improve the grain-filling rate of hybrid japonica rice.","rice","ハイブリッドライス（Oryza sativa）は、中国で42年間商業的に栽培されてきました。しかし、不十分な穀物充填は依然としてハイブリッドジャポニカ米の開発を制限します。ここでは、主要な効果の量的形質遺伝子座に存在するGRAIN-FILLING RATE1（GFR1）遺伝子のマップベースのクローニングと特性評価について報告します。遺伝的補完実験と、遺伝的および分子的生物学的分析と組み合わせた、規則的に間隔を空けた短いパリンドローム反復（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9（Cas9）遺伝子編集をクラスター化して、GFR1の機能を解明および確認しました。さらに、117の米系統の中からGFR1のエリート対立遺伝子を採掘するためにハプロタイプ関連分析を実施しました。我々は、GFR1が構成的に発現され、膜に局在するタンパク質をコードしていることを観察した。イネアクセッションLudao（GFR1（Ludao））の対立遺伝子は、カルビン回路のRubisco初期活性を増加させることにより、イネの穀粒充填率を改善しました。さらに、同質遺伝子に近い系統NIL-GFR1（Ludao）での細胞壁インベルターゼ遺伝子OsCIN1の発現増加は、米粒充填段階でのSucのアンロードを促進しました。酵母の2ハイブリッドアッセイは、Rubiscoの小サブユニットがGFR1と相互作用し、おそらく米粒の充填率の調節に関与することを示しました。GFR1（ルダオ）と広く商業的に栽培されている20のハイブリッドの対立遺伝子を保有するF1植物の穀物充填率と穀物収量の評価により、GFR1の好ましい対立遺伝子を使用してハイブリッドジャポニカ米の穀物充填率をさらに改善できることが確認されました。"]
[195,31160507,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","13 genes across four enzymatic steps in gibberellin metabolism pathway","Plant physiology","CRISPR-Based Assessment of Gene Specialization in the Gibberellin Metabolic Pathway in Rice.",2019,"180(4):2091-2105","[Chen X  et al.]","Nanjing University, Nanjing, China.",31160507,"10.1104/pp.19.00328 ","Gibberellin (GA) functions as an essential natural regulator of growth and development in plants. For each step of the GA metabolic pathway, different copy  numbers can be found in different species, as is the case with the 13 genes across four enzymatic steps in rice (Oryza sativa). A common view is that such gene duplication creates homologs that buffer organisms against loss-of-function  (LOF) mutations. Therefore, knockouts of any single homolog might be expected to  have little effect. To test this question, we generated clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR associated protein 9 (Cas9) knockouts for these homologs and measured effects on growth and reproduction. Surprisingly, we report here that there is consistently one or more essential gene at each enzymatic step, for which LOF mutation induces death or sterility-suggesting that the GA pathway does not have a redundancy route and that each gene family is essential for GA metabolism. In most of these genes from the same gene family, we observed defects in plant height and infertility, suggesting that the duplicated members retain functions related to GA synthesis or degradation. We identified both subfunctionalization of the three recently diversified homologs OsKO1, OsKO2, and OsKO5 and neofunctionalization in OsKO3 and OsKO4 Thus, although the function of each step is conserved, the evolution of duplicates in that step is diversified. Interestingly, the CRISPR/Cas9 lines at the SD1 locus were typically sterile, whereas the natural sd1 mutants, related to the \"Green Revolution\" in rice, show normal setting rates. Collectively, our results identify candidates for control of GA production and provide insight into the evolution of four critical gene families in plants.","rice","ジベレリン（GA）は、植物の成長と発達に不​​可欠な自然の調節因子として機能します。イネ（Oryza sativa）の4つの酵素ステップにわたる13の遺伝子の場合と同様に、GA代謝経路の各ステップでは、異なる種で異なるコピー数を見つけることができます。一般的な見解は、そのような遺伝子の複製は、機能喪失（LOF）変異に対して生物を緩衝するホモログを作成するというものです。したがって、単一のホモログのノックアウトはほとんど効果がないと予想される場合があります。この質問をテストするために、これらのホモログのクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9（Cas9）ノックアウトを生成し、成長と生殖への影響を測定しました。驚いたことに、ここでは、各酵素ステップに一貫して1つ以上の必須遺伝子があり、LOF変異が死または不稔を誘発することを報告します。これは、GA経路に冗長経路がなく、各遺伝子ファミリーがGA代謝に不可欠であることを示唆しています。同じ遺伝子ファミリーのこれらの遺伝子のほとんどで、草丈と不妊症の欠陥が観察され、複製されたメンバーがGAの合成または分解に関連する機能を保持していることが示唆されました。最近多様化した3つのホモログOsKO1、OsKO2、OsKO5のサブ機能化と、OsKO3およびOsKO4の新機能化の両方を特定しました。したがって、各ステップの機能は保存されていますが、そのステップでの重複の進化は多様化しています。興味深いことに、SD1遺伝子座のCRISPR / Cas9系統は通常無菌でしたが、米の「グリーンレボリューション」に関連する天然のsd1変異体は通常の硬化率を示しています。まとめると、私たちの結果は、GA産生の制御の候補を特定し、植物における4つの重要な遺伝子ファミリーの進化への洞察を提供します。"]
[196,31015088,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","glycyl-tRNA synthetase (rice albino 1)","Plant physiology and biochemistry","Rice albino 1, encoding a glycyl-tRNA synthetase, is involved in chloroplast development and establishment of the plastidic ribosome system in rice.",2019,"139:495-503","[Zheng H et al.]","Nanjing Agricultural University, Nanjing, China.",31015088,"10.1016/j.plaphy.2019.04.008 ","The chloroplast is an important organelle that performs photosynthesis as well as biosynthesis and storage of many metabolites. Aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs)  are key enzymes in protein synthesis. However, the relationship between chloroplast development and aaRSs still remains unclear. In this study, we isolated a rice albino 1 (ra1) mutant through methane sulfonate (EMS) mutagenesis of rice japonica cultivar Ningjing 4 (Oryza sativa L.), which displayed albinic leaves in seedling stage due to abnormal chloroplast development. Compared with wild type (WT), ra1 showed significantly decreased levels of chlorophylls (Chl) and carotenoids (Car) in 2-week-old seedlings, which also showed obvious plastidic structural defects including abnormal thylakoid membrane structures and more osmiophilic particles. These defects caused albino phenotypes in seedlings.  Map-based cloning revealed that RA1 gene encodes a glycyl-tRNA synthetase (GlyRS), which was confirmed by genetic complementation and knockout by Crispr/Cas9 technology. Sequence analysis showed that a single base mutation (T to A) occurred in the sixth exon of RA1 and resulted in a change from Isoleucine  (Ile) to Lysine (Lys). Real-time PCR analyses showed that RA1 expression levels were constitutive in most tissues, but most abundant in the leaves and stems. By  transient expression in Nicotiana benthamiana, we found that RA1 protein was localized in the chloroplast. Expression levels of chlorophyll biosynthesis and plastid development related genes were disordered in the ra1 mutant. RNA analysis revealed biogenesis of chloroplast rRNAs was abnormal in ra1. Meanwhile, western  blotting showed that synthesis of proteins associated with plastid development was significantly repressed. These results suggest that RA1 is involved in early  chloroplast development and establishment of the plastidic ribosome system in rice.","rice","葉緑体は、多くの代謝物の生合成と貯蔵だけでなく、光合成も行う重要なオルガネラです。アミノアシルtRNAシンテターゼ（aaRS）は、タンパク質合成における重要な酵素です。ただし、葉緑体の発達とaaRSの関係は依然として不明です。本研究では、葉緑体の異常な発達により苗期に白皮葉を示した米ジャポニカ栽培品種Ningjing 4（Oryza sativa L.）のメタンスルホン酸（EMS）変異誘発により、米アルビノ1（ra1）変異体を単離した。野生型（WT）と比較して、ra1は2週齢の苗木でクロロフィル（Chl）とカロテノイド（Car）のレベルが大幅に低下し、異常なチラコイド膜構造やより浸透圧性の粒子などの明らかなプラスチド構造の欠陥も示しました。これらの欠陥は、苗木にアルビノ表現型を引き起こしました。マップベースのクローニングにより、RA1遺伝子がグリシルtRNAシンテターゼ（GlyRS）をコードしていることが明らかになりました。これは、Crispr / Cas9テクノロジーによる遺伝子補完とノックアウトによって確認されました。シーケンス分析は、単一の塩基変異（TからA）がRA1の6番目のエキソンで発生し、イソロイシン（Ile）からリジン（Lys）への変化をもたらしたことを示しました。リアルタイムPCR分析は、RA1の発現レベルがほとんどの組織で構成的であるが、葉と茎で最も豊富であることを示しました。ニコチアナベンサミアナタバコの一過性発現により、RA1タンパク質が葉緑体に局在していることがわかりました。クロロフィル生合成および色素体発達関連遺伝子の発現レベルは、ra1変異体で無秩序でした。RNA分析により、葉緑体rRNAの生合成がra1​​で異常であることが明らかになりました。一方、ウエスタンブロッティングでは、プラスチドの発生に関連するタンパク質の合成が大幅に抑制されていることが示されました。これらの結果は、RA1がイネの葉緑体の初期発生とプラスチドリボソームシステムの確立に関与していることを示唆している。"]
[197,30824000,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","NF-Y transcription factor (OsNF-YC10)","Plant science","OsNF-YC10, a seed preferentially expressed gene regulates grain width by affecting cell proliferation in rice.",2019,"280:219-227","[Jia S et al.]","Huazhong Agricultural University, Wuhan, China.",30824000,"10.1016/j.plantsci.2018.09.021 ","Grain size and shape are important factors in determining the grain yield. In this study, OsNF-YC10, a member of the NF-Y transcription factor family encoding  a putative histone transcription factor, was cloned and characterized. qRT-PCR and mRNA in situ hybridization analysis revealed that OsNF-YC10 was highly expressed in endosperm and spikelet hull at late developmental stages. The results showed that OsNF-YC10 was a nuclear protein showing transcription activation activity. The osnf-yc10 lines, produced using CRISPR/Cas9 technology,  showed narrow, thin and light grains. Cytological experiments revealed significantly reduced cell number of spikelet hull in osnf-yc10 lines compared with that in WT. Narrow, thin, and light grains were found consistently in OsNF-YC10 RNAi transgenic lines. Moreover, the number of cells decreased in the grain-width direction than WT. These results indicated that OsNF-YC10 plays an important role in determining grain size and shape. OsNF-YC10 was further revealed to influence the expression of GW8 (a positive regulator of grain width), GW7 (a negative regulator of grain width) and cell cycle-regulated genes  CYCD4, CYCA2.1, CYCB2.1, CYCB2.2, E2F2. Taken together, it is suggested that OsNF-YC10 regulates the grains size and shape by influencing the cell proliferation of spikelet hulls.","rice","穀物のサイズと形状は、穀物の収量を決定する重要な要素です。この研究では、推定ヒストン転写因子をコードするNF-Y転写因子ファミリーのメンバーであるOsNF-YC10がクローン化され、特徴付けられました。qRT-PCRおよびmRNAin situハイブリダイゼーション分析により、OsNF-YC10が発達後期の内胚葉および小穂の外皮で高度に発現していることが明らかになりました。結果は、OsNF-YC10が転写活性化活性を示す核タンパク質であることを示した。CRISPR / Cas9テクノロジーを使用して製造されたosnf-yc10ラインは、細く、薄く、軽い粒子を示しました。細胞学的実験により、osnf-yc10系統では、WTと比較してスパイクレットハルの細胞数が大幅に減少していることが明らかになりました。OsNF-YC10 RNAiトランスジェニック系統では、細くて薄くて軽い粒子が一貫して見られました。さらに、セルの数は、WTよりも粒子幅方向に減少しました。これらの結果は、OsNF-YC10が粒子のサイズと形状を決定する上で重要な役割を果たすことを示しています。OsNF-YC10は、GW8（粒子幅の正の調節因子）、GW7（粒子幅の負の調節因子）、および細胞周期調節遺伝子CYCD4、CYCA2.1、CYCB2.1、CYCB2.2、の発現に影響を与えることがさらに明らかになりました。 E2F2。まとめると、OsNF-YC10は、スパイクレットハルの細胞増殖に影響を与えることにより、粒子のサイズと形状を調節することが示唆されています。"]
[198,30399648,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","OsAUX3","Plant, cell & environment","The auxin influx carrier, OsAUX3, regulates rice root development and responses to aluminium stress.",2019,"42(4):1125-1138","[Wang M et al.]","Zhejiang University, Hangzhou, China.",30399648,"10.1111/pce.13478 ","In rice, there are five members of the auxin carrier AUXIN1/LIKE AUX1 family; however, the biological functions of the other four members besides OsAUX1 remain unknown. Here, by using CRISPR/Cas9, we constructed two independent OsAUX3 knock-down lines, osaux3-1 and osaux3-2, in wild-type rice, Hwayoung (WT/HY) and  Dongjin (WT/DJ). osaux3-1 and osaux3-2 have shorter primary roots (PRs), decreased lateral root (LR) density, and longer root hairs (RHs) compared with their WT. OsAUX3 expression in PRs, LRs, and RHs further supports that OsAUX3 plays a critical role in the regulation of root development. OsAUX3 locates at the plasma membrane and functions as an auxin influx carrier affecting acropetal  auxin transport. OsAUX3 is up-regulated in the root apex under aluminium (Al) stress, and osaux3-2 is insensitive to Al treatments. Furthermore, 1-naphthylacetic acid accented the sensitivity of WT/DJ and osaux3-2 to respond to Al stress. Auxin concentrations, Al contents, and Al-induced reactive oxygen species-mediated damage in osaux3-2 under Al stress are lower than in WT, indicating that OsAUX3 is involved in Al-induced inhibition of root growth. This  study uncovers a novel pathway alleviating Al-induced oxidative damage by inhibition of acropetal auxin transport and provides a new option for engineering Al-tolerant rice species.","rice","イネには、オーキシンキャリアAUXIN1 / LIKEAUX1ファミリーの5つのメンバーがあります。ただし、OsAUX1以外の他の4つのメンバーの生物学的機能は不明のままです。ここでは、CRISPR / Cas9を使用して、野生型イネのファヨン（WT / HY）とドンジン（WT / DJ）に、2つの独立したOsAUX3ノックダウンラインosaux3-1とosaux3-2を構築しました。osaux3-1およびosaux3-2は、WTと比較して、一次根（PR）が短く、側根（LR）密度が低く、根毛（RH）が長くなっています。PR、LR、およびRHでのOsAUX3の発現は、OsAUX3が根の発達の調節において重要な役割を果たすことをさらにサポートします。OsAUX3は原形質膜に位置し、アクロペタルオーキシン輸送に影響を与えるオーキシン流入キャリアとして機能します。OsAUX3はアルミニウム（Al）ストレス下で根尖でアップレギュレートされ、osaux3-2はAl処理に反応しません。さらに、1-ナフチル酢酸は、Alストレスに応答するWT / DJおよびosaux3-2の感度を強調しました。Alストレス下のosaux3-2におけるAuxin濃度、Al含有量、およびAl誘導反応性酸素種媒介損傷はWTよりも低く、OsAUX3がAl誘導性の根の成長阻害に関与していることを示しています。この研究は、アクロペタルオーキシン輸送の阻害によってAl誘発性の酸化的損傷を軽減する新しい経路を明らかにし、Al耐性米種を設計するための新しいオプションを提供します。"]
[199,31035443,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","inositol 1,3,4-triphosphate 5/6-kinase6","Plants","Mutation of Inositol 1,3,4-trisphosphate 5/6-kinase6 Impairs Plant Growth and Phytic Acid Synthesis in Rice.",2019,"8(5)","[Jiang M  et al.]","Zhejiang University, Hangzhou, China.",31035443,"10.3390/plants8050114 ","Inositol 1,3,4-trisphosphate 5/6-kinase (ITPK) is encoded by six genes in rice (OsITPK1-6). A previous study had shown that nucleotide substitutions of OsITPK6  could significantly lower the phytic acid content in rice grains. In the present  study, the possibility of establishing a genome editing-based method for breeding low-phytic acid cultivars in rice was explored, in conjunction with the functional determination of OsITPK6. Four OsITPK6 mutant lines were generated by  targeted mutagenesis of the gene's first exon using the CRISPR/Cas9 method, one (ositpk6_1) with a 6-bp in-frame deletion, and other three with frameshift mutations (ositpk6_2, _3, and _4). The frameshift mutations severely impaired plant growth and reproduction, while the effect of ositpk6_1 was relatively limited. The mutant lines ositpk6_1 and _2 had significantly lower levels (-10.1% and -32.1%) of phytic acid and higher levels (4.12- and 5.18-fold) of inorganic phosphorus compared with the wild-type (WT) line. The line ositpk6_1 also showed  less tolerance to osmotic stresses. Our research demonstrates that mutations of OsITPK6, while effectively reducing phytic acid biosynthesis in rice grain, could significantly impair plant growth and reproduction.","rice","イノシトール1,3,4-三リン酸5 / 6-キナーゼ（ITPK）は、イネの6つの遺伝子（OsITPK1-6）によってコードされています。以前の研究では、OsITPK6のヌクレオチド置換により、米粒のフィチン酸含有量が大幅に低下する可能性があることが示されていました。本研究では、OsITPK6の機能決定と併せて、イネの低フィチン酸栽培品種を育種するためのゲノム編集ベースの方法を確立する可能性を検討しました。4つのOsITPK6変異株は、CRISPR / Cas9メソッドを使用した遺伝子の最初のエクソンの標的変異誘発によって生成されました。1つ（ositpk6_1）は6 bpのフレーム内欠失を持ち、他の3つはフレームシフト変異（ositpk6_2、_3、および_4）を持ちます。フレームシフト変異は植物の成長と繁殖を著しく損ないましたが、ositpk6_1の効果は比較的限られていました。変異株ositpk6_1および_2は、野生型（WT）株と比較して、有意に低いレベル（-10.1％および-32.1％）のフィチン酸と高いレベル（4.12および5.18倍）の無機リンを持っていました。ositpk6_1の線も、浸透圧ストレスに対する耐性が低いことを示しました。私たちの研究は、OsITPK6の変異は、米粒のフィチン酸生合成を効果的に減少させる一方で、植物の成長と繁殖を著しく損なう可能性があることを示しています。"]
[200,31150378,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","OsSNB","PLoS genetics","A novel rice grain size gene OsSNB was identified by genome-wide association study in natural population.",2019,"15(5):e1008191","[Ma X et al.]","Shanghai Agrobiological Gene Center, Shanghai, China.",31150378,"10.1371/journal.pgen.1008191 ","Increasing agricultural productivity is one of the most important goals of plant  science research and imperative to meet the needs of a rapidly growing population. Rice (Oryza sativa L.) is one of the most important staple crops worldwide. Grain size is both a major determinant of grain yield in rice and a target trait for domestication and artificial breeding. Here, a genome-wide association study of grain length and grain width was performed using 996,722 SNP markers in 270 rice accessions. Five and four quantitative trait loci were identified for grain length and grain width, respectively. In particular, the novel grain size gene OsSNB was identified from qGW7, and further results showed  that OsSNB negatively regulated grain size. Most notably, knockout mutant plants  by CRISPR/Cas9 technology showed increased grain length, width, and weight, while overexpression of OsSNB yielded the opposite. Sequencing of this gene from the promoter to the 3'-untranslated region in 168 rice accessions from a wide geographic range identified eight haplotypes. Furthermore, Hap 3 has the highest  grain width discovered in japonica subspecies. Compared to other haplotypes, Hap  3 has a 225 bp insertion in the promoter. Based on the difference between Hap 3 and other haplotypes, OsSNB_Indel2 was designed as a functional marker for the improvement of rice grain width. This could be directly used to assist selection  toward an improvement of grain width. These findings suggest OsSNB as useful for  further improvements in yield characteristics in most cultivars.","rice","農業生産性の向上は、植物科学研究の最も重要な目標の1つであり、急速に増加する人口のニーズを満たすために不可欠です。米（Oryza sativa L.）は、世界で最も重要な主食作物の1つです。穀物のサイズは、米の穀物収量の主要な決定要因であり、家畜化と人工繁殖の目標特性でもあります。ここでは、穀物の長さと穀物の幅のゲノム全体の関連研究が、270の米の系統で996,722のSNPマーカーを使用して実行されました。粒子長と粒子幅について、それぞれ5つと4つの定量的特性遺伝子座が特定されました。特に、新規の粒子サイズ遺伝子OsSNBがqGW7から同定され、さらなる結果は、OsSNBが粒子サイズを負に調節することを示した。最も注目すべきことに、CRISPR / Cas9テクノロジーによるノックアウト変異体植物は、粒子の長さ、幅、および重量の増加を示しましたが、OsSNBの過剰発現は反対の結果をもたらしました。広い地理的範囲からの168のイネ系統におけるプロモーターから3 '非翻訳領域へのこの遺伝子の配列決定により、8つのハプロタイプが同定された。さらに、Hap 3は、ジャポニカ亜種で発見された最大の粒幅を持っています。他のハプロタイプと比較して、Hap3はプロモーターに225bpの挿入があります。Hap 3と他のハプロタイプの違いに基づいて、OsSNB_Indel2は米粒幅を改善するための機能マーカーとして設計されました。これは、粒子幅の改善に向けた選択を支援するために直接使用できます。これらの発見は、OsSNBがほとんどの栽培品種の収量特性のさらなる改善に有用であることを示唆しています。"]
[201,31235564,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","CYTOKININ OXIDASE/DEHYDROGENASE 9 (OsCKX9)","Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America","Strigolactone promotes cytokinin degradation through transcriptional activation of CYTOKININ OXIDASE/DEHYDROGENASE 9 in rice.",2019,"116(28):14319-14324","[Duan J et al.]","Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China.",31235564,"10.1073/pnas.1810980116 ","Strigolactones (SLs), a group of terpenoid lactones derived from carotenoids, are plant hormones that control numerous aspects of plant development. Although the framework of SL signaling that the repressor DWARF 53 (D53) could be SL-dependently degraded via the SL receptor D14 and F-box protein D3 has been established, the downstream response genes to SLs remain to be elucidated. Here we show that the cytokinin (CK) content is dramatically increased in shoot bases  of the rice SL signaling mutant d53 By examining transcript levels of all the CK  metabolism-related genes after treatment with SL analog GR24, we identified CYTOKININ OXIDASE/DEHYDROGENASE 9 (OsCKX9) as a primary response gene significantly up-regulated within 1 h of treatment in the wild type but not in d53 We also found that OsCKX9 functions as a cytosolic and nuclear dual-localized CK catabolic enzyme, and that the overexpression of OsCKX9 suppresses the browning of d53 calli. Both the CRISPR/Cas9-generated OsCKX9 mutants and OsCKX9-overexpressing transgenic plants showed significant increases in tiller number and decreases in plant height and panicle size, suggesting that the homeostasis of OsCKX9 plays a critical role in regulating rice shoot architecture. Moreover, we identified the CK-inducible rice type-A response regulator OsRR5 as the secondary SL-responsive gene, whose expression is significantly repressed after 4 h of GR24 treatment in the wild type but not in osckx9 These findings reveal a comprehensive plant hormone cross-talk in which SL can induce the expression of OsCKX9 to down-regulate CK content, which in turn triggers the response of downstream genes.","rice","ストリゴラクトン（SL）は、カロテノイドに由来するテルペノイドラクトンのグループであり、植物の発達のさまざまな側面を制御する植物ホルモンです。リプレッサーDWARF53（D53）がSL受容体D14およびFボックスタンパク質D3を介してSL依存的に分解される可能性があるという、SLシグナル伝達のフレームワークは確立されていますが、SLに対する下流の応答遺伝子はまだ解明されていません。ここでは、シネSLシグナル伝達変異体d53のシュートベースでサイトキニン（CK）含有量が劇的に増加することを示します。SLアナログGR24で処理した後、すべてのCK代謝関連遺伝子の転写レベルを調べることにより、CYTOKININ OXIDASE / DEHYDROGENASE 9（ OsCKX9）は、野生型では治療後1時間以内に有意にアップレギュレートされますが、d53ではアップレギュレートされません。また、OsCKX9が細胞質および核の二重局在CK異化酵素として機能し、OsCKX9の過剰発現がd53カルスの褐変。CRISPR / Cas9で生成されたOsCKX9変異体とOsCKX9を過剰発現するトランスジェニック植物の両方が、分げつ数の有意な増加と草丈とパニクルサイズの減少を示し、OsCKX9のホメオスタシスがイネシュート構造の調節に重要な役割を果たしていることを示唆しています。さらに、CK誘導性イネA型応答レギュレーターOsRR5を二次SL応答遺伝子として同定しました。その発現は野生型では4時間のGR24処理後に有意に抑制されますが、osckx9では抑制されません。これらの発見は包括的な植物ホルモンクロスを明らかにします。 -SLがOsCKX9の発現を誘導してCK含有量をダウンレギュレートし、それが次に下流遺伝子の応答を誘発する可能性があるトーク。"]
[202,31713832,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","Orange gene (Osor)","Rice","A novel approach to carotenoid accumulation in rice callus by mimicking the cauliflower Orange mutation via genome editing.",2019,"12(1):81","[Endo A et al.]","Institute of Agrobiological Sciences, National Agriculture and Food Research Organization, Tsukuba, Ibaraki, Japan.",31713832,"10.1186/s12284-019-0345-3 ","BACKGROUND: beta-carotene (provitamin A) is an important target for biofortification of crops as a potential solution to the problem of vitamin A deficiency that is prevalent in developing countries. A previous report showed that dominant expression of splicing variants in the Orange (Or) gene causes beta-carotene accumulation in cauliflower curd. In this study, we focused on a putative orthologue of the cauliflower or gene in rice, Osor, and attempt to accumulate beta-carotene in rice callus by modification of the Osor gene via genome editing using CRISPR/Cas9. FINDINGS: CRISPR/Cas9 vectors for the Osor gene were constructed and transformed into rice calli. Some transformed calli showed orange color due to beta-carotene hyper-accumulation. Molecular analyses suggest  that orange-colored calli are due to an abundance of in-frame aberrant Osor transcripts, whereas out-of-frame mutations were not associated with orange color. CONCLUSIONS: We demonstrate that directed gene modification of the Osor gene via CRISPR/Cas9-mediated genome editing results in beta-carotene fortification in rice calli. To date, golden rice, which accumulates beta-carotene in rice endosperm, has been developed by conventional transgenic approaches. Our results suggest an alternative approach to enhancing beta-carotene accumulation in crops.","rice","背景：ベータカロチン（プロビタミンA）は、開発途上国で蔓延しているビタミンA欠乏症の問題に対する潜在的な解決策として、作物のバイオ強化の重要なターゲットです。以前の報告では、オレンジ（Or）遺伝子のスプライシングバリアントの優勢な発現が、カリフラワーカードにベータカロチンの蓄積を引き起こすことが示されていました。この研究では、イネのカリフラワーまたは遺伝子の推定オルソログであるOsorに焦点を当て、CRISPR / Cas9を使用したゲノム編集によるOsor遺伝子の改変によってイネのカルスにベータカロチンを蓄積することを試みました。調査結果：Osor遺伝子のCRISPR / Cas9ベクターが構築され、米カルスに変換されました。いくつかの形質転換されたカルスは、ベータカロチンの過剰蓄積のためにオレンジ色を示した。分子分析によると、オレンジ色のカルスは、フレーム内の異常なOsor転写産物が豊富にあるためであるのに対し、フレーム外の変異はオレンジ色とは関連していませんでした。結論：CRISPR / Cas9を介したゲノム編集を介したOsor遺伝子の指示された遺伝子修飾が、米カルスのベータカロチン強化をもたらすことを示しています。これまで、米内精子にベータカロチンを蓄積するゴールデンライスは、従来のトランスジェニックアプローチによって開発されてきました。私たちの結果は、作物におけるベータカロチンの蓄積を強化するための代替アプローチを示唆しています。"]
[203,31446506,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","Os8N3","Rice","CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of Os8N3 in rice to confer resistance to Xanthomonas oryzae pv. oryzae.",2019,"12(1):67","[Kim YA et al.]","Sejong University, Seoul, Korea.",31446506,"10.1186/s12284-019-0325-7 ","BACKGROUND: Genome editing tools are important for functional genomics research and biotechnology applications. Recently, the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein-9 (Cas9) system for  gene knockout has emerged as the most effective genome-editing tool. It has previously been reported that, in rice plants, knockdown of the Os8N3 gene resulted in enhanced resistance to Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), while displaying abnormal pollen development. RESULTS: The CRISPR/Cas9 system was employed to knockout rice Os8N3, in order to confer enhanced resistance to Xoo. Analysis of the genotypes and edited Os8N3 in T0, T1, T2, and T3 transgenic rice  plants showed that the mutations were transmitted to subsequent generations, and  homozygous mutants displayed significantly enhanced resistance to Xoo. Stable transmission of CRISPR/Cas9-mediated Os8N3 gene editing without the transferred DNA (T-DNA) was confirmed by segregation in the T1 generation. With respect to many investigated agronomic traits including pollen development, there was no significant difference between homozygous mutants and non-transgenic control plants under greenhouse growth conditions. CONCLUSION: Data from this study indicate that the CRISPR/Cas9-mediated Os8N3 edition can be successfully employed for non-transgenic crop improvements.","rice","背景：ゲノム編集ツールは、機能的ゲノミクス研究およびバイオテクノロジーアプリケーションにとって重要です。最近、遺伝子ノックアウトのためのクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質-9（Cas9）システムが、最も効果的なゲノム編集ツールとして登場しました。米植物では、Os8N3遺伝子のノックダウンがXanthomonas oryzaepvに対する耐性の増強をもたらしたことが以前に報告されています。oryzae（Xoo）、異常な花粉の発達を示している間。結果：Xooに対する耐性を強化するために、CRISPR / Cas9システムを使用して米Os8N3をノックアウトしました。T0、T1、T2、およびT3トランスジェニックイネ植物の遺伝子型と編集されたOs8N3の分析は、変異が次の世代に伝達され、ホモ接合変異体がXooに対する耐性の大幅な向上を示したことを示しました。転送されたDNA（T-DNA）なしでのCRISPR / Cas9を介したOs8N3遺伝子編集の安定した伝送は、T1世代の分離によって確認されました。花粉の発達を含む多くの調査された農業特性に関して、温室成長条件下でホモ接合変異体と非トランスジェニック対照植物との間に有意差はなかった。結論：この研究のデータは、CRISPR / Cas9を介したOs8N3エディションを非トランスジェニック作物の改良にうまく利用できることを示しています。"]
[204,31414258,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","digalactosyldiacylglycerol","Rice","OsDGD2beta is the Sole Digalactosyldiacylglycerol Synthase Gene Highly Expressed  in Anther, and its Mutation Confers Male Sterility in Rice.",2019,"12(1):66","[Basnet R et al.]","Zhejiang University, Hangzhou, Zhejiang, China.",31414258,"10.1186/s12284-019-0320-z ","BACKGROUND: Digalactosyldiacylglycerol (DGDG) is one of the major lipids found predominantly in the photosynthetic membrane of cyanobacteria, eukaryotic algae and higher plants. DGDG, along with MGDG (Monogalactosyldiacylglycerol), forms the matrix in thylakoid membrane of chloroplast, providing the site for photochemical and electron transport reactions of oxygenic photosynthesis. RESULTS: In silico analysis reveals that rice (Oryza sativa L.) genome has 5 genes encoding DGDG synthase, which are differentially expressed in different tissues, and OsDGD2beta was identified to be the sole DGDG synthase gene expressed in anther. We then developed osdgd2beta mutants by using the CRISPR/Cas9 system and elucidate its role, especially in the development of anther and pollen. The loss of function of OsDGD2beta resulted in male sterility  in rice characterized by pale yellow and shrunken anther, devoid of starch granules in pollen, and delayed degeneration of tapetal cells. The total fatty acid and DGDG content in the anther was reduced by 18.66% and 22.72% in osdgd2beta, affirming the importance of DGDG in the development of anther. The mutants had no notable differences in the vegetative phenotype, as corroborated by relative gene expression of DGDG synthase genes in leaves, chlorophyll measurements, and analysis of photosynthetic parameters, implying the specificity of OsDGD2beta in anther. CONCLUSION: Overall, we showed the importance of DGDG in pollen development and loss of function of OsDGD2beta results in male sterility.  Here, we have also proposed the use of OsDGD2beta in hybrid rice breeding using the nuclear male sterility system.","rice","背景：ジガラクトシルジアシルグリセロール（DGDG）は、主にシアノバクテリア、真核生物藻類、および高等植物の光合成膜に見られる主要な脂質の1つです。DGDGは、MGDG（モノガラクトシルジアシルグリセロール）とともに、葉緑体のチラコイド膜にマトリックスを形成し、酸素光合成の光化学的および電子輸送反応の部位を提供します。結果：インシリコ分析により、米（Oryza sativa L.）ゲノムにはDGDGシンターゼをコードする5つの遺伝子があり、これらは異なる組織で異なって発現し、OsDGD2betaは葯で発現する唯一のDGDGシンターゼ遺伝子であることが確認されました。次に、CRISPR / Cas9システムを使用してosdgd2beta変異体を開発し、特に葯と花粉の開発におけるその役割を解明しました。OsDGD2betaの機能の喪失は、淡黄色で葯が収縮し、花粉にデンプン粒がなく、タペタル細胞の変性が遅れることを特徴とする米の雄性不稔をもたらしました。葯の総脂肪酸とDGDG含有量はosdgd2betaで18.66％と22.72％減少し、葯の開発におけるDGDGの重要性を確認しました。葉におけるDGDGシンターゼ遺伝子の相対的な遺伝子発現、クロロフィル測定、および光合成パラメーターの分析によって裏付けられるように、変異体は栄養表現型に顕著な違いはなく、葯におけるOsDGD2betaの特異性を示唆している。結論：全体として、花粉の発達におけるDGDGの重要性と、OsDGD2betaの機能喪失が男性の不妊をもたらすことを示しました。ここでは、核雄性不稔システムを使用したハイブリッド米育種におけるOsDGD2betaの使用も提案しました。"]
[205,31321558,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","heterotrimeric G protein beta subunit (rgb1)","Rice","The heterotrimeric G protein beta subunit RGB1 is required for seedling formation in rice.",2019,"12(1):53","[Gao Y et al.]","Yangzhou University,  Yangzhou, China.",31321558,"10.1186/s12284-019-0313-y ","BACKGROUND: The heterotrimeric G protein beta subunit RGB1 plays an important role in plant growth and development. However, the molecular mechanisms underlying the regulation of rice growth by RGB1 remain elusive. RESULTS: Here, the rgb1 mutants rgb1-1 (+ 1 bp), rgb1-2 (- 1 bp), and rgb1-3 (- 11 bp) were isolated using the CRISPR/Cas9 system, and they were arrested at 1 day after germination and ultimately exhibited seedling lethality. The dynamic anatomical characteristics of the embryos of the rgb1 seedlings and WT during early postgermination and according to TUNEL assays showed that the suppressed growth of the rgb1 mutants was caused by cell death. In addition to the limited shoot and root development, the development of the embryo shoot-root axis was suppressed in the rgb1 mutants. RGB1 was expressed mainly in the root epidermal and vascular tissues of the embryo. Moreover, transcript profiling analysis revealed that the expression of a large number of auxin-, cytokinin-, and brassinosteroid-inducible genes was upregulated or downregulated in the rgb1 mutant compared to the wild type during seedling development. CONCLUSIONS: Overall, the rgb1 mutants provide an ideal material for exploring the molecular mechanism underlying rice seedling formation during early postgermination development by G proteins. SIGNIFICANCE STATEMENT: The heterotrimeric G protein beta subunit RGB1 acts as a crucial factor in promoting early postgermination seedling development in rice.","rice","背景：ヘテロ三量体Gタンパク質ベータサブユニットRGB1は、植物の成長と発達に重要な役割を果たします。ただし、RGB1によるイネの成長の調節の根底にある分子メカニズムはとらえどころのないままです。結果：ここでは、rgb1変異体rgb1-1（+ 1 bp）、rgb1-2（-1 bp）、およびrgb1-3（-11 bp）が、CRISPR / Cas9システムを使用して分離され、1日で逮捕されました。発芽後、最終的に実生の致死性を示した。発芽後早期およびTUNELアッセイによると、rgb1実生およびWTの胚の動的な解剖学的特徴は、rgb1変異体の抑制された成長が細胞死によって引き起こされたことを示した。限られたシュートと根の発達に加えて、胚のシュート-根軸の発達はrgb1変異体で抑制されました。RGB1は、主に胚の根の表皮および血管組織で発現していました。さらに、転写プロファイリング分析により、オーキシン、サイトカイニン、およびブラシノステロイド誘導性遺伝子の多数の発現が、苗の発育中に野生型と比較してrgb1変異体で上方制御または下方制御されることが明らかになりました。結論：全体として、rgb1変異体は、Gタンパク質による発芽後の初期発生中の米苗形成の根底にある分子メカニズムを調査するための理想的な材料を提供します。重要な声明：ヘテロ三量体Gタンパク質ベータサブユニットRGB1は、イネの発芽後の初期の実生の発育を促進する重要な要素として機能します。"]
[206,31073866,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","LOW SEED SETTING RATE1 (LSSR1)","Rice","LSSR1 facilitates seed setting rate by promoting fertilization in rice.",2019,"12(1):31","[Xiang X et al.]","China National Rice Research Institute, Hangzhou, China.",31073866,"10.1186/s12284-019-0280-3 ","Seed setting rate is one of the major components that determine rice (Oryza sativa L.) yield. Successful fertilization is necessary for normal seed setting.  However, little is known about the molecular mechanisms governing this process. In this study, we report a novel rice gene, LOW SEED SETTING RATE1 (LSSR1), which regulates the seed setting rate by facilitating rice fertilization. LSSR1 encodes a putative GH5 cellulase, which is highly conserved in plants. LSSR1 is predominantly expressed in anthers during the microsporogenesis stage, and its encoded protein contains a signal peptide at the N-terminal, which may be a secretory protein that stores in pollen grains and functions during rice fertilization. To explore the physiological function of LSSR1 in rice, loss-of-function mutants of LSSR1 were created through the CRISPR-Cas9 system, which showed a significant decrease in rice seed setting rate. However, the morphology of the vegetative and reproductive organs appears normal in lssr1 mutant lines. In addition, lssr1 pollen grains could be normally stained by I2-KI solution. Cytological results demonstrate that the blockage of fertilization mostly accounted for the low seed setting rate in lssr1 mutant lines, which was most likely caused by abnormal pollen grain germination, failed pollen tube penetration, and retarded pollen tube elongation. Together, our results suggest that LSSR1 plays an important role in rice fertilization, which in turn is vital  for maintaining rice seed setting rate.","rice","種子の定着率は、米（Oryza sativa L.）の収量を決定する主要な要素の1つです。通常の種子の設定には、受精を成功させる必要があります。ただし、このプロセスを支配する分子メカニズムについてはほとんど知られていません。本研究では、米の施肥を促進することにより種子の硬化速度を調節する新規の米遺伝子、低種子硬化速度1（LSSR1）を報告します。LSSR1は、植物で高度に保存されている推定GH5セルラーゼをエンコードします。LSSR1は主に小胞子形成期の葯で発現し、そのコードされたタンパク質はN末端にシグナルペプチドを含みます。これは花粉粒に貯蔵され、米の施肥中に機能する分泌タンパク質である可能性があります。米におけるLSSR1の生理学的機能を調査するために、LSSR1の機能喪失変異体がCRISPR-Cas9システムを介して作成され、米種子の定着率の有意な低下を示しました。ただし、栄養器官と生殖器官の形態は、lssr1変異株では正常に見えます。さらに、lssr1花粉粒は通常I2-KI溶液で染色できます。細胞学的結果は、施肥の遮断がlssr1変異株の低い種子硬化率の主な原因であり、これはおそらく異常な花粉粒発芽、花粉管浸透の失敗、および花粉管伸長の遅延によって引き起こされたことを示しています。総合すると、我々の結果は、LSSR1が米の施肥に重要な役割を果たしていることを示唆しており、これは米の種子の定着率を維持するために不可欠です。"]
[207,30725309,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","TRIANGULAR HULL1 (TH1)","Rice","Analysing the rice young panicle transcriptome reveals the gene regulatory network controlled by TRIANGULAR HULL1.",2019,"12(1):6","[Wang J et al.]","Guangxi University, Nanning, China.",30725309,"10.1186/s12284-019-0265-2 ","BACKGROUND: TRIANGULAR HULL1 (TH1), a member of the rice ALOG gene family, has been characterized as a rice lemma/palea-related gene. To understand the gene regulatory network that controlled by TH1, we analyzed the transcriptome from a TH1 knock out (KO) line, which was generated by CRISPR/Cas9. Our study may shed some light on the molecular mechanism of lemma/palea development. RESULTS: We obtained 20 T0 th1-C transgenic plants by CRISPR/Cas9. Among the 20 plants, there were eight bi-allelic mutations, five homozygous mutations, three heterozygous mutations, and four Non-KO plants. By comparing with the wild type and the heterozygous knock out (KO) line, the homozygous KO lines showed defects in lemma/palea development as well as in grain filling. Further more, we studied the gene regulatory network that controlled by TH1 by comparing the transcriptome of  a homozygous TH1 KO line with its Non-KO line as a control. A total of 622 genes  were identified as differentially expressed genes (DEGs), of which 297 genes were significantly up-regulated while 325 genes were down-regulated. One hundred thirty eight of the DEGs were assigned to the 59 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) pathways. Among these annotated DEGs, 15 genes were related to plant hormone signal transduction, eight genes were related to starch and sucrose metabolism. These were the two largest groups of DEGs according to the KEGG pathway analysis. CONCLUSIONS: Our results indicated that hormone related genes and starch/sucrose metabolism related genes might act as downstream targets of TH1; they might be responsible for lemma/palea development and grain filling respectively.","rice","背景：イネのALOG遺伝子ファミリーのメンバーであるTRIANGULAR HULL1（TH1）は、イネの穎/パレア関連遺伝子として特徴付けられています。TH1によって制御される遺伝子調節ネットワークを理解するために、CRISPR / Cas9によって生成されたTH1ノックアウト（KO）ラインからのトランスクリプトームを分析しました。私たちの研究は、レンマ/パレア発達の分子メカニズムにいくらかの光を当てるかもしれません。結果：CRISPR / Cas9によって20のT0th1-Cトランスジェニック植物を取得しました。20の植物の中で、8つのバイアレリック変異、5つのホモ接合変異、3つのヘテロ接合変異、および4つの非KO植物がありました。野生型およびヘテロ接合型ノックアウト（KO）系統と比較することにより、ホモ接合型KO系統は、レンマ/パレアの発達および粒子の充填に欠陥を示しました。さらに、ホモ接合型TH1 KO系統のトランスクリプトームを対照としての非KO系統と比較することにより、TH1によって制御される遺伝子調節ネットワークを研究しました。合計622個の遺伝子が差次的発現遺伝子（DEG）として同定され、そのうち297個の遺伝子が有意にアップレギュレートされ、325個の遺伝子がダウンレギュレートされました。138のDEGは、59のKEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）経路に割り当てられました。これらの注釈付きDEGのうち、15個の遺伝子が植物ホルモンのシグナル伝達に関連し、8個の遺伝子がデンプンとスクロースの代謝に関連していました。これらは、KEGG経路分析によるとDEGの2つの最大のグループでした。結論：私たちの結果は、ホルモン関連遺伝子とデンプン/ショ糖代謝関連遺伝子がTH1の下流標的として作用する可能性があることを示しました。彼らはそれぞれ穎/穎の発達と穀物の充填に責任があるかもしれません。"]
[208,30706248,"plant","rice","CRISPR;","qPE9-1","Rice","Evaluation of differential qPE9-1/DEP1 protein domains in rice grain length and weight variation.",2019,"12(1):5","[Li X et al.]","Yangzhou University, Yangzhou, China.",30706248,"10.1186/s12284-019-0263-4 ","BACKGROUND: qPE9-1/DEP1, encoding a G protein gamma subunit, has multiple effects on plant architecture, grain size, and yield in rice. The qPE9-1 protein contains an N-terminal G gamma-like (GGL) domain, a putative transmembrane domain, and a C-terminal cysteine-rich domain. However, the roles of each domain remain unclear. RESULTS: In the present study, we focused on the genetic effects of different domains of qPE9-1 in the regulation of grain length and weight. We generated a series of transgenic plants expressing different truncated qPE9-1 proteins through constitutive expression and clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 strategies. Phenotypic analysis indicated that the complete or long-tailed qPE9-1 contributed to the elongation of grains, while the GGL domain alone and short-tailed qPE9-1 led to short grains. The long C-terminus of qPE9-1 including two or three C-terminal von Willebrand factor type C domains effectively repressed the negative effects of the GGL domain on grain length and weight. qPE9-1-overexpressing lines in a Wuxianggeng 9 (carrying a qpe9-1 allele) background showed increased grain yield  per plant, but lodging occurred in some years. CONCLUSIONS: Manipulation of the C-terminal length of qPE9-1 through genetic engineering can be used to generate varieties with various grain lengths and weights according to different requirements in rice breeding. The genetic effects of qPE9-1/qpe9-1 are multidimensional, and breeders should take into account other factors including genetic backgrounds and planting conditions in the use of qPE9-1/qpe9-1.","rice","背景：Gタンパク質ガンマサブユニットをコードするqPE9-1 / DEP1は、植物の構造、粒子サイズ、および米の収量に複数の影響を及ぼします。qPE9-1タンパク質には、N末端のGガンマ様（GGL）ドメイン、推定の膜貫通ドメイン、およびC末端のシステインリッチドメインが含まれています。ただし、各ドメインの役割は不明なままです。結果：本研究では、粒子の長さと重量の調節におけるqPE9-1のさまざまなドメインの遺伝的影響に焦点を当てました。構成的発現とクラスター化された規則的に間隔を空けたパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9戦略を通じて異なるトランケートされたqPE9-1タンパク質を発現する一連のトランスジェニック植物を生成しました。表現型分析は、完全またはロングテールのqPE9-1が粒子の伸長に寄与し、GGLドメインのみおよびショートテールのqPE9-1が短い粒子をもたらすことを示しました。2つまたは3つのC末端フォンウィルブランド因子タイプCドメインを含むqPE9-1の長いC末端は、粒子の長さと重量に対するGGLドメインの悪影響を効果的に抑制しました。QPE9-1-Wuxianggeng 9（qpe9-1対立遺伝子を運ぶ）バックグラウンドで過剰発現する系統は、植物あたりの穀物収量の増加を示しましたが、倒伏は数年で発生しました。結論：遺伝子工学によるqPE9-1のC末端の長さの操作は、米の育種におけるさまざまな要件に応じて、さまざまな粒子の長さと重量を持つ品種を生成するために使用できます。qPE9-1 / qpe9-1の遺伝的影響は多次元的であり、育種家はqPE9-1 / qpe9-1の使用において遺伝的背景や植栽条件を含む他の要因を考慮に入れる必要があります。"]
[209,31882637,"plant","rice","agroinfiltration;CRISPR;"," ","Scientific reports","High-frequency random DNA insertions upon co-delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein and selectable marker plasmid in rice.",2019,"9(1):19902","[Banakar R et al.]","Iowa State University, Ames, IA, USA.",31882637,"10.1038/s41598-019-55681-y ","An important advantage of delivering CRISPR reagents into cells as a ribonucleoprotein (RNP) complex is the ability to edit genes without reagents being integrated into the genome. Transient presence of RNP molecules in cells can reduce undesirable off-target effects. One method for RNP delivery into plant cells is the use of a biolistic gun. To facilitate selection of transformed cells during RNP delivery, a plasmid carrying a selectable marker gene can be co-delivered with the RNP to enrich for transformed/edited cells. In this work, we compare targeted mutagenesis in rice using three different delivery platforms: biolistic RNP/DNA co-delivery; biolistic DNA delivery; and Agrobacterium-mediated delivery. All three platforms were successful in generating desired mutations at  the target sites. However, we observed a high frequency (over 14%) of random plasmid or chromosomal DNA fragment insertion at the target sites in transgenic events generated from both biolistic delivery platforms. In contrast, integration of random DNA fragments was not observed in transgenic events generated from the  Agrobacterium-mediated method. These data reveal important insights that must be  considered when selecting the method for genome-editing reagent delivery in plants, and emphasize the importance of employing appropriate molecular screening methods to detect unintended alterations following genome engineering.","rice","CRISPR試薬をリボヌクレオプロテイン（RNP）複合体として細胞に送達することの重要な利点は、試薬をゲノムに組み込むことなく遺伝子を編集できることです。細胞内にRNP分子が一時的に存在すると、望ましくないオフターゲット効果を減らすことができます。植物細胞へのRNP送達の1つの方法は、バイオリスティックガンの使用です。RNP送達中の形質転換細胞の選択を容易にするために、選択可能なマーカー遺伝子を保持するプラスミドをRNPと同時送達して、形質転換/編集された細胞を濃縮することができます。この作業では、3つの異なる配信プラットフォームを使用して米の標的突然変異誘発を比較します。バイオリスティックRNP / DNA同時配信。微粒子銃によるDNA送達; およびアグロバクテリウムを介した送達。3つのプラットフォームはすべて、ターゲットサイトで目的の変異を生成することに成功しました。ただし、両方のバイオリスティック配信プラットフォームから生成されたトランスジェニックイベントのターゲットサイトで、ランダムなプラスミドまたは染色体DNAフラグメントの挿入が高頻度（14％以上）であることが観察されました。対照的に、ランダムDNAフラグメントの統合は、Agrobacteriumを介した方法から生成されたトランスジェニックイベントでは観察されませんでした。これらのデータは、植物におけるゲノム編集試薬の送達方法を選択する際に考慮しなければならない重要な洞察を明らかにし、ゲノム工学後の意図しない変化を検出するために適切な分子スクリーニング法を採用することの重要性を強調しています。"]
[210,30887096,"plant","rice","CRISPR;Cas9;","10 heading time genes","TAG. Theoretical and applied genetics. Theoretische und angewandte Genetik","Assessment of the effect of ten heading time genes on reproductive transition and yield components in rice using a CRISPR/Cas9 system.",2019,"132(6):1887-1896","[Cui Y et al.]","Shenyang Agricultural University, Shenyang, China.",30887096,"10.1007/s00122-019-03324-1 ","KEY MESSAGE: We demonstrated the effect of heading time genes on reproductive transition and yield components under an identical genetic background using CRISPR/Cas9 gene-editing technology, and we propose that the elite allele will provide a new breeding strategy for rice breeding in high-latitude regions. Heading date is a factor closely associated with grain yield in rice (Oryza sativa L). In recent decades, a number of genes responsible for heading time have been identified, the variation of which contributes to the expansion of the rice  cultivation area. However, it is difficult to compare the phenotypic effects of these genes due to the different genetic backgrounds. In this study, we generated 14 heading time mutants using CRISPR/Cas9 gene-editing technology and marker-assisted selection with a japonica Sasanishiki wild-type (WT) genetic background. Photoperiod sensitivity, the relationship between days to heading (DTH), and yield components of mutants were investigated. We found that the yield increases with increases in DTH, but eventually plateaus at maximum and then began to decrease, whereas the biomass continued to increase. The mutants exerted distinctly different effects on DTH and yield components. The convergent double mutants had severe yield reduction compared with single mutants, even with a DTH  that was similar to that of single mutants. We also found that an elite mutant of se14 achieved a yield equal to that of the WT, but with heading occurring 10 days earlier. A sequence analysis of 72 cultivars collected from the japonica cultivated zone shows that elite se14 mutants have not been applied to rice breeding. Our study demonstrates the effect of heading time genes on reproductive transition and yield components under an identical genetic background. These results may provide new insights into rice breeding using heading time mutants.","rice","重要なメッセージ：CRISPR / Cas9遺伝子編集技術を使用して、同一の遺伝的背景の下で生殖遷移と収量構成要素に対する出穂時間遺伝子の影響を実証し、エリート対立遺伝子が高緯度でのイネ育種のための新しい育種戦略を提供することを提案します。緯度地域。出穂日は、米（Oryza sativa L）の穀物収量と密接に関連する要因です。ここ数十年で、出穂時間の原因となる多くの遺伝子が特定されており、その変化が稲作地域の拡大に貢献しています。ただし、遺伝的背景が異なるため、これらの遺伝子の表現型の影響を比較することは困難です。この研究では、CRISPR / Cas9遺伝子編集技術と、japonica Sasanishiki野生型（WT）遺伝的背景を持つマーカー支援選択を使用して、14のヘディングタイム変異体を生成しました。光周期感度、出穂までの日数（DTH）の関係、および変異体の収量成分を調査した。収量はDTHの増加とともに増加するが、最終的には最大でプラトーになり、その後減少し始めたが、バイオマスは増加し続けた。変異体は、DTHおよび収量成分に対して明らかに異なる効果を発揮しました。収束二重変異体は、単一変異体と同様のDTHを使用しても、単一変異体と比較して大幅な収量の低下が見られました。また、se14のエリート変異体は、WTと同等の収量を達成しましたが、ヘディングは10日前に発生しました。ジャポニカ栽培区から収集された72品種の配列分析は、エリートse14変異体がイネ育種に適用されていないことを示しています。私たちの研究は、同一の遺伝的背景の下での生殖遷移と収量構成要素に対するヘッディング時間遺伝子の影響を示しています。これらの結果は、出穂時間変異体を使用したイネ育種への新しい洞察を提供する可能性があります。"]
[211,31836812,"plant","rice (Kasalath; TeTePu)","CRISPR;Cas9;","Semi-Dwarf1","Scientific reports","Using CRISPR-Cas9 to generate semi-dwarf rice lines in elite landraces.",2019,"9(1):19096","[Hu X  et al.]","China National Rice Research Institute, Hangzhou, China.",31836812,"10.1038/s41598-019-55757-9 ","Genetic erosion refers to the loss of genetic variation in a crop. In China, only a few original landraces of rice (Oryza sativa) were used in breeding and these became the primary genetic background of modern varieties. Expanding the genetic  diversity among Chinese rice varieties and cultivating high-yielding and high-quality varieties with resistance to different biotic and abiotic stresses is critical. Here, we used the clustered regularly interspaced short palindromic  repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein9(Cas9) genome editing system to edit Semi-Dwarf1 (SD1) in the elite landraces Kasalath and TeTePu (TTP), which contain many desired agronomic traits such as tolerance to low phosphorous and broad-spectrum resistance to several diseases and insects. Mutations of SD1 confer shorter plant height for better resistance to lodging. Field trials demonstrated that the yield of the new Kasalath and TTP mutant lines was better than that of the wild type under modern cultivation and that the lines maintained the same desirable agronomic characteristics as their wild-type progenitors. Our  results showed that breeding using available landraces in combination with genomic data of different landraces and gene-editing techniques is an effective way to relieve genetic erosion in modern rice varieties.","rice","遺伝的侵食とは、作物の遺伝的変異が失われることを指します。中国では、イネ（Oryza sativa）のいくつかの元の在来種のみが育種に使用され、これらは現代の品種の主要な遺伝的背景になりました。中国の米品種間の遺伝的多様性を拡大し、さまざまな生物的および非生物的ストレスに耐性のある高収量で高品質の品種を栽培することが重要です。ここでは、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9（Cas9）ゲノム編集システムを使用して、エリートランドレースKasalathおよびTeTePu（TTP）のSemi-Dwarf1（SD1）を編集しました。低リン耐性やいくつかの病気や昆虫に対する広域耐性など。SD1の突然変異は、倒伏に対するより良い抵抗のために、より短い草丈を与えます。実地試験では、新しいKasalathおよびTTP変異株の収量は、現代の栽培下で野生型の収量よりも優れており、それらの系統は野生型の前駆細胞と同じ望ましい農業特性を維持していることが示されました。私たちの結果は、利用可能なランドレースをさまざまなランドレースのゲノムデータおよび遺伝子編集技術と組み合わせて使用​​する育種が、現代の米品種の遺伝的侵食を緩和する効果的な方法であることを示しました。"]
[212,31036069,"plant","rice (Oryza  sativa)","CRISPR;","SF3B1","Genome biology","CRISPR directed evolution of the spliceosome for resistance to splicing inhibitors.",2019,"20(1):73","[Butt H et al.]","King Abdullah University of Science and Technology (KAUST), Thuwal, Saudi Arabia.",31036069,"10.1186/s13059-019-1680-9 ","Increasing genetic diversity via directed evolution holds great promise to accelerate trait development and crop improvement. We developed a CRISPR/Cas-based directed evolution platform in plants to evolve the rice (Oryza  sativa) SF3B1 spliceosomal protein for resistance to splicing inhibitors. SF3B1 mutant variants, termed SF3B1-GEX1A-Resistant (SGR), confer variable levels of resistance to splicing inhibitors. Studies of the structural basis of the splicing inhibitor binding to SGRs corroborate the resistance phenotype. This directed evolution platform can be used to interrogate and evolve the molecular functions of key biomolecules and to engineer crop traits for improved performance and adaptation under climate change conditions.","rice","方向性のある進化を介して遺伝的多様性を高めることは、形質の発達と作物の改善を加速する大きな可能性を秘めています。イネ（Oryza sativa）SF3B1スプライスソームタンパク質をスプライシング阻害剤に対する耐性のために進化させるために、植物でCRISPR / Casベースの定向進化プラットフォームを開発しました。SF3B1-GEX1A-Resistant（SGR）と呼ばれるSF3B1変異体変異体は、スプライシング阻害剤に対してさまざまなレベルの耐性を付与します。SGRに結合するスプライシング阻害剤の構造的基礎の研究は、耐性表現型を裏付けています。この定向進化プラットフォームは、主要な生体分子の分子機能を調査および進化させ、気候変動条件下でのパフォーマンスと適応を改善するために作物の特性を設計するために使用できます。"]
[213,31656725,"plant","rice (semi-dwarf)","CRISPR;Cas9;","OsGA20ox2","3 Biotech","Generation of semi-dwarf rice (Oryza sativa L.) lines by CRISPR/Cas9-directed mutagenesis of OsGA20ox2 and proteomic analysis of unveiled changes caused by mutations.",2019,"9(11):387","[Han Y et al.]","Guangxi University, Nanning, China.",31656725,"10.1007/s13205-019-1919-x ","Plant height (PH) is one of the most important agronomic traits of rice, as it directly affects the yield potential and lodging resistance. Here, semi-dwarf mutant lines were developed through CRISPR/Cas9-based editing of OsGA20ox2 in an  indica rice cultivar. Total 24 independent lines were obtained in T0 generation with the mean mutation rate of 73.5% including biallelic (29.16%), homozygous (47.91%) and heterozygous (16.66%) mutations, and 16 T-DNA-free lines (50%) were  obtained in T1 generation without off-target effect in four most likely sites. Mutations resulted in a changed amino acid sequence of mutant plants and reduced  gibberellins (GA) level and PH (22.2%), flag leaf length (FLL) and increased yield per plant (YPP) (6.0%), while there was no effect on other agronomic traits. Mutants restored their PH to normal by exogenous GA3 treatment. The expression of the OsGA20ox2 gene was significantly suppressed in mutant plants, while the expression level was not affected for other GA biosynthesis (OsGA2ox3 and OsGA3ox2) and signaling (D1, GIDI and SLR1) genes. The mutant lines showed decreased cell length and width, abnormal cell elongation, while increased cell numbers in the second internode sections at mature stage. Total 30 protein spots  were exercised, and 24 proteins were identified, and results showed that OsGA20ox2 editing altered protein expression. Five proteins including, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, putative ATP synthase, fructose-bisphosphate aldolase 1, S-adenosyl methionine synthetase 1 and gibberellin 20 oxidase 2, were downregulated in dwarf mutant lines which may affect the plant growth. Collectively, our results provide the insights into the  role of OsGA20ox2 in PH and confirmed that CRISPR-Cas9 is a powerful tool to understand the gene functions.","rice","草丈（PH）は、収量の可能性と耐倒伏性に直接影響するため、イネの最も重要な農業形質の1つです。ここでは、半矮性突然変異系統は、インディカ米栽培品種におけるOsGA20ox2のCRISPR / Cas9ベースの編集を通じて開発されました。合計24の独立した系統がT0世代で得られ、平均変異率は73.5％で、2対立遺伝子（29.16％）、ホモ接合（47.91％）、ヘテロ接合（16.66％）の変異を含み、16のT-DNAフリー系統（50％）は4つの最も可能性の高いサイトでオフターゲット効果なしでT1世代で得られました。突然変異により、突然変異植物のアミノ酸配列が変化し、ジベレリン（GA）レベルとPH（22.2％）、旗葉長（FLL）が減少し、植物あたりの収量（YPP）が増加しました（6.0％）が、影響はありませんでした。他の農業特性。変異体は、外因性GA3処理によってPHを正常に戻しました。OsGA20ox2遺伝子の発現は変異植物で有意に抑制されましたが、発現レベルは他のGA生合成（OsGA2ox3およびOsGA3ox2）およびシグナル伝達（D1、GIDIおよびSLR1）遺伝子では影響を受けませんでした。変異株は、成熟段階で第2節間切片の細胞数が増加する一方で、細胞の長さと幅の減少、異常な細胞伸長を示した。合計30のタンパク質スポットが行使され、24のタンパク質が同定され、結果はOsGA20ox2編集がタンパク質発現を変化させたことを示しました。グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、推定ATPシンターゼ、フルクトース-ビスリン酸アルドラーゼ1、S-アデノシルメチオニンシンテターゼ1およびジベレリン20オキシダーゼ2を含む5つのタンパク質が、植物の成長に影響を与える可能性のある矮性変異株でダウンレギュレートされました。まとめると、私たちの結果は、PHにおけるOsGA20ox2の役割への洞察を提供し、CRISPR-Cas9が遺伝子機能を理解するための強力なツールであることを確認しました。"]
[214,31823718,"plant","rice (Taichung 65)","CRISPR;Cas9;","U-box domain-containing protein 73 (OsPUB73)","BMC plant biology","Cytological and transcriptome analyses reveal OsPUB73 defect affects the gene expression associated with tapetum or pollen exine abnormality in rice.",2019,"19(1):546","[Chen L et al.]","South China Agricultural University, Guangzhou, China.",31823718,"10.1186/s12870-019-2175-2 ","BACKGROUND: As one of the main crops in the world, sterility of rice (Oryza sativa L.) significantly affects the production and leads to yield decrease. Our  previous research showed that OsPUB73, which encodes U-box domain-containing protein 73, may be associated with male sterility. However, little information is available on this gene that is required for anther development. In the present study, we knocked out OsPUB73 by using the CRISPR/Cas9 system and studied the cytological and transcriptome of the gene-defect associated with pollen development and sterility in the rice variety (Taichung 65). RESULTS: The sequence analysis indicated that OsPUB73 was comprised of 3 exons and 2 introns,  of which CDS encoded 586 amino acids including a U-box domain. The expression pattern of OsPUB73 showed that it was highly expressed in the anther during meiosis stage. The ospub73 displayed low pollen fertility (19.45%), which was significantly lower than wild type (WT) (85.37%). Cytological observation showed  tapetum vacuolated at the meiosis stage and pollen exine was abnormal at the bi-cellular pollen stage of ospub73. RNA-seq analysis detected 2240 down and 571  up-regulated genes in anther of ospub73 compared with WT during meiosis stage. Among of 2240 down-regulated genes, seven known genes were associated with tapetal cell death or pollen exine development, including CYP703A3 (Cytochrome P450 Hydroxylase703A3), CYP704B2 (Cytochrome P450 Hydroxylase704B2), DPW (Defective Pollen Wall), PTC1 (Persistant Tapetal Cell1), UDT1 (Undeveloped Tapetum1), OsAP37 (Aspartic protease37) and OsABCG15 (ATP binding cassette G15),  which were validated by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). These results suggested OsPUB73 may play an important role in tapetal  or pollen exine development and resulted in pollen partial sterility. CONCLUSION: Our results revealed that OsPUB73 plays an important role in rice male reproductive development, which provides valuable information about the molecular mechanisms of the U-box in rice male reproductive development.","rice","背景：世界の主要作物の1つとして、米（Oryza sativa L.）の不妊は生産に大きく影響し、収量の減少につながります。私たちの以前の研究は、Uボックスドメイン含有タンパク質73をコードするOsPUB73が男性の不妊症に関連している可能性があることを示しました。しかし、葯の発達に必要なこの遺伝子に関する情報はほとんどありません。本研究では、CRISPR / Cas9システムを使用してOsPUB73をノックアウトし、米品種の花粉の発達と不妊に関連する遺伝子欠損の細胞学的および転写産物を研究しました（Taichung65）。結果：シーケンス分析は、OsPUB73が3つのエキソンと2つのイントロンで構成され、そのうちCDSがUボックスドメインを含む586のアミノ酸をコードしていることを示しました。OsPUB73の発現パターンは、減数分裂期の葯で高度に発現していることを示した。ospub73は低い花粉稔性（19.45％）を示し、これは野生型（WT）（85.37％）よりも有意に低かった。細胞学的観察は、減数分裂段階でタペタムが空胞化し、ospub73の二細胞花粉段階で花粉外皮が異常であることを示した。RNA-seq分析では、減数分裂段階でWTと比較してospub73の葯で2240個のダウンレギュレートされた遺伝子と571個のアップレギュレートされた遺伝子が検出されました。2240のダウンレギュレートされた遺伝子のうち、CYP703A3（Cytochrome P450 Hydroxylase703A3）、CYP704B2（Cytochrome P450 Hydroxylase704B2）、DPW（Defective Pollen Wall）、PTC1（Persistent Tapetal Cell1）を含む7つの既知の遺伝子がタペタル細胞死または花粉外皮の発達に関連していました。 、UDT1（未開発のTapetum1）、OsAP37（アスパラギン酸プロテアーゼ37）、およびOsABCG15（ATP結合カセットG15）。これらは定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）によって検証されました。これらの結果は、OsPUB73がタペタルまたは花粉の外皮の発達に重要な役割を果たし、花粉の部分的な不稔をもたらす可能性があることを示唆しています。結論：私たちの結果は、OsPUB73がイネの雄の生殖発達において重要な役割を果たしていることを明らかにしました。これは、イネの雄の生殖発達におけるUボックスの分子メカニズムに関する貴重な情報を提供します。"]
[215,31088537,"plant","rice; Arabidopsis","ZFN;","marker genes","BMC research notes","Utility of I-SceI and CCR5-ZFN nucleases in excising selectable marker genes from transgenic plants.",2019,"12(1):272","[Pathak BP et al.]","University of Arkansas, Fayetteville, AR, USA.",31088537,"10.1186/s13104-019-4304-2 ","OBJECTIVES: Removal of selection marker genes from transgenic plants is highly desirable for their regulatory approval and public acceptance. This study evaluated the use of two nucleases, the yeast homing endonuclease, I-SceI, and the designed zinc finger nuclease, CCR5-ZFN, in excising marker genes from plants using rice and Arabidopsis as the models. RESULTS: In an in vitro culture assay,  both nucleases were effective in precisely excising the DNA fragments marked by the nuclease target sites. However, rice cultures were found to be refractory to  transformation with the I-SceI and CCR5-ZFN overexpressing constructs. The inducible I-SceI expression was also problematic in rice as the progeny of the transgenic lines expressing the heat-inducible I-SceI did not inherit the functional gene. On the other hand, heat-inducible I-SceI expression in Arabidopsis was effective in creating somatic excisions in transgenic plants but  ineffective in generating heritable excisions. The inducible expression of CCR5-ZFN in rice, although transmitted stably to the progeny, appeared ineffective in creating detectable excisions. Therefore, toxicity of these nucleases in plant cells poses major bottleneck in their application in plant biotechnology, which could be avoided by expressing them transiently in cultures  in vitro.","rice; Arabidopsis","目的：トランスジェニック植物からの選択マーカー遺伝子の除去は、それらの規制当局の承認と一般の受け入れのために非常に望ましい。この研究では、米とアラビドプシスをモデルとして植物からマーカー遺伝子を切除する際に、2つのヌクレアーゼ、酵母ホーミングエンドヌクレアーゼI-SceIと設計された亜鉛フィンガーヌクレアーゼCCR5-ZFNの使用を評価しました。結果：in vitro培養アッセイでは、両方のヌクレアーゼが、ヌクレアーゼ標的部位によってマークされたDNAフラグメントを正確に切除するのに効果的でした。しかし、イネの培養物は、I-SceIおよびCCR5-ZFNを過剰発現するコンストラクトによる形質転換に抵抗性であることがわかりました。熱誘導性I-SceIを発現するトランスジェニック系統の子孫は機能遺伝子を受け継いでいないため、誘導性I-SceI発現はイネでも問題があった。一方、シロイヌナズナの熱誘導性I-SceI発現は、トランスジェニック植物の体細胞切除の作成には効果的でしたが、遺伝性切除の生成には効果がありませんでした。米におけるCCR5-ZFNの誘導性発現は、子孫に安定して伝達されますが、検出可能な切除の作成には効果がないように見えました。したがって、植物細胞におけるこれらのヌクレアーゼの毒性は、植物バイオテクノロジーにおけるそれらの適用において主要なボトルネックを引き起こし、これは、インビトロでの培養においてそれらを一時的に発現させることによって回避することができる。"]
[216,31821678,"plant","rice; Arabidopsis","CRISPR;Cas9;TALENs;","five different mature miRNA sequences; miR160*","Plant biotechnology journal","Disruption of miRNA sequences by TALENs and CRISPR/Cas9 induces varied lengths of miRNA production.",2019,null,"[Bi H  et al.]","Iowa State University, Ames, IA, USA.",31821678,"10.1111/pbi.13315 ","MicroRNAs (miRNAs) are 20-24 nucleotides (nt) small RNAs functioning in eukaryotes. The length and sequence of miRNAs are not only related to the biogenesis of miRNAs but are also important for downstream physiological processes like ta-siRNA production. To investigate these roles, it is informative to create small mutations within mature miRNA sequences. We used both TALENs (transcription activator-like effector nucleases) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) to introduce heritable base pair mutations in mature miRNA sequences. For rice, TALEN constructs were built targeting five different mature miRNA sequences and yielding heritable mutations. Among the resulting mutants, mir390 mutant showed a severe defect in the shoot apical meristem (SAM), a shootless phenotype, which could be rescued by the wild-type MIR390. Small RNA sequencing showed the two base pair deletion in mir390 substantially interfered with miR390 biogenesis. In  Arabidopsis, CRISPR/Cas9-mediated editing of the miR160* strand confirmed that the asymmetric structure of miRNA is not a necessary determinant for secondary siRNA production. CRISPR/Cas9 with double-guide RNAs successfully generated mir160a null mutants with fragment deletions, at a higher efficiency than a single-guide RNA. The difference between the phenotypic severity of miR160a mutants in Col-0 versus Ler backgrounds highlights a diverged role for miR160a in different ecotypes. Overall, we demonstrated that TALENs and CRISPR/Cas9 are both effective in modifying miRNA precursor structure, disrupting miRNA processing and generating miRNA null mutant plants.","rice; Arabidopsis","マイクロRNA（miRNA）は、真核生物で機能する20〜24ヌクレオチド（nt）の小さなRNAです。miRNAの長さと配列は、miRNAの生合成に関連しているだけでなく、ta-siRNA生成などの下流の生理学的プロセスにとっても重要です。これらの役割を調査するには、成熟したmiRNA配列内に小さな変異を作成することが有益です。TALEN（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）とクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9（Cas9）の両方を使用して、成熟したmiRNA配列に遺伝性の塩基対変異を導入しました。米の場合、TALENコンストラクトは5つの異なる成熟miRNA配列をターゲットにして構築され、遺伝性の変異をもたらします。得られた変異体の中で、mir390変異体は、野生型MIR390によって救済される可能性のある、シュートのない表現型である茎頂メリステム（SAM）に深刻な欠陥を示しました。small RNAシーケンスは、mir390の2塩基ペアの削除がmiR390の生合成を実質的に妨害することを示しました。アラビドプシスでは、CRISPR / Cas9を介したmiR160 *鎖の編集により、miRNAの非対称構造が二次siRNA生成に必要な決定要因ではないことが確認されました。ダブルガイドRNAを使用したCRISPR / Cas9は、シングルガイドRNAよりも高い効率でフラグメントが削除されたmir160anull変異体を生成することに成功しました。Col-0とLerのバックグラウンドにおけるmiR160a変異体の表現型の重症度の違いは、異なるエコタイプにおけるmiR160aの役割の相違を浮き彫りにします。全体として、TALENとCRISPR / Cas9の両方が、miRNA前駆体構造の変更、miRNA処理の中断、およびmiRNAnull変異体植物の生成に効果的であることを示しました。"]
[217,30704461,"plant","rice; maize; Arabidopsis","CRISPR;Cpf1;"," ","BMC biology","Application of CRISPR-Cas12a temperature sensitivity for improved genome editing  in rice, maize, and Arabidopsis.",2019,"17(1):9","[Malzahn AA et al.]","University of Electronic Science and Technology of China,  Chengdu, China.",30704461,"10.1186/s12915-019-0629-5 ","BACKGROUND: CRISPR-Cas12a (formerly Cpf1) is an RNA-guided endonuclease with distinct features that have expanded genome editing capabilities. Cas12a-mediated genome editing is temperature sensitive in plants, but a lack of a comprehensive  understanding on Cas12a temperature sensitivity in plant cells has hampered effective application of Cas12a nucleases in plant genome editing. RESULTS: We compared AsCas12a, FnCas12a, and LbCas12a for their editing efficiencies and non-homologous end joining (NHEJ) repair profiles at four different temperatures  in rice. We found that AsCas12a is more sensitive to temperature and that it requires a temperature of over 28 degrees C for high activity. Each Cas12a nuclease exhibited distinct indel mutation profiles which were not affected by temperatures. For the first time, we successfully applied AsCas12a for generating rice mutants with high frequencies up to 93% among T0 lines. We next pursued editing in the dicot model plant Arabidopsis, for which Cas12a-based genome editing has not been previously demonstrated. While LbCas12a barely showed any editing activity at 22 degrees C, its editing activity was rescued by growing the transgenic plants at 29 degrees C. With an early high-temperature treatment regime, we successfully achieved germline editing at the two target genes, GL2 and TT4, in Arabidopsis transgenic lines. We then used high-temperature treatment to improve Cas12a-mediated genome editing in maize. By growing LbCas12a T0 maize  lines at 28 degrees C, we obtained Cas12a-edited mutants at frequencies up to 100% in the T1 generation. Finally, we demonstrated DNA binding of Cas12a was not abolished at lower temperatures by using a dCas12a-SRDX-based transcriptional repression system in Arabidopsis. CONCLUSION: Our study demonstrates the use of high-temperature regimes to achieve high editing efficiencies with Cas12a systems in rice, Arabidopsis, and maize and sheds light on the mechanism of temperature sensitivity for Cas12a in plants.","rice; maize; Arabidopsis","背景：CRISPR-Cas12a（以前のCpf1）は、ゲノム編集機能が拡張された独自の機能を備えたRNAガイドエンドヌクレアーゼです。Cas12aを介したゲノム編集は植物の温度感受性ですが、植物細胞のCas12a温度感受性に関する包括的な理解が不足しているため、植物ゲノム編集におけるCas12aヌクレアーゼの効果的な適用が妨げられています。結果：AsCas12a、FnCas12a、およびLbCas12aの編集効率と、イネの4つの異なる温度での非相同末端結合（NHEJ）修復プロファイルを比較しました。AsCas12aは温度に対してより敏感であり、高活性には28℃以上の温度が必要であることがわかりました。各Cas12aヌクレアーゼは、温度の影響を受けない別個のインデル変異プロファイルを示しました。初めて、AsCas12aを適用して、T0系統の中で最大93％の高頻度の米変異体を生成することに成功しました。次に、Cas12aベースのゲノム編集がこれまで実証されていないディコットモデル植物Arabidopsisで編集を追求しました。LbCas12aは22℃で編集活性をほとんど示さなかったが、その編集活性は29℃でトランスジェニック植物を成長させることによって救われた。初期の高温処理レジメンで、2つの標的遺伝子、GL2とTT4で生殖細胞系列編集を成功裏に達成した。 、Arabidopsisトランスジェニック系統。次に、高温処理を使用して、トウモロコシのCas12aを介したゲノム編集を改善しました。LbCas12a T0トウモロコシ系統を28℃で成長させることにより、T1世代で最大100％の頻度でCas12a編集変異体を取得しました。最後に、ArabidopsisでdCas12a-SRDXベースの転写抑制システムを使用することにより、Cas12aのDNA結合が低温で無効にならないことを示しました。結論：私たちの研究は、米、アラビドプシス、トウモロコシのCas12aシステムで高い編集効率を達成するための高温レジームの使用を実証し、植物のCas12aの温度感受性のメカニズムに光を当てます。"]
[218,31285556,"plant","rice; rapeseed","TALENs;","orf79; orf125","Nature plants","Curing cytoplasmic male sterility via TALEN-mediated mitochondrial genome editing.",2019,"5(7):722-730","[Kazama T  et al.]","Tohoku University, Sendai, Japan.",31285556,"10.1038/s41477-019-0459-z ","Sequence-specific nucleases are commonly used to modify the nuclear genome of plants. However, targeted modification of the mitochondrial genome of land plants has not yet been achieved. In plants, a type of male sterility called cytoplasmic male sterility (CMS) has been attributed to certain mitochondrial genes, but none of these genes has been validated by direct mitochondrial gene-targeted modification. Here, we knocked out CMS-associated genes (orf79 and orf125) of CMS varieties of rice and rapeseed, respectively, using transcription activator-like  effector nucleases (TALENs) with mitochondria localization signals (mitoTALENs).  We demonstrate that knocking out these genes cures male sterility, strongly suggesting that these genes are causes of CMS. Sequencing revealed that double-strand breaks induced by mitoTALENs were repaired by homologous recombination, and that during this process, the target genes and surrounding sequences were deleted. Our results show that mitoTALENs can be used to stably and heritably modify the mitochondrial genome in plants.","rice; rapeseed","配列特異的ヌクレアーゼは、植物の核ゲノムを修飾するために一般的に使用されます。しかし、陸上植物のミトコンドリアゲノムの標的修飾はまだ達成されていません。植物では、細胞質雄性不妊症（CMS）と呼ばれる一種の雄性不稔性が特定のミトコンドリア遺伝子に起因するとされていますが、これらの遺伝子はいずれもミトコンドリア遺伝子を標的とした直接修飾によって検証されていません。ここでは、ミトコンドリア局在化シグナル（mitoTALEN）を伴う転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）を使用して、米と菜種のCMS品種のCMS関連遺伝子（orf79とorf125）をそれぞれノックアウトしました。これらの遺伝子をノックアウトすると男性の不妊症が治癒することを示し、これらの遺伝子がCMSの原因であることを強く示唆しています。シーケンシングにより、mitoTALENによって誘発された二本鎖切断が相同組換えによって修復され、このプロセス中に標的遺伝子と周囲の配列が削除されたことが明らかになりました。私たちの結果は、mitoTALENを使用して、植物のミトコンドリアゲノムを安定的かつ遺伝的に修飾できることを示しています。"]
[219,31125376,"plant","Russian dandelion (Taraxacum koksaghyz)","CRISPR;Cas9;","rapid alkalinisation factor 1","PloS one","Loss of function mutation of the Rapid Alkalinization Factor (RALF1)-like peptide in the dandelion Taraxacum koksaghyz entails a high-biomass taproot phenotype.",2019,"14(5):e0217454","[Wieghaus A et al.]","University of Muenster, Munster, Germany.",31125376,"10.1371/journal.pone.0217454 ","The Russian dandelion (Taraxacum koksaghyz) is a promising source of inulin and natural rubber because large amounts of both feedstocks can be extracted from its roots. However, the domestication of T. koksaghyz requires the development of stable agronomic traits such as higher yields of inulin and natural rubber, a higher root biomass, and an agronomically preferable root morphology which is more suitable for cultivation and harvesting. Arabidopsis thaliana Rapid Alkalinisation Factor 1 (RALF1) has been shown to suppress root growth. We identified the T. koksaghyz orthologue TkRALF-like 1 and knocked out the corresponding gene (TkRALFL1) using the CRISPR/Cas9 system to determine its impact on root morphology, biomass, and inulin and natural rubber yields. The TkRALFL1 knockout lines more frequently developed a taproot phenotype which is easier to cultivate and harvest, as well as a higher root biomass and greater yields of both inulin and natural rubber. The TkRALFL1 gene could therefore be suitable as a genetic marker to support the breeding of profitable new dandelion  varieties with improved agronomic traits. To our knowledge, this is the first study addressing the root system of T. koksaghyz to enhance the agronomic performance.","Russian dandelion (Taraxacum koksaghyz)","ロシアのタンポポ（Taraxacum koksaghyz）は、その根から大量の両方の原料を抽出できるため、イヌリンと天然ゴムの有望な供給源です。ただし、T。koksaghyzの家畜化には、イヌリンと天然ゴムの高収量、高根バイオマス、栽培と収穫により適した農業的に好ましい根の形態など、安定した農業特性の開発が必要です。Arabidopsis thaliana Rapid Alkalinisation Factor 1（RALF1）は、根の成長を抑制することが示されています。T. koksaghyzオルソログTkRALF-like 1を特定し、CRISPR / Cas9システムを使用して対応する遺伝子（TkRALFL1）をノックアウトし、根の形態、バイオマス、イヌリンおよび天然ゴムの収量への影響を調べました。TkRALFL1ノックアウトラインは、より頻繁に、栽培と収穫が容易で、根のバイオマスが高く、イヌリンと天然ゴムの両方の収量が多い直根表現型を開発しました。したがって、TkRALFL1遺伝子は、農業特性が改善された収益性の高い新しいタンポポ品種の繁殖をサポートするための遺伝子マーカーとして適している可能性があります。私たちの知る限り、これは農業パフォーマンスを向上させるためにT.koksaghyzのルートシステムに取り組む最初の研究です。"]
[220,30311663,"plant","Sedum plumbizincicola","CRISPR;Cas9;","heavy metal ATPase 1 (SpHMA1) ","Plant, cell & environment","SpHMA1 is a chloroplast cadmium exporter protecting photochemical reactions in the Cd hyperaccumulator Sedum plumbizincicola.",2019,"42(4):1112-1124","[Zhao H et al.]","Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China.",30311663,"10.1111/pce.13456 ","Sedum plumbizincicola is able to hyperaccumulate cadmium (Cd), a nonessential and highly toxic metal, in the above-ground tissues, but the mechanisms for its Cd hypertolerance are not fully understood. Here, we show that the heavy metal ATPase 1 (SpHMA1) of S. plumbizincicola plays an important role in chloroplast Cd detoxification. Compared with the HMA1 ortholog in the Cd nonhyperaccumulating ecotype of Sedum alfredii, the expression of SpHMA1 in the leaves of S. plumbizincicola was >200 times higher. Heterologous expression of SpHMA1 in Saccharomyces cerevisiae increased Cd sensitivity and Cd transport activity in the yeast cells. The SpHMA1 protein was localized to the chloroplast envelope. SpHMA1 RNA interference transgenic plants and CRISPR/Cas9-induced mutant lines showed significantly increased Cd accumulation in the chloroplasts compared with  wild-type plants. Chlorophyll fluorescence imaging analysis revealed that the photosystem II of SpHMA1 knockdown and knockout lines suffered from a much higher degree of Cd toxicity than wild type. Taken together, these results suggest that  SpHMA1 functions as a chloroplast Cd exporter and protects photosynthesis by preventing Cd accumulation in the chloroplast in S. plumbizincicola and hyperexpression of SpHMA1 is an important component contributing to Cd hypertolerance in S. plumbizincicola.","Sedum plumbizincicola","Sedum plumbizincicolaは、地上組織に非必須で毒性の高い金属であるカドミウム（Cd）を過剰に蓄積することができますが、そのCd耐性のメカニズムは完全には理解されていません。ここでは、S。plumbizincicolaの重金属ATPase 1（SpHMA1）が葉緑体Cdの無害化に重要な役割を果たしていることを示します。Sedum alfrediiのCd非過剰蓄積エコタイプのHMA1オルソログと比較して、S。plumbizincicolaの葉でのSpHMA1の発現は> 200倍高かった。Saccharomyces cerevisiaeにおけるSpHMA1の異種発現は、酵母細胞におけるCd感受性とCd輸送活性を増加させました。SpHMA1タンパク質は葉緑体エンベロープに局在していた。SpHMA1RNA干渉トランスジェニック植物およびCRISPR / Cas9誘導変異株は、野生型植物と比較して、葉緑体におけるCd蓄積の有意な増加を示しました。クロロフィル蛍光イメージング分析により、SpHMA1ノックダウンおよびノックアウトラインの光化学系IIは、野生型よりもはるかに高度なCd毒性に苦しんでいることが明らかになりました。まとめると、これらの結果は、SpHMA1が葉緑体Cdエクスポーターとして機能し、S。plumbizincicolaの葉緑体へのCdの蓄積を防ぐことによって光合成を保護し、SpHMA1の過剰発現がS."]
[221,29656128,"plant","Silene latifolia","agroinfiltration;","GUS reporter","New biotechnology","Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of a dioecious plant model Silene latifolia.",2019,"48:20-28","[Hudzieczek V et al.]","Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, Czech Republic.",29656128,"10.1016/j.nbt.2018.04.001 ","Silene latifolia serves as a model species to study dioecy, the evolution of sex  chromosomes, dosage compensation and sex-determination systems in plants. Currently, no protocol for genetic transformation is available for this species,  mainly because S. latifolia is considered recalcitrant to in vitro regeneration and infection with Agrobacterium tumefaciens. Using cytokinins and their synthetic derivatives, we markedly improved the efficiency of regeneration. Several agrobacterial strains were tested for their ability to deliver DNA into S. latifolia tissues leading to transient and stable expression of the GUS reporter. The use of Agrobacterium rhizogenes strains resulted in the highest transformation efficiency (up to 4.7% of stable transformants) in hairy root cultures. Phenotypic and genotypic analyses of the T1 generation suggested that the majority of transformation events contain a small number of independent T-DNA insertions and the transgenes are transmitted to the progeny in a Mendelian pattern of inheritance. In short, we report an efficient and reproducible protocol for leaf disc transformation and subsequent plant regeneration in S. latifolia, based on the unique combination of infection with A. rhizogenes and plant regeneration from hairy root cultures using synthetic cytokinins. A protocol for the transient transformation of S.latifolia protoplasts was also developed and applied to demonstrate the possibility of targeted mutagenesis of the sex linked gene SlAP3 by TALENs and CRISPR/Cas9.","Silene latifolia","Silene latifoliaは、植物のダイオシー、性染色体の進化、投与量の補償、性決定システムを研究するためのモデル種として機能します。現在、この種の遺伝的形質転換のプロトコルはありません。これは主に、S。latifoliaがinvitroでの再生とAgrobacteriumtumefaciensの感染に抵抗性があると考えられているためです。サイトカイニンとその合成誘導体を使用して、再生効率を大幅に向上させました。いくつかのアグロバクテリア株は、GUSレポーターの一時的で安定した発現につながるS.latifolia組織にDNAを送達する能力についてテストされました。Agrobacterium rhizogenes株を使用すると、毛根培養で最高の形質転換効率（安定した形質転換体の最大4.7％）が得られました。T1世代の表現型および遺伝子型分析は、形質転換イベントの大部分が少数の独立したT-DNA挿入を含み、導入遺伝子がメンデル遺伝のパターンで子孫に伝達されることを示唆しました。要するに、A。rhizogenesによる感染と合成サイトキニンを使用した毛根培養からの植物再生のユニークな組み合わせに基づいて、S。latifoliaにおける葉板形質転換とその後の植物再生のための効率的で再現可能なプロトコルを報告します。S.latifoliaプロトプラストの一過性形質転換のプロトコルも開発され、TALENおよびCRISPR / Cas9による性関連遺伝子SlAP3の標的変異誘発の可能性を実証するために適用されました。"]
[222,30691438,"plant","soybean","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","microsomal omega-6 desaturase (FAD2-2)","BMC biotechnology","CRISPR-Cas9 mediated targeted disruption of FAD2-2 microsomal omega-6 desaturase  in soybean (Glycine max.L).",2019,"19(1):9","[Al Amin N et al.]","Jilin Agricultural University, Changchun, Jilin, China.",30691438,"10.1186/s12896-019-0501-2 ","BACKGROUND: Recent innovation in the field of genome engineering encompasses numerous levels of plant genome engineering which attract the substantial excitement of plant biologist worldwide. RNA-guided CRISPR Cas9 system has appeared a promising tool in site-directed mutagenesis due to its innovative utilization in different branches of biology. CRISPR-Cas9 nuclease system have supersedes all previously existed strategies and their associated pitfalls encountered with site-specific mutagenesis. RESULTS: Here we demonstrated an efficient sequence specific integration/mutation of FAD2-2 gene in soybean using  CRISPR-Cas9 nuclease system. A single guided RNA sequence was designed with the help of a number of bioinformatics tools aimed to target distinct sites of FAD2-2 loci in soybean. The binary vector (pCas9-AtU6-sgRNA) has been successfully transformed into soybean cotyledon using Agrobacterium tumafacien. Taken together our findings complies soybean transgenic mutants subjected to targeted mutation were surprisingly detected in our target gene. Furthermore, the detection of Cas9 gene, BAR gene, and NOS terminator were carried out respectively. Southern blot analysis confirmed the stable transformation of Cas9 gene into soybean. Real time expression with qRT-PCR and Sanger sequencing analysis confirmed the efficient CRISPR-Cas9/sgRNA induced mutation within the target sequence of FAD2-2 loci. The integration of FAD2-2 target region in the form of substitution, deletions and insertions were achieved with notably high frequency and rare off-target mutagenesis. CONCLUSION: High frequent mutation efficiency was recorded as 21% out of all transgenic soybean plants subjected to targeted mutagenesis. Furthermore, Near-infrared spectroscopy (NIR) indicates the entire fatty acid profiling obtained from the mutants seeds of soybean. A considerable modulation in oleic acid content up to (65.58%) whereas the least level of linoleic acid is  (16.08%) were recorded. Based on these finding CRISPR-Cas9 system can possibly sum up recent development and future challenges in producing agronomically important crops.","soybean","背景：ゲノム工学の分野における最近の革新は、世界中の植物生物学者の実質的な興奮を引き付ける多くのレベルの植物ゲノム工学を網羅しています。RNAガイド付きCRISPRCas9システムは、生物学のさまざまな分野で革新的に利用されているため、部位特異的突然変異誘発において有望なツールとして登場しました。CRISPR-Cas9ヌクレアーゼシステムは、これまでに存在したすべての戦略と、部位特異的変異誘発で遭遇する関連する落とし穴に取って代わります。結果：ここでは、CRISPR-Cas9ヌクレアーゼシステムを使用して、大豆におけるFAD2-2遺伝子の効率的な配列特異的組み込み/変異を実証しました。単一のガイド付きRNA配列は、大豆のFAD2-2遺伝子座の異なる部位を標的とすることを目的とした多くのバイオインフォマティクスツールの助けを借りて設計されました。バイナリーベクター（pCas9-AtU6-sgRNA）は、Agrobacteriumtumafacienを使用して大豆子葉に正常に変換されました。まとめると、我々の発見は、標的突然変異を受けたダイズトランスジェニック突然変異体が我々の標的遺伝子で驚くほど検出されたことに準拠している。さらに、Cas9遺伝子、BAR遺伝子、NOSターミネーターの検出をそれぞれ行った。サザンブロット分析により、Cas9遺伝子の大豆への安定した形質転換が確認されました。qRT-PCRとサンガーシーケンシング分析によるリアルタイム発現により、FAD2-2遺伝子座の標的配列内で効率的なCRISPR-Cas9 / sgRNA誘導変異が確認されました。置換、欠失、挿入の形でのFAD2-2標的領域の統合は、特に高頻度でまれなオフ標的突然変異誘発で達成されました。結論：高頻度の突然変異効率は、標的突然変異誘発を受けたすべてのトランスジェニック大豆植物の21％として記録されました。さらに、近赤外分光法（NIR）は、大豆の変異種子から得られた脂肪酸プロファイリング全体を示します。リノール酸の最低レベルが（16.08％）であるのに対し、（65.58％）までのオレイン酸含有量のかなりの変調が記録されました。これらの発見に基づいて、CRISPR-Cas9システムは、農業的に重要な作物を生産する際の最近の開発と将来の課題を要約できる可能性があります。"]
[223,31852439,"plant","soybean","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","late elongated hypocotyl","BMC plant biology","CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis of GmLHY genes alters plant height and  internode length in soybean.",2019,"19(1):562","[Cheng Q et al.]","Guangzhou University, Guangzhou, China.",31852439,"10.1186/s12870-019-2145-8 ","BACKGROUND: Soybean (Glycine max) is an economically important oil and protein crop. Plant height is a key trait that significantly impacts the yield of soybean; however, research on the molecular mechanisms associated with soybean plant height is lacking. The CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/Cas9 (CRISPR-associated system 9) system is a recently developed technology for gene editing that has been utilized to edit the genomes  of crop plants. RESULTS: Here, we designed four gRNAs to mutate four LATE ELONGATED HYPOCOTYL (LHY) genes in soybean. In order to test whether the gRNAs could perform properly in transgenic soybean plants, we first tested the CRISPR construct in transgenic soybean hairy roots using Agrobacterium rhizogenes strain K599. Once confirmed, we performed stable soybean transformation and obtained 19  independent transgenic soybean plants. Subsequently, we obtained one T1 transgene-free homozygous quadruple mutant of GmLHY by self-crossing. The phenotypes of the T2-generation transgene-free quadruple mutant plants were observed, and the results showed that the quadruple mutant of GmLHY displayed reduced plant height and shortened internodes. The levels of endogenous gibberellic acid (GA3) in Gmlhy1a1b2a2b was lower than in the wild type (WT), and the shortened internode phenotype could be rescued by treatment with exogenous GA3. In addition, the relative expression levels of GA metabolic pathway genes in the quadruple mutant of GmLHY were significantly decreased in comparison to the WT. These results suggest that GmLHY encodes an MYB transcription factor that affects plant height through mediating the GA pathway in soybean. We also developed genetic markers for identifying mutants for application in breeding studies. CONCLUSIONS: Our results indicate that CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis of four GmLHY genes reduces soybean plant height and shortens internodes from 20 to 35 days after emergence (DAE). These findings provide insight into the mechanisms underlying plant height regulatory networks in soybean.","soybean","背景：大豆（Glycine max）は、経済的に重要な油とタンパク質の作物です。植物の高さは、大豆の収量に大きな影響を与える重要な特性です。しかし、大豆の草丈に関連する分子メカニズムに関する研究は不足しています。CRISPR（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート）/ Cas9（CRISPR関連システム9）システムは、作物植物のゲノムを編集するために利用されている遺伝子編集のための最近開発された技術です。結果：ここでは、大豆の4つの後期ELONGATED HYPOCOTYL（LHY）遺伝子を変異させるために4つのgRNAを設計しました。gRNAがトランスジェニックダイズ植物で適切に機能するかどうかをテストするために、まず、Agrobacterium rhizogenesK599株を使用してトランスジェニックダイズ毛状根でCRISPRコンストラクトをテストしました。確認後、安定した大豆形質転換を行い、19の独立したトランスジェニック大豆植物を得た。続いて、自己交差により、GmLHYのT1トランスジーンフリーホモ接合性四重変異体を1つ取得しました。T2世代のトランスジーンフリーの4重変異体植物の表現型が観察され、その結果、GmLHYの4重変異体は、草丈の低下と節間の短縮を示した。Gmlhy1a1b2a2bの内因性ジベレリン酸（GA3）のレベルは、野生型（WT）よりも低く、短縮された節間表現型は、外因性GA3での治療によって救済することができました。さらに、GmLHYの4重変異体におけるGA代謝経路遺伝子の相対的発現レベルは、WTと比較して有意に減少しました。これらの結果は、GmLHYが大豆のGA経路を媒介することで草丈に影響を与えるMYB転写因子をコードしていることを示唆しています。また、育種研究に適用する変異体を同定するための遺伝子マーカーを開発しました。結論：私たちの結果は、4つのGmLHY遺伝子のCRISPR / Cas9を介した標的突然変異誘発により、大豆植物の高さが減少し、出現後20日から35日（DAE）に節間が短縮されることを示しています。これらの調査結果は、大豆の草丈調節ネットワークの根底にあるメカニズムへの洞察を提供します。"]
[224,31307375,"plant","soybean","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","Fatty Acid Desaturase 2 (GmFAD2-1A; GmFAD2-1B)","BMC plant biology","Demonstration of highly efficient dual gRNA CRISPR/Cas9 editing of the homeologous GmFAD2-1A and GmFAD2-1B genes to yield a high oleic, low linoleic and alpha-linolenic acid phenotype in soybean.",2019,"19(1):311","[Do PT et al.]","University of Missouri, Columbia, MO, USA.",31307375,"10.1186/s12870-019-1906-8 ","BACKGROUND: CRISPR/Cas9 gene editing is now revolutionizing the ability to effectively modify plant genomes in the absence of efficient homologous recombination mechanisms that exist in other organisms. However, soybean is allotetraploid and is commonly viewed as difficult and inefficient to transform.  In this study, we demonstrate the utility of CRISPR/Cas9 gene editing in soybean  at relatively high efficiency. This was shown by specifically targeting the Fatty Acid Desaturase 2 (GmFAD2) that converts the monounsaturated oleic acid (C18:1) to the polyunsaturated linoleic acid (C18:2), therefore, regulating the content of monounsaturated fats in soybean seeds. RESULTS: We designed two gRNAs to guide Cas9 to simultaneously cleave two sites, spaced 1Kb apart, within the second exons of GmFAD2-1A and GmFAD2-1B. In order to test whether the Cas9 and gRNAs would perform properly in transgenic soybean plants, we first tested the CRISPR construct we developed by transient hairy root transformation using Agrobacterium rhizogenesis strain K599. Once confirmed, we performed stable soybean transformation and characterized ten, randomly selected T0 events. Genotyping of  CRISPR/Cas9 T0 transgenic lines detected a variety of mutations including large and small DNA deletions, insertions and inversions in the GmFAD2 genes. We detected CRISPR- edited DNA in all the tested T0 plants and 77.8% of the events transmitted the GmFAD2 mutant alleles to T1 progenies. More importantly, null mutants for both GmFAD2 genes were obtained in 40% of the T0 plants we genotyped. The fatty acid profile analysis of T1 seeds derived from CRISPR-edited plants homozygous for both GmFAD2 genes showed dramatic increases in oleic acid content  to over 80%, whereas linoleic acid decreased to 1.3-1.7%. In addition, transgene-free high oleic soybean homozygous genotypes were created as early as the T1 generation. CONCLUSIONS: Overall, our data showed that dual gRNA CRISPR/Cas9 system offers a rapid and highly efficient method to simultaneously edit homeologous soybean genes, which can greatly facilitate breeding and gene discovery in this important crop plant.","soybean","背景：CRISPR / Cas9遺伝子編集は、他の生物に存在する効率的な相同組換えメカニズムがない場合に、植物ゲノムを効果的に変更する機能に革命をもたらしています。ただし、大豆は異質四倍体であり、一般に、形質転換が困難で非効率的であると見なされています。この研究では、比較的高い効率で大豆におけるCRISPR / Cas9遺伝子編集の有用性を示しています。これは、モノ不飽和オレイン酸（C18：1）をポリ不飽和​​リノール酸（C18：2）に変換する脂肪酸デサチュラーゼ2（GmFAD2）を特異的に標的とし、大豆種子中のモノ不飽和脂肪の含有量を調節することによって示されました。結果：GmFAD2-1AとGmFAD2-1Bの2番目のエキソン内で、Cas9が1Kb間隔で2つのサイトを同時に切断するようにガイドする2つのgRNAを設計しました。Cas9とgRNAがトランスジェニック大豆植物で適切に機能するかどうかをテストするために、最初に、Agrobacterium rhizogenesisK599株を使用した一過性毛根形質転換によって開発したCRISPRコンストラクトをテストしました。確認したら、安定した大豆の形質転換を行い、ランダムに選択した10個のT0イベントの特性を調べました。CRISPR / Cas9 T0トランスジェニック系統のジェノタイピングにより、GmFAD2遺伝子の大小のDNAの削除、挿入、反転など、さまざまな変異が検出されました。テストしたすべてのT0植物でCRISPR編集されたDNAを検出し、イベントの77.8％がGmFAD2変異対立遺伝子をT1子孫に伝達しました。さらに重要なことに、両方のGmFAD2遺伝子のヌル変異体は、ジェノタイピングしたT0植物の40％で得られました。両方のGmFAD2遺伝子についてホモ接合性のCRISPR編集植物に由来するT1種子の脂肪酸プロファイル分析は、オレイン酸含有量が80％以上に劇的に増加したのに対し、リノール酸は1.3〜1.7％に減少したことを示しました。さらに、トランスジーンフリーの高オレイン酸大豆ホモ接合性遺伝子型は、早くもT1世代で作成されました。結論：全体として、私たちのデータは、デュアルgRNA CRISPR / Cas9システムが、同種の大豆遺伝子を同時に編集するための迅速で非常に効率的な方法を提供し、この重要な作物の育種と遺伝子発見を大幅に促進できることを示しました。"]
[225,30961525,"plant","soybean","CRISPR;Cas9;agroinfiltration","SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (SPL) transcription factors of the SPL9 family (GmSPL9)","BMC plant biology","CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis of GmSPL9 genes alters plant architecture in soybean.",2019,"19(1):131","[Bao A et al.]","Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Wuhan, China.",30961525,"10.1186/s12870-019-1746-6 ","BACKGROUND: The plant architecture has significant effects on grain yield of various crops, including soybean (Glycine max), but the knowledge on optimization of plant architecture in order to increase yield potential is still limited. Recently, CRISPR/Cas9 system has revolutionized genome editing, and has been widely utilized to edit the genomes of a diverse range of crop plants. RESULTS: In the present study, we employed the CRISPR/Cas9 system to mutate four genes encoding SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (SPL) transcription factors of the SPL9 family in soybean. These four GmSPL9 genes are negatively regulated by GmmiR156b, a target for the improvement of soybean plant architecture and yields. The soybean Williams 82 was transformed with the binary CRISPR/Cas9 plasmid, assembled with four sgRNA expression cassettes driven by the Arabidopsis thaliana U3 or U6 promoter, targeting different sites of these four SPL9 genes via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. A 1-bp deletion was detected in one target site of the GmSPL9a and one target site of the GmSPL9b, respectively, by DNA sequencing analysis of two T0-generation plants. T2-generation spl9a and spl9b homozygous single mutants exhibited no obvious phenotype changes; but the T2 double homozygous mutant spl9a/spl9b possessed shorter plastochron length. In T4 generation, higher-order mutant plants carrying various combinations of mutations showed increased node number on the main stem and branch number, consequently increased total node number per plants at different levels. In addition, the expression levels of the examined GmSPL9 genes were higher in the spl9b-1 single mutant than wild-type plants, which might suggest a feedback regulation on the expression of the investigated GmSPL9 genes  in soybean. CONCLUSIONS: Our results showed that CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis of four GmSPL9 genes in different combinations altered plant architecture in soybean. The findings demonstrated that GmSPL9a, GmSPL9b, GmSPL9c and GmSPL9 function as redundant transcription factors in regulating plant architecture in soybean.","soybean","背景：植物構造は、大豆（Glycine max）を含むさまざまな作物の穀物収量に大きな影響を及ぼしますが、収量の可能性を高めるための植物構造の最適化に関する知識はまだ限られています。最近、CRISPR / Cas9システムはゲノム編集に革命をもたらし、さまざまな作物のゲノムを編集するために広く利用されています。結果：本研究では、CRISPR / Cas9システムを使用して、大豆のSPL9ファミリーのSQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE（SPL）転写因子をコードする4つの遺伝子を変異させました。これらの4つのGmSPL9遺伝子は、ダイズ植物の構造と収量の改善のターゲットであるGmmiR156bによって負に制御されています。大豆ウィリアムズ82は、バイナリCRISPR / Cas9プラスミドで形質転換され、シロイヌナズナU3またはU6プロモーターによって駆動される4つのsgRNA発現カセットで組み立てられ、アグロバクテリウムツメファシエンスを介した形質転換を介してこれら4つのSPL9遺伝子の異なる部位を標的としました。2つのT0世代植物のDNA配列分析により、GmSPL9aの1つの標的部位とGmSPL9bの1つの標的部位でそれぞれ1bpの欠失が検出されました。T2世代のspl9aおよびspl9bホモ接合性単一変異体は明らかな表現型の変化を示さなかった。しかし、T2ダブルホモ接合変異体spl9a / spl9bはより短いプラストクロン長を持っていました。T4世代では、突然変異のさまざまな組み合わせを持つ高次の突然変異植物は、主茎と枝の数の増加を示し、その結果、さまざまなレベルで植物あたりの総節数が増加しました。さらに、調べたGmSPL9遺伝子の発現レベルは、野生型植物よりもspl9b-1単一変異体の方が高かった。これは、大豆で調べたGmSPL9遺伝子の発現に対するフィードバック調節を示唆している可能性がある。結論：私たちの結果は、異なる組み合わせの4つのGmSPL9遺伝子のCRISPR / Cas9を介した標的突然変異誘発が、大豆の植物構造を変化させたことを示しました。調査結果は、GmSPL9a、GmSPL9b、GmSPL9c、およびGmSPL9が、大豆の植物構造を調節する際の冗長な転写因子として機能することを示しました。"]
[226,30917862,"plant","soybean","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","soybean storage protein genes","BMC research notes","Mutagenesis of seed storage protein genes in Soybean using CRISPR/Cas9.",2019,"12(1):176","[Li C et al.]","London Research and Development Center, Agriculture and Agri-Food Canada, London, ON, Canada.",30917862,"10.1186/s13104-019-4207-2 ","OBJECTIVE: Soybean seeds are an important source of vegetable proteins for both food and industry worldwide. Conglycinins (7S) and glycinins (11S), which are two major families of storage proteins encoded by a small family of genes, account for about 70% of total soy seed protein. Mutant alleles of these genes are often  necessary in certain breeding programs, as the relative abundance of these protein subunits affect amino acid composition and soy food properties. In this study, we set out to test the efficiency of the CRISPR/Cas9 system in editing soybean storage protein genes using Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root  transformation system. RESULTS: We designed and tested sgRNAs to target nine different major storage protein genes and detected DNA mutations in three storage protein genes in soybean hairy roots, at a ratio ranging from 3.8 to 43.7%. Our work provides a useful resource for future soybean breeders to engineer/develop varieties with mutations in seed storage proteins.","soybean","目的：大豆の種子は、世界中の食品と産業の両方にとって重要な植物性タンパク質の供給源です。コングリシニン（7S）とグリシニン（11S）は、小さな遺伝子ファミリーによってコードされる貯蔵タンパク質の2つの主要なファミリーであり、大豆種子タンパク質全体の約70％を占めています。これらのタンパク質サブユニットの相対的な存在量がアミノ酸組成と大豆食品の特性に影響を与えるため、これらの遺伝子の変異対立遺伝子は、特定の育種プログラムでしばしば必要になります。この研究では、Agrobacteriumrhizogenesを介した毛状根形質転換システムを使用して大豆貯蔵タンパク質遺伝子を編集する際のCRISPR / Cas9システムの効率をテストすることに着手しました。結果：9つの異なる主要な貯蔵タンパク質遺伝子を標的とするsgRNAを設計およびテストし、3.8〜43.7％の範囲の比率で大豆毛根の3つの貯蔵タンパク質遺伝子のDNA変異を検出しました。私たちの仕事は、将来の大豆育種家が種子貯蔵タンパク質に変異を持つ品種を設計/開発するための有用なリソースを提供します。"]
[227,31983878,"plant","soybean","Agroinfiltration;","Lotus japonicus polyubiquitin gene promoter-fused MYB gene into promoter-fused  beta-glucuronidase gene constructs","Plant biotechnology","Identification of novel MYB transcription factors involved in the isoflavone biosynthetic pathway by using the combination screening system with agroinfiltration and hairy root transformation.",2019,"36(4):241-251","[Sarkar MAR et al.]","Kagoshima University, Kagoshima, Japan.",31983878,"10.5511/plantbiotechnology.19.1025a ","Soybean isoflavones are functionally important secondary metabolites that are mainly accumulated in seeds. Their biosynthetic processes are regulated coordinately at the transcriptional level; however, screening systems for key transcription factors (TFs) are limited. Here we developed a combination screening system comprising a simple agroinfiltration assay and a robust hairy root transformation assay. First, we screened for candidate MYB TFs that could activate the promoters of the chalcone synthase (CHS) gene GmCHS8 and the isoflavone synthase (IFS) genes GmIFS1 and GmIFS2 in the isoflavone biosynthetic  pathway. In the agroinfiltration assay, we co-transformed a LjUbi (Lotus japonicus polyubiquitin gene) promoter-fused MYB gene with target promoter-fused  GUS (beta-glucuronidase) gene constructs, and identified three genes (GmMYB102, GmMYB280, and GmMYB502) as candidate regulators of isoflavone biosynthesis. We then evaluated the functional regulatory role of identified three MYB genes in isoflavone biosynthesis using hairy roots transformation assay in soybean for the accumulation of isoflavones. Three candidate MYB genes showed an increased accumulation of total isoflavones in hairy root transgenic lines. Accumulation of total isoflavones in the three MYB-overexpressing lines was approximately 2-to 4-folds more than that in the vector control, confirming their possible role to regulate isoflavone biosynthesis. However, the significant accumulation of authentic GmCHS8, GmIFS1, and GmIFS2 transcripts could not be observed except for the GmMYB502-overexpressing line. Therefore, the analysis of isoflavone accumulation in transgenic hairy root was effective for evaluation of transactivation activity of MYB TFs for isoflavone biosynthetic genes. Our results demonstrate a simple and robust system that can potentially identify the  function of orphan TFs in diverse plant metabolic pathways.","soybean","大豆イソフラボンは、主に種子に蓄積される機能的に重要な二次代謝産物です。それらの生合成プロセスは、転写レベルで協調的に調節されています。ただし、主要な転写因子（TF）のスクリーニングシステムは限られています。ここでは、単純なアグロインフィルトレーションアッセイと堅牢な毛状根形質転換アッセイを含む組み合わせスクリーニングシステムを開発しました。まず、カルコンシンターゼ（CHS）遺伝子GmCHS8とイソフラボンシンターゼ（IFS）遺伝子GmIFS1およびGmIFS2のプロモーターをイソフラボン生合成経路で活性化できる候補MYBTFをスクリーニングしました。アグロインフィルトレーションアッセイでは、LjUbi（Lotus japonicus polyubiquitin遺伝子）プロモーター融合MYB遺伝子をターゲットプロモーター融合GUS（ベータグルクロニダーゼ）遺伝子コンストラクトで同時形質転換し、3つの遺伝子（GmMYB102、GmMYB280、GmMYB502）を候補として同定しました。イソフラボン生合成の調節因子。次に、イソフラボンの蓄積について大豆の毛根形質転換アッセイを使用して、イソフラボン生合成における同定された3つのMYB遺伝子の機能的調節の役割を評価しました。3つの候補MYB遺伝子は、毛根トランスジェニック系統における総イソフラボンの蓄積の増加を示した。3つのMYB過剰発現系統における総イソフラボンの蓄積は、ベクター対照のそれよりも約2〜4倍多く、イソフラボン生合成を調節するそれらの可能な役割を確認した。ただし、本物のGmCHS8、GmIFS1、およびGmIFS2転写産物の有意な蓄積は、GmMYB502過剰発現株を除いて観察できませんでした。したがって、トランスジェニック毛状根におけるイソフラボン蓄積の分析は、イソフラボン生合成遺伝子に対するMYBTFのトランス活性化活性の評価に効果的でした。私たちの結果は、多様な植物代謝経路における孤立したTFの機能を潜在的に特定できるシンプルで堅牢なシステムを示しています。"]
[228,31769589,"plant","soybean","CRISPR;Cas9;","GmF3H1; GmF3H2; GmFNSII-1","Plant biotechnology journal","Multiplex CRISPR/Cas9-mediated metabolic engineering increases soya bean isoflavone content and resistance to soya bean mosaic virus.",2019,null,"[Zhang P et al.]","Nanjing Agricultural University, Nanjing, China.",31769589,"10.1111/pbi.13302 ","Isoflavonoids, which include a variety of secondary metabolites, are derived from the phenylpropanoid pathway and are distributed predominantly in leguminous plants. These compounds play a critical role in plant-environment interactions and are beneficial to human health. Isoflavone synthase (IFS) is a key enzyme in  isoflavonoid synthesis and shares a common substrate with flavanone-3-hydroxylase (F3H) and flavone synthase II (FNS II). In this study, CRISPR/Cas9-mediated multiplex gene-editing technology was employed to simultaneously target GmF3H1, GmF3H2 and GmFNSII-1 in soya bean hairy roots and plants. Various mutation types  and frequencies were observed in hairy roots. Higher mutation efficiencies were found in the T0 transgenic plants, with a triple gene mutation efficiency of 44.44%, and these results of targeted mutagenesis were stably inherited in the progeny. Metabolomic analysis of T0 triple-mutants leaves revealed significant improvement in isoflavone content. Compared with the wild type, the T3 generation homozygous triple mutants had approximately twice the leaf isoflavone content, and the soya bean mosaic virus (SMV) coat protein content was significantly reduced by one-third after infection with strain SC7, suggesting that increased isoflavone content enhanced the leaf resistance to SMV. The isoflavone content in the seeds of T2 triple mutants was also significantly increased. This study provides not only materials for the improvement of soya bean isoflavone content and resistance to SMV but also a simple system to generate multiplex mutations in soya bean, which may be beneficial for further breeding and metabolic engineering.","soybean","さまざまな二次代謝産物を含むイソフラボノイドは、フェニルプロパノイド経路に由来し、主にマメ科植物に分布しています。これらの化合物は、植物と環境の相互作用において重要な役割を果たし、人間の健康に有益です。イソフラボンシンターゼ（IFS）は、イソフラボノイド合成の重要な酵素であり、フラバノン-3-ヒドロキシラーゼ（F3H）およびフラボンシンターゼII（FNS II）と共通の基質を共有します。この研究では、CRISPR / Cas9を介した多重遺伝子編集技術を使用して、大豆の毛深い根と植物のGmF3H1、GmF3H2、GmFNSII-1を同時に標的にしました。毛深い根では、さまざまな変異の種類と頻度が観察されました。T0トランスジェニック植物ではより高い突然変異効率が見られ、三重遺伝子突然変異効率は44.44％であり、標的突然変異誘発のこれらの結果は子孫に安定して受け継がれました。T0トリプルミュータントの葉の代謝分析により、イソフラボン含有量の有意な改善が明らかになりました。野生型と比較して、T3世代のホモ接合性三重変異体は葉のイソフラボン含有量が約2倍であり、大豆モザイクウイルス（SMV）コートタンパク質含有量はSC7株の感染後に3分の1に有意に減少し、イソフラボン含有量の増加を示唆しているSMVに対する葉の耐性を強化しました。T2トリプルミュータントの種子中のイソフラボン含有量も大幅に増加しました。この研究は、大豆イソフラボン含有量とSMVに対する耐性を改善するための材料を提供するだけでなく、大豆に多重突然変異を生成するための簡単なシステムも提供します。これは、さらなる育種と代謝工学に役立つ可能性があります。"]
[229,31452351,"plant","soybean","CRISPR;Cas9;","102 candidate genes and their paralogs","Plant biotechnology journal","Generation of a multiplex mutagenesis population via pooled CRISPR-Cas9 in soya bean.",2019,null,"[Bai M et al.]","Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, China.",31452351,"10.1111/pbi.13239 ","The output of genetic mutant screenings in soya bean [Glycine max (L.) Merr.] has been limited by its paleopolypoid genome. CRISPR-Cas9 can generate multiplex mutants in crops with complex genomes. Nevertheless, the transformation efficiency of soya bean remains low and, hence, remains the major obstacle in the application of CRISPR-Cas9 as a mutant screening tool. Here, we report a pooled CRISPR-Cas9 platform to generate soya bean multiplex mutagenesis populations. We  optimized the key steps in the screening protocol, including vector construction, sgRNA assessment, pooled transformation, sgRNA identification and gene editing verification. We constructed 70 CRISPR-Cas9 vectors to target 102 candidate genes and their paralogs which were subjected to pooled transformation in 16 batches. A population consisting of 407 T0 lines was obtained containing all sgRNAs at an average mutagenesis frequency of 59.2%, including 35.6% lines carrying multiplex  mutations. The mutation frequency in the T1 progeny could be increased further despite obtaining a transgenic chimera. In this population, we characterized gmric1/gmric2 double mutants with increased nodule numbers and gmrdn1-1/1-2/1-3 triple mutant lines with decreased nodulation. Our study provides an advanced strategy for the generation of a targeted multiplex mutant population to overcome the gene redundancy problem in soya bean as well as in other major crops.","soybean","大豆[Glycinemax（L.）Merr。]における遺伝子変異体スクリーニングの出力は、その古ポリープ状ゲノムによって制限されています。CRISPR-Cas9は、複雑なゲノムを持つ作物で多重変異体を生成できます。それにもかかわらず、大豆の形質転換効率は依然として低く、したがって、変異体スクリーニングツールとしてのCRISPR-Cas9の適用における主要な障害であり続けています。ここでは、プールされたCRISPR-Cas9プラットフォームを報告して、大豆の多重突然変異誘発集団を生成します。ベクター構築、sgRNA評価、プールされた形質転換、sgRNA同定、遺伝子編集検証など、スクリーニングプロトコルの主要なステップを最適化しました。70個のCRISPR-Cas9ベクターを構築して、16個のバッチでプールされた変換にかけられた102個の候補遺伝子とそのパラログをターゲットにしました。多重変異を有する35.6％の系統を含む、59.2％の平均変異誘発頻度ですべてのsgRNAを含む407のT0系統からなる集団が得られた。トランスジェニックキメラを得たにもかかわらず、T1子孫の突然変異頻度をさらに増加させることができた。この集団では、結節数が増加したgmric1 / gmric2二重変異体と、結節数が減少したgmrdn1-1 / 1-2 / 1-3三重変異株を特徴づけました。私たちの研究は、大豆や他の主要作物の遺伝子冗長性の問題を克服するために、標的となる多重変異体集団を生成するための高度な戦略を提供します。"]
[230,30220095,"plant","soybean","ZFN;","multiple transgenes into FAD2-1a locus","Plant biotechnology journal","Zinc finger nuclease-mediated targeting of multiple transgenes to an endogenous soybean genomic locus via non-homologous end joining.",2019,"17(4):750-761","[Bonawitz ND  et al.]","Dow AgroSciences LLC, Indianapolis, IN, USA.",30220095,"10.1111/pbi.13012 ","Emerging genome editing technologies hold great promise for the improvement of agricultural crops. Several related genome editing methods currently in development utilize engineered, sequence-specific endonucleases to generate DNA double strand breaks (DSBs) at user-specified genomic loci. These DSBs subsequently result in small insertions/deletions (indels), base substitutions or incorporation of exogenous donor sequences at the target site, depending on the application. Targeted mutagenesis in soybean (Glycine max) via non-homologous end joining (NHEJ)-mediated repair of such DSBs has been previously demonstrated with multiple nucleases, as has homology-directed repair (HDR)-mediated integration of a single transgene into target endogenous soybean loci using CRISPR/Cas9. Here we report targeted integration of multiple transgenes into a single soybean locus using a zinc finger nuclease (ZFN). First, we demonstrate targeted integration of biolistically delivered DNA via either HDR or NHEJ to the FATTY ACID DESATURASE 2-1a (FAD2-1a) locus of embryogenic cells in tissue culture. We then describe ZFN- and NHEJ-mediated, targeted integration of two different multigene donors to the FAD2-1a locus of immature embryos. The largest donor delivered was 16.2 kb, carried four transgenes, and was successfully transmitted to T1 progeny of mature targeted plants obtained via somatic embryogenesis. The insertions in most plants with a targeted, 7.1 kb, NHEJ-integrated donor were perfect or near-perfect, demonstrating that NHEJ is a viable alternative to HDR for gene targeting in soybean. Taken together, these results show that ZFNs can be used to generate fertile transgenic soybean plants with NHEJ-mediated targeted insertions of multigene donors at an endogenous genomic locus.","soybean","新たなゲノム編集技術は、農作物の改良に大きな期待を寄せています。現在開発中のいくつかの関連するゲノム編集方法は、操作された配列特異的エンドヌクレアーゼを利用して、ユーザー指定のゲノム遺伝子座でDNA二本鎖切断（DSB）を生成します。これらのDSBは、その後、アプリケーションに応じて、小さな挿入/削除（インデル）、塩基置換、または標的部位での外因性ドナー配列の取り込みをもたらします。このようなDSBの非相同末端結合（NHEJ）を介した修復を介した大豆（Glycine max）の標的突然変異誘発は、相同性指向修復（HDR）を介した単一導入遺伝子の標的内因性への統合と同様に、複数のヌクレアーゼで以前に実証されています。 CRISPR / Cas9を使用した大豆遺伝子座。ここでは、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ZFN）を使用して、複数の導入遺伝子を単一の大豆遺伝子座にターゲットを絞って統合することを報告します。まず、HDRまたはNHEJのいずれかを介して、組織培養における胚形成細胞のFATTY ACID DESATURASE 2-1a（FAD2-1a）遺伝子座への微粒子銃によるDNAの標的化された統合を示します。次に、ZFNおよびNHEJを介した、2つの異なる複数遺伝子ドナーの未成熟胚のFAD2-1a遺伝子座への標的統合について説明します。提供された最大のドナーは16.2kbで、4つの導入遺伝子を運び、体細胞胚形成によって得られた成熟した標的植物のT1子孫に首尾よく伝達されました。ターゲットを絞った7.1kbのNHEJ統合ドナーを持つほとんどの植物への挿入は完全またはほぼ完全であり、NHEJがダイズの遺伝子ターゲティングのためのHDRの実行可能な代替手段であることを示しています。まとめると、これらの結果は、ZFNを使用して、NHEJを介した内因性ゲノム遺伝子座への複数遺伝子ドナーの標的挿入を伴う肥沃なトランスジェニック大豆植物を生成できることを示しています。"]
[231,31203891,"plant","soybean","CRISPR;Cas9;","Heat shock protein 90 (GmHsp90A2)","Plant science","GmHsp90A2 is involved in soybean heat stress as a positive regulator.",2019,"285:26-33","[Huang Y et al.]","Nanjing Agricultural University, Nanjing, China.",31203891,"10.1016/j.plantsci.2019.04.016 ","Heat shock protein 90 s (Hsp90s), one of the most conserved and abundant molecular chaperones, is an essential component of the protective stress response. A previous study reported at least 12 genes in the GmHsp90s family in soybean and that GmHsp90A2 overexpression enhanced thermotolerance in Arabidopsis thaliana. Here, we investigate the roles of GmHsp90A2 in soybean by utilizing stable transgenic soybean lines overexpressing GmHsp90A2 and mutant lines generated by the CRISPR/Cas9 system. The results showed that compared with wild-type plants (WT) and empty vector control plants (VC), T3 transgenic soybean plants overexpressing GmHsp90A2 exhibited increased tolerance to heat stress through higher chlorophyll and lower malondialdehyde (MDA) contents in plants. Conversely, reduced chlorophyll and increased MDA contents in T2 homozygous GmHsp90A2-knockout mutants indicated decreased tolerance to heat stress. GmHsp90A2 was found to interact with GmHsp90A1 in yeast two-hybrid assays. Furthermore, subcellular localization analyses revealed that GmHsp90A2 was localized to the cytoplasm and cell membrane; as shown by bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays, GmHsp90A2 interacted with GmHsp90A1 in the nucleus and cytoplasm and cell membrane. Hence, we conclude that GmHsp90A1 is able to bind to GmHsp90A2 to form a complex and that this complex enters the nucleus. In summary, GmHsp90A2 might respond to heat stress and positively regulate thermotolerance by interacting with GmHsp90A1.","soybean","最も保存された豊富な分子シャペロンの1つである熱ショックタンパク質90s（Hsp90s）は、保護ストレス応答の重要な要素です。以前の研究では、ダイズのGmHsp90sファミリーに少なくとも12個の遺伝子があり、GmHsp90A2の過剰発現がシロイヌナズナの耐熱性を高めたことが報告されています。ここでは、GmHsp90A2を過剰発現する安定したトランスジェニック大豆系統とCRISPR / Cas9システムによって生成された変異系統を利用して、大豆におけるGmHsp90A2の役割を調査します。結果は、野生型植物（WT）および空のベクター対照植物（VC）と比較して、GmHsp90A2を過剰発現するT3トランスジェニック大豆植物は、植物のクロロフィルおよびマロンジアルデヒド（MDA）含有量が高いため、熱ストレスに対する耐性が高いことを示しました。逆に、T2ホモ接合型GmHsp90A2ノックアウト変異体のクロロフィルの減少とMDA含有量の増加は、熱ストレスに対する耐性の低下を示しました。GmHsp90A2は、酵母の2ハイブリッドアッセイでGmHsp90A1と相互作用することがわかりました。さらに、細胞内局在分析により、GmHsp90A2が細胞質および細胞膜に局在していることが明らかになりました。二分子蛍光相補性（BiFC）アッセイで示されるように、GmHsp90A2は核、細胞質、細胞膜でGmHsp90A1と相互作用しました。したがって、GmHsp90A1はGmHsp90A2に結合して複合体を形成することができ、この複合体は核に入ると結論付けます。要約すると、GmHsp90A2は熱ストレスに応答し、GmHsp90A1と相互作用することによって耐熱性を積極的に調節する可能性があります。"]
[232,31724182,"plant","soybean","CRISPR;","GmLCLa1; LCLa2; LCLb1; LCLb2","Plant, cell & environment","Light- and temperature-entrainable circadian clock in soybean development.",2019,null,"[Wang Y et al.]","Hebei Normal University, Shijiazhuang, China.",31724182,"10.1111/pce.13678 ","In plants, the spatiotemporal expression of circadian oscillators provides adaptive advantages in diverse species. However, the molecular basis of circadian clock in soybean is not known. In this study, we used soybean hairy roots expression system to monitor endogenous circadian rhythms and the sensitivity of  circadian clock to environmental stimuli. We discovered in experiments with constant light and temperature conditions that the promoters of clock genes GmLCLb2 and GmPRR9b1 drive a self-sustained, robust oscillation of about 24-h in  soybean hairy roots. Moreover, we demonstrate that circadian clock is entrainable by ambient light/dark or temperature cycles. Specifically, we show that light and cold temperature pulses can induce phase shifts of circadian rhythm, and we found that the magnitude and direction of phase responses depends on the specific time  of these two zeitgeber stimuli. We obtained a quadruple mutant lacking the soybean gene GmLCLa1, LCLa2, LCLb1, and LCLb2 using CRISPR, and found that loss-of-function of these four GmLCL orthologs leads to an extreme short-period circadian rhythm and late-flowering phenotype in transgenic soybean. Our study establishes that the morning-phased GmLCLs genes act constitutively to maintain circadian rhythmicity and demonstrates that their absence delays the transition from vegetative growth to reproductive development.","soybean","植物では、サーカディアンオシレーターの時空間的表現は、多様な種に適応的な利点を提供します。しかし、大豆のサーカディアンクロックの分子基盤は知られていない。この研究では、大豆毛根発現システムを使用して、内因性のサーカディアンリズムと環境刺激に対するサーカディアンクロックの感度を監視しました。一定の光と温度の条件での実験で、時計遺伝子GmLCLb2とGmPRR9b1のプロモーターが、ダイズの毛状根で約24時間の自立した強力な振動を駆動することを発見しました。さらに、サーカディアンクロックが周囲の明暗または温度サイクルによって同調可能であることを示します。具体的には、光と冷の温度パルスがサーカディアンリズムの位相シフトを誘発する可能性があることを示し、位相応答の大きさと方向がこれら2つのツァイトゲーバー刺激の特定の時間に依存することを発見しました。CRISPRを使用して大豆遺伝子GmLCLa1、LCLa2、LCLb1、およびLCLb2を欠く4重変異体を取得し、これら4つのGmLCLオルソログの機能喪失がトランスジェニック大豆の極端な短周期サーカディアンリズムと遅咲き表現型につながることを発見しました。私たちの研究は、朝期のGmLCLs遺伝子が構成的に作用してサーカディアンの律動性を維持することを確立し、それらの欠如が栄養成長から生殖発達への移行を遅らせることを示しています。"]
[233,31611562,"plant","soybean","CRISPR;Cas9;","CPR5","Scientific reports","Functional analysis and development of a CRISPR/Cas9 allelic series for a CPR5 ortholog necessary for proper growth of soybean trichomes.",2019,"9(1):14757","[Campbell BW  et al.]","University of Minnesota, St. Paul, MN, USA.",31611562,"10.1038/s41598-019-51240-7 ","Developments in genomic and genome editing technologies have facilitated the mapping, cloning, and validation of genetic variants underlying trait variation.  This study combined bulked-segregant analysis, array comparative genomic hybridization, and CRISPR/Cas9 methodologies to identify a CPR5 ortholog essential for proper trichome growth in soybean (Glycine max). A fast neutron mutant line exhibited short trichomes with smaller trichome nuclei compared to its parent line. A fast neutron-induced deletion was identified within an interval on chromosome 6 that co-segregated with the trichome phenotype. The deletion encompassed six gene models including an ortholog of Arabidopsis thaliana CPR5. CRISPR/Cas9 was used to mutate the CPR5 ortholog, resulting in five plants harboring a total of four different putative knockout alleles and two in-frame alleles. Phenotypic analysis of the mutants validated the candidate gene, and included intermediate phenotypes that co-segregated with the in-frame alleles. These findings demonstrate that the CPR5 ortholog is essential for proper growth and development of soybean trichomes, similar to observations in A. thaliana. Furthermore, this work demonstrates the value of using CRISPR/Cas9 to generate an allelic series and intermediate phenotypes for functional analysis of candidate genes and/or the development of novel traits.","soybean","ゲノムおよびゲノム編集技術の開発により、特性の変化の根底にある遺伝的変異のマッピング、クローニング、および検証が容易になりました。この研究では、バルク分離分析、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション、およびCRISPR / Cas9手法を組み合わせて、大豆（Glycine max）の適切な毛状突起の成長に不可欠なCPR5オルソログを特定しました。高速中性子変異株は、その親系統と比較して、より小さな毛状突起核を有する短い毛状突起を示した。トリコーム表現型と共分離した染色体6の間隔内で、高速中性子誘起欠失が確認されました。削除には、ArabidopsisthalianaCPR5のオルソログを含む6つの遺伝子モデルが含まれていました。CRISPR / Cas9を使用してCPR5オルソログを変異させ、合計4つの異なる推定ノックアウト対立遺伝子と2つのインフレーム対立遺伝子を含む5つの植物をもたらしました。変異体の表現型分析は候補遺伝子を検証し、インフレーム対立遺伝子と共分離した中間表現型を含んでいました。これらの発見は、A。thalianaでの観察と同様に、CPR5オルソログが大豆毛状突起の適切な成長と発達に不​​可欠であることを示しています。さらに、この作業は、CRISPR / Cas9を使用して、候補遺伝子の機能分析および/または新規特性の開発のための対立遺伝子系列および中間表現型を生成することの価値を示しています。"]
[234,31824524,"plant","soybean (cultivar Jack)","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","E1","Frontiers in plant science","Creation of Early Flowering Germplasm of Soybean by CRISPR/Cas9 Technology.",2019,"10:1446","[Han J et al.]","Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, China.",31824524,"10.3389/fpls.2019.01446 ","Soybean is an important economic crop and a typical short-day crop, sensitive to  photoperiod, and has narrow geographical adaptative region, which limit the creation of transgenic materials and reduce the breeding efficiency of new varieties. In addition, the genetic transformation efficiency of soybean is lower than that of many other crops, and the available receptor genotypes are limited.  In this study, Agrobacterium-mediated transformation were used to introduce the CRISPR/Cas9 expression vector into soybean cultivar Jack and generated targeted mutants of E1 gene controlling soybean flowering. We obtained two novel types of  mutations, 11 bp and 40 bp deletion at E1 coding region, respectively, and frameshift mutations produced premature translation termination codons and truncated E1 proteins, causing obvious early flowering under long day condition.  In addition, no off-target effects were observed by predicting and analyzing the  potential off-target sites of E1 targets. Significant decreased E1 gene expression of two novel mutants showed that the truncated E1 protein disinhibited GmFT2a/5a and increasing GmFT2a/5a gene expressions resulted obvious early flowering. Homozygous trans-clean mutants without T-DNA elements were also obtained and showed early flowering under long day condition. The photo-insensitive soybean transformation receptor we created laid a foundation for breeding excellent transgenic receptors suitable for high latitudes.","soybean","大豆は重要な経済作物であり、光周期に敏感な典型的な短日作物であり、地理的適応領域が狭いため、トランスジェニック材料の作成が制限され、新種の繁殖効率が低下します。さらに、大豆の遺伝的形質転換効率は他の多くの作物よりも低く、利用可能な受容体の遺伝子型は限られています。この研究では、アグロバクテリウムを介した形質転換を使用して、CRISPR / Cas9発現ベクターを大豆栽培品種ジャックに導入し、大豆の開花を制御するE1遺伝子の標的変異体を生成しました。E1コーディング領域でそれぞれ11bpと40bpの削除という、2つの新しいタイプの変異が得られ、フレームシフト変異は、早期の翻訳終了コドンと切り捨てられたE1タンパク質を生成し、長日条件下で明らかな早期開花を引き起こしました。さらに、E1ターゲットの潜在的なオフターゲットサイトを予測および分析しても、オフターゲット効果は観察されませんでした。2つの新規変異体のE1遺伝子発現の有意な減少は、短縮型E1タンパク質がGmFT2a / 5aを抑制解除し、GmFT2a / 5a遺伝子発現の増加が明らかな早期開花をもたらしたことを示しました。T-DNAエレメントを含まないホモ接合性のトランスクリーン変異体も得られ、長日条件下で早期開花を示した。私たちが作成した光非感受性ダイズ形質転換受容体は、高緯度に適した優れたトランスジェニック受容体を育種するための基礎を築きました。"]
[235,31068975,"plant","strawberry ( Fragaria vesca ssp. vesca 'Hawaii 4' and F. x ananassa 'Calypso')","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","phytoene desaturase","Plant methods","CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of phytoene desaturase in diploid and octoploid  strawberry.",2019,"15:45","[Wilson FM  et al.]","NIAB EMR, Kent, UK.",31068975,"10.1186/s13007-019-0428-6 ","Background: Gene editing using CRISPR/Cas9 is a simple and powerful tool for elucidating genetic controls and for crop improvement and its use has been reported in a growing number of important food crops, including recently Fragaria. In order to inform application of the technology in Fragaria, we targeted the visible endogenous marker gene PDS (phytoene desaturase) in diploid  Fragaria vesca ssp. vesca 'Hawaii 4' and octoploid F. x ananassa 'Calypso'. Results: Agrobacterium-mediated transformation of leaf and petiole explants was used for efficient stable integration of constructs expressing plant codon-optimised Cas9 and single guide sequences under control of the Arabidopsis  U6-26 consensus promoter and terminator or Fragaria vesca U6III regulatory sequences. More than 80% ('Hawaii 4') and 50% ('Calypso') putative transgenic shoot lines (multiple shoots derived from a single callus) exhibited mutant phenotypes. Of mutant shoot lines selected for molecular analysis, approximately  75% ('Hawaii 4') and 55% ('Calypso') included albino regenerants with bi-allelic  target sequence variants. Our results indicate the PDS gene is functionally diploid in 'Calypso'. Conclusion: We demonstrate that CRISPR/Cas9 may be used to  generate biallelic mutants at high frequency within the genomes of diploid and octoploid strawberry. The methodology, observations and comprehensive data set presented will facilitate routine application of this technology in Fragaria to single and multiple gene copy targets where mutant phenotypes cannot be identified visually.","strawberry","背景：CRISPR / Cas9を使用した遺伝子編集は、遺伝的制御を解明し、作物を改善するためのシンプルで強力なツールであり、最近のFragariaを含む、ますます多くの重要な食用作物でその使用が報告されています。Fragariaでの技術の応用を知らせるために、二倍体Fragaria vesca sspの目に見える内因性マーカー遺伝子PDS（フィトエンデサチュラーゼ）をターゲットにしました。vesca'Hawaii4 'および八倍体F.xananassa'Calypso'。結果：アグロバクテリウムを介した葉とペティオールの外植片の形質転換を使用して、ArabidopsisU6-26コンセンサスプロモーターおよびターミネーターまたはFragariavescaU6III調節配列の制御下で植物コドン最適化Cas9および単一ガイド配列を発現する構築物の効率的で安定した統合を行いました。80％（「ハワイ4」）および50％（「カリプソ」）の推定トランスジェニックシュートライン（単一のカルスに由来する複数のシュート）が変異表現型を示した。分子分析のために選択された変異シュートラインのうち、約75％（「ハワイ4」）と55％（「カリプソ」）には、バイアレリックターゲット配列バリアントを持つアルビノ再生剤が含まれていました。我々の結果は、PDS遺伝子が「カリプソ」において機能的に二倍体であることを示している。結論：CRISPR / Cas9を使用して、二倍体および八倍体のイチゴのゲノム内で高頻度で二対立遺伝子変異体を生成できることを示します。提示された方法論、観察、および包括的なデータセットは、変異体の表現型を視覚的に識別できない単一および複数の遺伝子コピーターゲットへのフラガリアでのこの技術の日常的な適用を容易にします。"]
[236,31845477,"plant","strawberry (Fragaria vesca)","CRISPR;Cas9;","Reduced Anthocyanins in Petioles","Plant biotechnology journal","Genetic modulation of RAP alters fruit coloration in both wild and cultivated strawberry.",2019,null,"[Gao Q et al.]","Huazhong Agricultural University, Wuhan, China.",31845477,"10.1111/pbi.13317 ","Fruit colour affects consumer preference and is an important trait for breeding in strawberry. Previously, we isolated the Reduced Anthocyanins in Petioles (RAP) gene encoding a glutathione S-transferase (GST) that binds anthocyanins to facilitate their transport from cytosol to vacuole in the diploid strawberry Fragaria vesca. The parent of rap was the F. vesca variety 'Yellow Wonder' that develops white fruit due to a natural mutation in the FveMYB10 gene. Here, we investigated the application potential of RAP in modulating fruit colours by overexpression of RAP in F. vesca and knockout of RAP in the cultivated strawberry Fragaria x ananassa. Unexpectedly, the RAP overexpression in Yellow Wonder background caused formation of red fruit. In addition, the red coloration  occurs precociously at floral stage 10 and continues in the receptacle during early fruit development. Transcriptome analysis revealed that the anthocyanin biosynthesis genes were not up-regulated in RAP-ox; rap myb10 flowers at anthesis and largely inhibited at the turning stage in fruit, suggesting a coloration mechanism independent of FveMYB10. Moreover, we used CRISPR/Cas9 to knockout RAP  in cultivated strawberry which is octoploid. Six copies of RAP were simultaneously knocked out in the T0 generation leading to the green stem and white-fruited phenotype. Several T1 progeny have segregated away the CRISPR/Cas9  transgene but maintain the green stem trait. Our results indicate that enhancing  the anthocyanin transport could redirect the metabolic flux from proanthocyanidin to anthocyanin production at early developmental stages of fruit and that RAP is  one promising candidate gene in fruit colour breeding of strawberry.","strawberry","果物の色は消費者の好みに影響を与え、イチゴの繁殖にとって重要な特徴です。以前に、アントシアニンに結合して二倍体イチゴFragaria vescaのサイトゾルから空胞への輸送を促進するグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）をコードするPetiolesのReduced Anthasianins（RAP）遺伝子を単離しました。ラップの親は、FveMYB10遺伝子の自然突然変異により白い果実を発達させるF.vesca品種「YellowWonder」でした。ここでは、F。vescaでのRAPの過剰発現と、栽培イチゴFragaria x ananassaでのRAPのノックアウトにより、果実の色を調節するRAPの応用可能性を調査しました。予期せぬことに、イエローワンダーバックグラウンドでのRAPの過剰発現は赤い果実の形成を引き起こしました。さらに、赤色の着色は花の段階10で早熟に発生し、初期の果実の発達中にレセプタクルで継続します。トランスクリプトーム分析により、アントシアニン生合成遺伝子がRAP-oxでアップレギュレートされていないことが明らかになりました。myb10の花を麻酔でラップし、果物の回転段階で大部分が抑制され、FveMYB10とは独立した着色メカニズムを示唆しています。さらに、CRISPR / Cas9を使用して、八倍体である栽培イチゴのRAPをノックアウトしました。RAPの6つのコピーがT0世代で同時にノックアウトされ、緑色の茎と白い果実の表現型になりました。いくつかのT1子孫は、CRISPR / Cas9導入遺伝子を分離しましたが、緑色の茎の特性を維持しています。我々の結果は、アントシアニン輸送の増強が、果実の初期発達段階での代謝フラックスをプロアントシアニジンからアントシアニン産生に向け直す可能性があり、RAPがイチゴの果実色育種における1つの有望な候補遺伝子であることを示している。"]
[237,31881835,"plant","strawberry (Fragaria x ananassa)","Agroinfiltration;","FaPRE1","BMC plant biology","An atypical HLH transcriptional regulator plays a novel and important role in strawberry ripened receptacle.",2019,"19(1):586","[Medina-Puche L et al.]","Universidad de Cordoba, Cordoba, Spain.",31881835,"10.1186/s12870-019-2092-4 ","BACKGROUND: In soft fruits, the differential expression of many genes during development and ripening is responsible for changing their organoleptic properties. In strawberry fruit, although some genes involved in the metabolic regulation of the ripening process have been functionally characterized, some of  the most studied genes correspond to transcription factors. High throughput transcriptomics analyses performed in strawberry red receptacle (Fragaria x ananassa) allowed us to identify a ripening-related gene that codes an atypical HLH (FaPRE1) with high sequence homology with the PACLOBUTRAZOL RESISTANCE (PRE)  genes. PRE genes are atypical bHLH proteins characterized by the lack of a DNA-binding domain and whose function has been linked to the regulation of cell elongation processes. RESULTS: FaPRE1 sequence analysis indicates that this gene  belongs to the subfamily of atypical bHLHs that also includes ILI-1 from rice, SlPRE2 from tomato and AtPRE1 from Arabidopsis, which are involved in transcriptional regulatory processes as repressors, through the blockage by heterodimerization of bHLH transcription factors. FaPRE1 presented a transcriptional model characteristic of a ripening-related gene with receptacle-specific expression, being repressed by auxins and activated by abscisic acid (ABA). However, its expression was not affected by gibberellic acid (GA3). On the other hand, the transitory silencing of FaPRE1 transcription by agroinfiltration in receptacle produced the down-regulation of a group of genes related to the ripening process while inducing the transcription of genes involved in receptacle growth and development. CONCLUSIONS: In summary, this work presents for the first time experimental data that support an important novel function for the atypical HLH FaPRE1 during the strawberry fruit ripening. We hypothesize that FaPRE1 modulates antagonistically the transcription of genes related to both receptacle growth and ripening. Thus, FaPRE1 would repress the expression of receptacle growth promoting genes in the ripened receptacle, while  it would activate the expression of those genes related to the receptacle ripening process.","strawberry","背景：柔らかい果物では、発達中および熟成中の多くの遺伝子の差次的発現が、それらの官能特性の変化に関与しています。イチゴ果実では、熟成過程の代謝調節に関与するいくつかの遺伝子が機能的に特徴付けられていますが、最も研究されている遺伝子のいくつかは転写因子に対応しています。ストロベリーレッドレセプタクル（Fragaria x ananassa）で実行されたハイスループットトランスクリプトミクス分析により、PACLOBUTRAZOL RESISTANCE（PRE）遺伝子と高い配列相同性を持つ非定型HLH（FaPRE1）をコードする熟成関連遺伝子を特定することができました。PRE遺伝子は、DNA結合ドメインの欠如を特徴とし、その機能が細胞伸長プロセスの調節に関連している非定型のbHLHタンパク質です。結果：FaPRE1配列分析は、この遺伝子が非定型bHLHのサブファミリーに属し、bHLHのヘテロ二量体化による遮断を通じて、リプレッサーとして転写調節プロセスに関与する、米由来のILI-1、トマト由来のSlPRE2、およびアラビドプシス由来のAtPRE1を含むことを示しています。転写因子。FaPRE1は、レセプタクル特異的発現を伴う成熟関連遺伝子に特徴的な転写モデルを示し、オーキシンによって抑制され、アブシジン酸（ABA）によって活性化されました。ただし、その発現はジベレリン酸（GA3）の影響を受けませんでした。一方、レセプタクルでのアグロインフィルトレーションによるFaPRE1転写の一時的なサイレンシングは、レセプタクルの成長と発達に関与する遺伝子の転写を誘導しながら、熟成プロセスに関連する遺伝子グループのダウンレギュレーションを引き起こしました。結論：要約すると、この作業は、イチゴ果実の熟成中の非定型HLHFaPRE1の重要な新規機能をサポートする実験データを初めて提示します。FaPRE1は、レセプタクルの成長と熟成の両方に関連する遺伝子の転写を拮抗的に調節すると仮定します。したがって、FaPRE1は、成熟したレセプタクル内のレセプタクル成長促進遺伝子の発現を抑制し、レセプタクルの成熟プロセスに関連する遺伝子の発現を活性化します。"]
[238,30428077,"plant","strawberry (Fragaria x ananassa)","CRISPR;Cas9;","MADS-box gene TM6","Journal of experimental botany","Functional analysis of the TM6 MADS-box gene in the octoploid strawberry by CRISPR/Cas9-directed mutagenesis.",2019,"70(3):885-895","[Martin-Pizarro C et al.]","Universidad de Malaga-Consejo Superior de Investigaciones Cientificas, Malaga, Spain.",30428077,"10.1093/jxb/ery400 ","The B-class of MADS-box transcription factors has been studied in many plant species, but remains functionally uncharacterized in Rosaceae. APETALA3 (AP3), a  member of this class, controls petal and stamen identities in Arabidopsis. In this study, we identified two members of the AP3 lineage in cultivated strawberry, Fragaria x ananassa, namely FaAP3 and FaTM6. FaTM6, and not FaAP3, showed an expression pattern equivalent to that of AP3 in Arabidopsis. We used the CRISPR/Cas9 genome editing system for the first time in an octoploid species  to characterize the function of TM6 in strawberry flower development. An analysis by high-throughput sequencing of the FaTM6 locus spanning the target sites showed highly efficient genome editing already present in the T0 generation. Phenotypic  characterization of the mutant lines indicated that FaTM6 plays a key role in anther development in strawberry. Our results validate the use of the CRISPR/Cas9 system for gene functional analysis in F. x ananassa as an octoploid species, and offer new opportunities for engineering strawberry to improve traits of interest  in breeding programs.","strawberry","MADSボックス転写因子のBクラスは多くの植物種で研究されてきましたが、ロザス科では機能的に特徴づけられていません。このクラスのメンバーであるAPETALA3（AP3）は、アラビドプシスの花弁と雄しべのアイデンティティを制御します。この研究では、栽培イチゴのAP3系統の2つのメンバー、Fragaria x ananassa、つまりFaAP3とFaTM6を特定しました。FaAP3ではなくFaTM6は、ArabidopsisのAP3と同等の発現パターンを示しました。イチゴの花の発達におけるTM6の機能を特徴づけるために、八倍体種で初めてCRISPR / Cas9ゲノム編集システムを使用しました。標的部位にまたがるFaTM6遺伝子座のハイスループットシーケンシングによる分析は、T0世代にすでに存在する非常に効率的なゲノム編集を示しました。変異株の表現型の特徴は、FaTM6がイチゴの葯の発達に重要な役割を果たすことを示した。私たちの結果は、八倍体種としてのF. xananassaの遺伝子機能分析のためのCRISPR / Cas9システムの使用を検証し、育種プログラムで関心のある特性を改善するためにイチゴを設計するための新しい機会を提供します。"]
[239,30371880,"plant","wild strawberry (Fragaria vesca)","CRISPR;","FveYUC10","Journal of experimental botany","Reporter gene expression reveals precise auxin synthesis sites during fruit and root development in wild strawberry.",2019,"70(2):563-574","[Feng J et al.]","Huazhong Agricultural University, Wuhan, China.",30371880,"10.1093/jxb/ery384 ","The critical role of auxin in strawberry fruit set and receptacle enlargement was demonstrated previously. While fertilization is known to trigger auxin biosynthesis, the specific tissue source of fertilization-induced auxin is not well understood. Here, the auxin reporter DR5ver2::GUS was introduced into wild strawberry (Fragaria vesca) to reveal auxin distribution in the seed and fruit receptacle pre- and post-fertilization as well as in the root. In addition, the expression of TAR and YUCCA genes coding for enzymes catalysing the two-step auxin biosynthesis pathway was investigated using their respective promoters fused to the beta-glucuronidase (GUS) reporter. Two FveTARs and four FveYUCs were shown to be expressed primarily in the endosperm and embryo inside the achenes as well as in root tips and lateral root primordia. Expression of these reporters in dissected tissues provided more detailed and precise spatial (cell and tissue) and temporal (pre- and post-fertilization) information on where auxin is synthesized and accumulates than previous studies in strawberry. Moreover, we generated CRISPR-mediated knock-out mutants of FveYUC10, the most abundant YUC in seeds; the mutants had a lower free auxin level in young fruit, but displayed no  obvious morphological phenotypes. However, overexpression of FveYUC10 resulted in elongated hypocotyls in Arabidopsis caused by elevated auxin level. Overall, the  study revealed auxin accumulation in the chalazal seed coat, embryo, receptacle vasculature, root tip, and lateral root primordia and highlighted the endosperm as the main auxin biosynthesis site for fruit set.","strawberry","イチゴのフルーツセットとレセプタクルの拡大におけるオーキシンの重要な役割は、以前に実証されました。施肥はオーキシン生合成を誘発することが知られていますが、施肥によって誘発されるオーキシンの特定の組織源はよく理解されていません。ここでは、オーキシンレポーターDR5ver2 :: GUSが野生のイチゴ（Fragaria vesca）に導入され、受精前後の種子と果実のレセプタクル、および根におけるオーキシンの分布が明らかになりました。さらに、2段階のオーキシン生合成経路を触媒する酵素をコードするTARおよびYUCCA遺伝子の発現を、ベータグルクロニダーゼ（GUS）レポーターに融合したそれぞれのプロモーターを使用して調査しました。2つのFveTARと4つのFveYUCは、主にアケネス内の内胚葉と胚、ならびに根端と外側根原始で発現することが示されました。解剖された組織におけるこれらのレポーターの発現は、イチゴにおける以前の研究よりも、オーキシンが合成され蓄積される場所に関するより詳細で正確な空間的（細胞および組織）および時間的（受精前および受精後）情報を提供した。さらに、種子に最も豊富なYUCであるFveYUC10のCRISPRを介したノックアウト変異体を生成しました。変異体は若い果実の遊離オーキシンレベルが低かったが、明らかな形態学的表現型を示さなかった。ただし、FveYUC10の過剰発現は、オーキシンレベルの上昇によって引き起こされるシロイヌナズナの胚軸の伸長をもたらしました。全体として、この研究は、カラザール種皮、胚、レセプタクル血管系、根端、および側根原始におけるオーキシンの蓄積を明らかにし、フルーツセットの主要なオーキシン生合成部位として内胚葉を強調した。"]
[240,31547486,"plant","sweet potato (Ipomoea batatas)","CRISPR;Cas9;"," IbGBSSI (encoding granule-bound  starch synthase I); IbSBEII (encoding starch branching enzyme II)","International journal of molecular sciences","CRISPR/Cas9-Based Mutagenesis of Starch Biosynthetic Genes in Sweet Potato (Ipomoea Batatas) for the Improvement of Starch Quality.",2019,"20(19)","[Wang H  et al.]","Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Science, Shanghai,  China.",31547486,"10.3390/ijms20194702 ","CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful technology that has been used for the genetic modification of a number of crop species. In order to evaluate the efficacy of CRISPR/Cas9 technology in the root crop, sweet potato (Ipomoea batatas), two starch biosynthetic pathway genes, IbGBSSI (encoding granule-bound  starch synthase I), and IbSBEII (encoding starch branching enzyme II), were targeted in the starch-type cultivar Xushu22 and carotenoid-rich cultivar Taizhong6. I. batatas was transformed using a binary vector, in which the Cas9 gene is driven by the Arabidopsis AtUBQ promoter and the guide RNA is controlled  by the Arabidopsis AtU6 promoter. A total of 72 Xushu22 and 35 Taizhong6 transgenic lines were generated and analyzed for mutations. The mutation efficiency was 62-92% with multi-allelic mutations in both cultivars. Most of the mutations were nucleotide substitutions that lead to amino acid changes and, less frequently, stop codons. In addition, short nucleotide insertions or deletions were also found in both IbGBSSI and IbSBEII. Furthermore, a 2658 bp deletion was  found in one IbSBEII transgenic line. The total starch contents were not significantly changed in IbGBSSI- and IbSBEII-knockout transgenic lines compared  to the wild-type control. However, in the allopolyploid sweet potato, the IbGBSSI-knockout reduced, while the IbSBEII-knockout increased, the amylose percentage. Our results demonstrate that CRISPR/Cas9 technology is an effective tool for the improvement of starch qualities in sweet potato and breeding of polyploid root crops.","sweet potato (Ipomoea batatas)","CRISPR / Cas9を介したゲノム編集は、多くの作物種の遺伝子改変に使用されてきた強力な技術です。根菜類におけるCRISPR / Cas9技術の有効性を評価するために、スイートポテト（Ipomoea batatas）、2つのデンプン生合成経路遺伝子、IbGBSSI（顆粒結合デンプンシンターゼIをコードする）、およびIbSBEII（デンプン分岐酵素IIをコードする）、でんぷん型の品種Xushu22とカロテノイドが豊富な品種Taizhong6を対象とした。I. batatasは、Cas9遺伝子がArabidopsis AtUBQプロモーターによって駆動され、ガイドRNAがArabidopsisAtU6プロモーターによって制御されるバイナリベクターを使用して変換されました。合計72のXushu22および35のTaizhong6トランスジェニック系統が生成され、変異について分析されました。突然変異効率は62-92％で、両方の栽培品種に多対立遺伝子突然変異がありました。突然変異のほとんどは、アミノ酸の変化をもたらし、頻度は低いがコドンを停止させるヌクレオチド置換でした。さらに、短いヌクレオチドの挿入または削除もIbGBSSIとIbSBEIIの両方で見つかりました。さらに、2658bpの欠失が1つのIbSBEIIトランスジェニック系統で発見されました。総デンプン含有量は、野生型対照と比較して、IbGBSSIおよびIbSBEIIノックアウトトランスジェニック系統において有意に変化しなかった。しかし、同種倍数体のサツマイモでは、IbGBSSIノックアウトが減少し、IbSBEIIノックアウトが増加してアミロースの割合が増加しました。私たちの結果は、CRISPR / Cas9テクノロジーがスイートポテトのデンプン品質の改善と倍数体根作物の育種のための効果的なツールであることを示しています。"]
[241,31502079,"plant","Nicotiana benthamiana","Agroinfiltration;","RNA1 (RdRp, p22) and RNA2 (CP, CPm and p26) of cucurbit chlorotic  yellows virus","Archives of virology","Cucurbit chlorotic yellows virus p22 is a suppressor of local RNA silencing.",2019,"164(11):2747-2759","[Orfanidou CG et al.]","Aristotle University of Thessaloniki, Thessaloniki, Greece.",31502079,"10.1007/s00705-019-04391-x ","RNA silencing is a major antiviral mechanism in plants, which is counteracted by  virus-encoded proteins with silencing suppression activity. ORFs encoding putative silencing suppressor proteins that share no structural or sequence homology have been identified in the genomes of four criniviruses. In this study, we investigated the RNA silencing suppression activity of several proteins encoded by the RNA1 (RdRp, p22) and RNA2 (CP, CPm and p26) of cucurbit chlorotic  yellows virus (CCYV) using co-agroinfiltration assays on Nicotiana benthamiana plants. Our results indicate that p22 is a suppressor of local RNA silencing that does not interfere with cell-to-cell movement of the RNA silencing signal or with systemic silencing. Furthermore, comparisons of the suppression activity of CCYV  p22 with that of two other well-known crinivirus suppressors (CYSDV p25 and ToCV  p22) revealed that CCYV p22 is a weaker suppressor of local RNA silencing than the other two proteins. Finally, a comparative sequence analysis of the p22 genes of seven Greek CCYV isolates was performed, revealing a high level of conservation. Taken together, our research advances our knowledge about plant-virus interactions of criniviruses, an emergent group of pathogens that threatens global agriculture.","tobacco","RNAサイレンシングは、植物の主要な抗ウイルスメカニズムであり、サイレンシング抑制活性を持つウイルスにコードされたタンパク質によって打ち消されます。構造的または配列的相同性を共有しない推定サイレンシングサプレッサータンパク質をコードするORFが、4つのクリニウイルスのゲノムで同定されています。この研究では、ニコチアナ・ベンタミアナ植物の共アグロ浸潤アッセイを使用して、キュウリクロロティックイエローウイルス（CCYV）のRNA1（RdRp、p22）およびRNA2（CP、CPmおよびp26）によってコードされるいくつかのタンパク質のRNAサイレンシング抑制活性を調査しました。我々の結果は、p22がRNAサイレンシングシグナルの細胞間移動または全身サイレンシングを妨害しない局所RNAサイレンシングのサプレッサーであることを示しています。さらに、CCYV p22の抑制活性を他の2つのよく知られたクリニウイルスサプレッサー（CYSDVp25およびToCVp22）の抑制活性と比較すると、CCYVp22は他の2つのタンパク質よりも局所RNAサイレンシングのサプレッサーとして弱いことが明らかになりました。最後に、7つのギリシャのCCYV分離株のp22遺伝子の比較配列分析が行われ、高レベルの保存が明らかになりました。まとめると、私たちの研究は、世界の農業を脅かす病原体の新たなグループであるクリニウイルスの植物とウイルスの相互作用に関する知識を進歩させます。"]
[242,30488669,"plant","Nicotiana benthamiana","agroinfiltration","chimaeric RVFV virus-like particles","Biotechnology journal","Chimaeric Rift Valley Fever Virus-Like Particle Vaccine Candidate Production in Nicotiana benthamiana.",2019,"14(4):e1800238","[Mbewana S et al.]","University of Cape Town, Cape Town, South Africa.",30488669,"10.1002/biot.201800238 ","Rift Valley fever virus (RVFV) is an emerging mosquito-borne virus and hemorrhagic fever agent, which causes abortion storms in farmed small ruminants and potentially causes miscarriages in humans. Although live-attenuated vaccines  are available for animals, they can only be used in endemic areas and there are currently no commercially available vaccines for humans. Here the authors describe the production of chimaeric RVFV virus-like particles transiently expressed in Nicotiana benthamiana by Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer. The glycoprotein (Gn) gene is modified by removing its ectodomain (Gne) and fusing it to the transmembrane domain and cytosolic tail-encoding region of avian influenza H5N1 hemagglutinin. This is expressed transiently in N. benthamiana with purified protein yields calculated to be approximately 57 mg kg(-1) fresh weight. Transmission electron microscopy shows putative chimaeric RVFV Gne-HA particles of 49-60 nm which are immunogenic, eliciting Gn-specific antibody responses in vaccinated mice without the use of adjuvant. To our knowledge, this is the first demonstration of the synthesis of Gne-HA chimaeric RVFV VLPs and the first demonstration of a detectable yield of RVFV Gn in plants.","tobacco","リフトバレーフィーバーウイルス（RVFV）は、蚊が媒介するウイルスおよび出血性の発熱物質であり、養殖された小さな反芻動物に流産の嵐を引き起こし、人間に流産を引き起こす可能性があります。動物用の弱毒生ワクチンは入手可能ですが、流行地域でのみ使用でき、現在、ヒト用の市販のワクチンはありません。ここで著者らは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介した遺伝子導入により、ニコチアナ・ベンサミアナタバコで一過性に発現するキメラRVFVウイルス様粒子の産生について説明します。糖タンパク質（Gn）遺伝子は、その外部ドメイン（Gne）を除去し、鳥類インフルエンザH5N1血球凝集素の膜貫通ドメインおよびサイトゾルテールをコードする領域に融合することによって修飾されます。これはN.ベンタミアナで一過性に発現し、精製タンパク質の収量は約57 mg kg（-1）新鮮重量と計算されます。透過型電子顕微鏡は、免疫原性であり、アジュバントを使用せずにワクチン接種されたマウスでGn特異的抗体応答を誘発する49〜60nmの推定キメラRVFVGne-HA粒子を示しています。私たちの知る限り、これはGne-HAキメラRVFV VLPの合成の最初のデモンストレーションであり、植物におけるRVFVGnの検出可能な収量の最初のデモンストレーションです。"]
[243,31208390,"plant","Nicotiana benthamiana","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","NbPDS; NbRRA","BMC biotechnology","Improved CRISPR/Cas9 gene editing by fluorescence activated cell sorting of green fluorescence protein tagged protoplasts.",2019,"19(1):36","[Petersen BL  et al.]","University of Copenhagen, Frederiksberg, Denmark.",31208390,"10.1186/s12896-019-0530-x ","BACKGROUND: CRISPR/Cas9 is widely used for precise genetic editing in various organisms. CRISPR/Cas9 editing may in many plants be hampered by the presence of  complex and high ploidy genomes and inefficient or poorly controlled delivery of  the CRISPR/Cas9 components to gamete cells or cells with regenerative potential.  Optimized strategies and methods to overcome these challenges are therefore in demand. RESULTS: In this study we investigated the feasibility of improving CRISPR/Cas9 editing efficiency by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of protoplasts. We used Agrobacterium infiltration in leaves of Nicotiana benthamiana for delivery of viral replicons for high level expression of gRNAs designed to target two loci in the genome, NbPDS and NbRRA, together with the Cas9 nuclease in fusion with the 2A self-splicing sequence and GFP (Cas9-2A-GFP). Protoplasts isolated from the infiltrated leaves were then subjected to FACS for  selection of GFP enriched protoplast populations. This procedure resulted in a 3-5 fold (from 20 to 30% in unsorted to more than 80% in sorted) increase in mutation frequencies as evidenced by restriction enzyme analysis and the Indel Detection by Amplicon Analysis, which allows for high throughput profiling and quantification of the generated mutations. CONCLUSIONS: FACS of protoplasts expressing GFP tagged CRISPR/Cas9, delivered through A. tumefaciens leaf infiltration, facilitated clear CRISPR/Cas9 mediated mutation enrichment in selected protoplast populations.","tobacco","背景：CRISPR / Cas9は、さまざまな生物の正確な遺伝子編集に広く使用されています。CRISPR / Cas9の編集は、多くの植物で、複雑で高倍数性のゲノムの存在と、配偶子母細胞または再生能力のある細胞へのCRISPR / Cas9コンポーネントの非効率的または制御不良の送達によって妨げられる可能性があります。したがって、これらの課題を克服するための最適化された戦略と方法が求められています。結果：この研究では、プロトプラストの蛍光活性化セルソーティング（FACS）によってCRISPR / Cas9編集効率を改善する可能性を調査しました。2A自己スプライシング配列およびGFPと融合したCas9ヌクレアーゼとともに、ゲノム内の2つの遺伝子座、NbPDSおよびNbRRAを標的とするように設計されたgRNAの高レベル発現のためのウイルスレプリコンの送達のために、ニコチアナベンタミアナの葉へのアグロバクテリウム浸潤を使用しました（ Cas9-2A-GFP）。次に、浸潤した葉から単離されたプロトプラストを、ＧＦＰに富むプロトプラスト集団の選択のためにＦＡＣＳに供した。この手順により、制限酵素分析とアンプリコン分析によるインデル検出によって証明されるように、変異頻度が3〜5倍（未分類で20〜30％から分類済みで80％以上）増加しました。これにより、ハイスループットプロファイリングと生成された突然変異の定量化。結論：A。tumefaciensの葉の浸潤を介して配信されたGFPタグ付きCRISPR / Cas9を発現するプロトプラストのFACSは、選択されたプロトプラスト集団における明確なCRISPR / Cas9を介した変異濃縮を促進しました。"]
[244,30642254,"plant","Nicotiana benthamiana","RdDM;","green fluorescent protein (GFP)","BMC plant biology","Transcriptional silencing of 35S driven-transgene is differentially determined depending on promoter methylation heterogeneity at specific cytosines in both plus- and minus-sense strands.",2019,"19(1):24","[Matsunaga W et al.]","Hokkaido University, Sapporo, Japan.",30642254,"10.1186/s12870-019-1628-y ","BACKGROUND: De novo DNA methylation triggered by short interfering RNAs is called RNA-directed DNA methylation (RdDM). Transcriptional gene silencing (TGS) through RdDM can be induced using a viral vector. We have previously induced RdDM on the  35S promoter in the green fluorescent protein (GFP)-expressing Nicotiana benthamiana line 16c using the cucumber mosaic virus vector. The GFP fluorescence phenotype segregated into two types, \"red\" and \"orange\" in the first self-fertilized (S1) progeny plants by the difference in degree of recovery from  TGS on GFP expression. In the second self-fertilized generation (S2 plants), the  phenotypes again segregated. Explaining what generates the red and orange types could answer a very important question in epigenetics: How is the robustness of TGS maintained after RdDM induction? RESULTS: In bisulfite sequencing analyses, we found a significant difference in the overall promoter hypermethylation pattern between the red and orange types in S1 plants but little difference in S2 plants. Therefore, we assumed that methylation at some specific cytosine residues might be important in determining the two phenotypes. To find the factor that discriminates stable, robust TGS from the unstable TGS with incomplete inheritance, we analyzed the direct effect of methylated cytosine residues on TGS. Because it has not yet been demonstrated that DNA methylation at a few specific cytosine residues on known sequence elements can indeed determine TGS robustness, we newly developed a method by which we can directly evaluate the effect of specific methylation on promoter activity. In this assay, we found that the effects of the specific cytosine methylation on TGS differed between the plus- and minus-strands. CONCLUSIONS: We found two distinct phenotypes, the stable and unstable TGS in the progenies of virus-induced TGS plants. Our bisulfite sequencing analyses suggested that methylation at some specific cytosine residues in the 35S promoter played a role in determining whether stable or unstable TGSs are induced. Using the developed method, we inferred that DNA methylation heterogeneity in and between the plus- and minus-strands can differentially determine TGS.","tobacco","背景：短い干渉RNAによって引き起こされるdenovo DNAメチル化は、RNA指令DNAメチル化（RdDM）と呼ばれます。RdDMを介した転写遺伝子サイレンシング（TGS）は、ウイルスベクターを使用して誘導できます。我々は以前、キュウリモザイクウイルスベクターを使用して、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するニコチアナベンタミアナ系統16cの35SプロモーターにRdDMを誘導しました。GFP蛍光表現型は、GFP発現時のTGSからの回復度の違いにより、最初の自家受精（S1）子孫植物で「赤」と「オレンジ」の2つのタイプに分離されました。第二の自家受精世代（S2植物）では、表現型は再び分離しました。赤とオレンジのタイプを生成するものを説明することで、エピジェネティクスにおける非常に重要な質問に答えることができます。RdDM誘導後にTGSの堅牢性はどのように維持されますか？結果：バイサルファイトシーケンシング分析では、S1植物では赤とオレンジのタイプ間で全体的なプロモーターの高メチル化パターンに有意差が見られましたが、S2植物ではほとんど違いがありませんでした。したがって、特定のシトシン残基でのメチル化が2つの表現型を決定する上で重要である可能性があると想定しました。安定した堅牢なTGSと不完全な継承を持つ不安定なTGSを区別する要因を見つけるために、TGSに対するメチル化シトシン残基の直接的な影響を分析しました。既知の配列要素上のいくつかの特定のシトシン残基でのDNAメチル化が実際にTGSの堅牢性を決定できることはまだ実証されていないため、プロモーター活性に対する特定のメチル化の影響を直接評価できる方法を新たに開発しました。このアッセイでは、TGSに対する特定のシトシンメチル化の影響がプラス鎖とマイナス鎖で異なることがわかりました。結論：ウイルス誘発TGS植物の子孫において、安定したTGSと不安定なTGSという2つの異なる表現型が見つかりました。私たちのバイサルファイトシーケンシング分析は、35Sプロモーターのいくつかの特定のシトシン残基でのメチル化が、安定または不安定なTGSが誘導されるかどうかを決定する上で役割を果たすことを示唆しました。開発された方法を使用して、プラス鎖とマイナス鎖の間のDNAメチル化の不均一性がTGSを差別的に決定できると推測しました。"]
[245,31354650,"plant","Nicotiana benthamiana","Agroinfiltration;","Plasmopara viticola RxLR effector, PvAvh74","Frontiers in microbiology","The Nuclear-Localized RxLR Effector PvAvh74 From Plasmopara viticola Induces Cell Death and Immunity Responses in Nicotiana benthamiana.",2019,"10:1531","[Yin X et al.]","Northwest A&F University, Yangling, China.",31354650,"10.3389/fmicb.2019.01531 ","Downy mildew is one of the most serious diseases of grapevine (Vitis spp). The causal agent of grapevine downy mildew, Plasmopara viticola, is an obligate biotrophic oomycete. Although oomycete pathogens such as P. viticola are known to secrete RxLR effectors to manipulate host immunity, there have been few studies of the associated mechanisms by which these may act. Here, we show that a candidate P. viticola RxLR effector, PvAvh74, induces cell death in Nicotiana benthamiana leaves. Using agroinfiltration, we found that nuclear localization, two putative N-glycosylation sites, and 427 amino acids of the PvAvh74 carboxyl terminus were necessary for cell-death-inducing activity. Using virus-induced gene silencing (VIGS), we found that PvAvh74-induced cell death in N. benthamiana requires EDS1, NDR1, SGT1, RAR1, and HSP90, but not BAK1. The MAPK cascade components MEK2, WIPK, and SIPK were also involved in PvAvh74-induced cell death  in N. benthamiana. Transient expression of PvAvh74 could suppress Phytophthora capsici colonization of N. benthamiana, which suggests that PvAvh74 elicits plant immune responses. Suppression of P. capsici colonization also was dependent on nuclear localization of PvAvh74. Additionally, PvAvh74-triggered cell death could be suppressed by another effector, PvAvh8, from the same isolate. This work provides a framework to further investigate the interactions of PvAvh74 and other RxLR effectors with host immunity.","tobacco","ダウニーカビはブドウの木（Vitis spp）の最も深刻な病気の1つです。グレープバインダウニーカビの原因物質であるPlasmoparaviticolaは、必須の生物栄養性卵菌です。P. viticolaなどの卵菌病原体はRxLRエフェクターを分泌して宿主免疫を操作することが知られていますが、これらが作用する可能性のある関連メカニズムの研究はほとんどありません。ここでは、候補のP. viticolaRxLRエフェクターであるPvAvh74がNicotianabenthamianaの葉の細胞死を誘発することを示します。アグロインフィルトレーションを使用して、核局在化、2つの推定N-グリコシル化部位、およびPvAvh74カルボキシル末端の427アミノ酸が細胞死誘導活性に必要であることを発見しました。ウイルス誘発性遺伝子サイレンシング（VIGS）を使用して、N。ベンタミアナにおけるPvAvh74誘発性細胞死には、EDS1、NDR1、SGT1、RAR1、およびHSP90が必要であるが、BAK1は必要ないことがわかりました。MAPKカスケードコンポーネントMEK2、WIPK、およびSIPKは、ベンサミアナタバコのPvAvh74による細胞死にも関与していました。PvAvh74の一過性発現は、N。ベンタミアナのPhytophthora capsiciコロニー形成を抑制する可能性があり、これは、PvAvh74が植物の免疫応答を誘発することを示唆しています。P. capsiciのコロニー形成の抑制も、PvAvh74の核内局在に依存していた。さらに、PvAvh74によって引き起こされる細胞死は、同じ分離株からの別のエフェクター、PvAvh8によって抑制される可能性があります。この作業は、PvAvh74および他のRxLRエフェクターと宿主免疫との相互作用をさらに調査するためのフレームワークを提供します。"]
[246,31798448,"plant","Nicotiana benthamiana","Agroinfiltration;","SCI-57","Frontiers in pharmacology","Expression of the Biologically Active Insulin Analog SCI-57 in Nicotiana Benthamiana.",2019,"10:1335","[Munoz-Talavera A et al.]","University of Guadalajara, Guadalajara, Mexico.",31798448,"10.3389/fphar.2019.01335 ","Diabetes mellitus is a growing problem worldwide; however, only 23% of low-income countries have access to insulin, and ironically it costs higher in such countries than high-income ones. Therefore, new strategies for insulin and insulin analogs production are urgently required to improve low-cost access to therapeutic products, so as to contain the diabetes epidemic. SCI-57 is an insulin analog with a greater affinity for the insulin receptor and lower thermal degradation than native insulin. It also shows native mitogenicity and insulin-like biological activity. In this work, SCI-57 was transiently expressed  in the Nicotiana benthamiana (Nb) plant, and we also evaluated some of its relevant biological effects. An expression plasmid was engineered to translate an N-terminal ubiquitin and C-terminal endoplasmic reticulum-targeting signal KDEL,  in order to increase protein expression and stability. Likewise, the effect of co-expression of influenza M2 ion channel (M2) on the expression of insulin analog SCI-57 (SCI-57/M2) was evaluated. Although using M2 increases yield, it tends to alter the SCI-57 amino acid sequence, possibly promoting the formation of oligomers. Purification of SCI-57 was achieved by FPLC cation exchange and ultrafiltration of N. benthamiana leaf extract (NLE). SCI-57 exerts its anti-diabetic properties by stimulating glucose uptake in adipocytes, without affecting the lipid accumulation process. Expression of the insulin analog in agroinfiltrated plants was confirmed by SDS-PAGE, RP-HPLC, and MS. Proteome changes related to the expression of heterologous proteins on N. benthamiana were not observed; up-regulated proteins were related to the agroinfiltration process. Our results demonstrate the potential for producing a biologically active insulin analog, SCI-57, by transient expression in Nb.","tobacco","糖尿病は世界中で深刻化する問題です。ただし、低所得国の23％のみがインスリンを利用でき、皮肉なことに、そのような国では高所得国よりも費用が高くなります。したがって、糖尿病の流行を抑えるために、治療薬への低コストのアクセスを改善するために、インスリンおよびインスリン類似体の生産のための新しい戦略が緊急に必要とされています。SCI-57は、天然インスリンよりもインスリン受容体に対する親和性が高く、熱分解が少ないインスリン類似体です。それはまた、本来の有糸分裂誘発性およびインスリン様の生物学的活性を示す。この作業では、SCI-57がニコチアナベンタミアナ（Nb）植物で一時的に発現し、関連する生物学的効果のいくつかも評価しました。発現プラスミドは、タンパク質の発現と安定性を高めるために、N末端ユビキチンとC末端小胞体ターゲティングシグナルKDELを翻訳するように設計されました。同様に、インスリンアナログSCI-57（SCI-57 / M2）の発現に対するインフルエンザM2イオンチャネル（M2）の共発現の影響を評価しました。M2を使用すると収量が増加しますが、SCI-57のアミノ酸配列が変化する傾向があり、オリゴマーの形成を促進する可能性があります。SCI-57の精製は、FPLCカチオン交換とN.ベンタミアナ葉抽出物（NLE）の限外濾過によって達成されました。SCI-57は、脂質蓄積プロセスに影響を与えることなく、脂肪細胞へのグルコース取り込みを刺激することにより、その抗糖尿病特性を発揮します。アグロインフィルトレーション植物におけるインスリン類似体の発現は、SDS-PAGE、RP-HPLC、およびMSによって確認されました。ベンサミアナタバコでの異種タンパク質の発現に関連するプロテオームの変化は観察されませんでした。アップレギュレートされたタンパク質は、アグロインフィルトレーションプロセスに関連していた。我々の結果は、Nbの一過性発現により、生物学的に活性なインスリン類似体、SCI-57を産生する可能性を示しています。"]
[247,31717281,"plant","Nicotiana benthamiana","Agroinfiltration;","60 putative virulence factors fo candidatus liberibacter asiaticus","International journal of molecular sciences","Identification of the Virulence Factors of Candidatus Liberibacter asiaticus via  Heterologous Expression in Nicotiana benthamiana using Tobacco Mosaic Virus.",2019,"20(22)","[Ying X  et al.]","University of Florida, Wimauma, FL, USA.",31717281,"10.3390/ijms20225575 ","Huanglongbing (HLB), also known as citrus greening, is the most destructive disease of citrus worldwide. HLB is associated with the non-culturable bacterium, Candidatus Liberibacter asiaticus (CaLas) in the United States. The virulence mechanism of CaLas is largely unknown, partly because of the lack of a mutant library. In this study, Tobacco mosaic virus (TMV) and Nicotiana benthamiana (N.  benthamiana) were used for large-scale screening of the virulence factors of CaLas. Agroinfiltration of 60 putative virulence factors in N. benthamiana led to the identification of four candidates that caused severe symptoms in N. benthamiana, such as growth inhibition and cell death. CLIBASIA_05150 and CLIBASIA_04065C (C-terminal of CLIBASIA_04065) could cause cell death in the infiltrated leaves at five days post infiltration. Two low-molecular-weight candidates, CLIBASIA_00470 and CLIBASIA_04025, could inhibit plant growth. By converting start codon to stop codon or frameshifting, the four genes lost their  harmful effects to N. benthamiana. It indicated that the four virulence factors functioned at the protein level rather than at the RNA level. The subcellular localization of the four candidates was determined by confocal laser scanning microscope. CLIBASIA_05150 located in the Golgi apparatus; CLIBASIA_04065 located in the mitochondrion; CLIBASIA_00470 and CLIBASIA_04025 distributed in cells as free GFP. The host proteins interacting with the four virulence factors were identified by yeast two-hybrid. The host proteins interacting with CLIBASIA_00470 and CLIBASIA_04025 were overlapping. Based on the phenotypes, the subcellular localization and the host proteins identified by yeast two-hybrid, CLIBASIA_00470 and CLIBASIA_04025, functioned redundantly. The hypothesis of CaLas virulence was proposed. CaLas affects citrus development and suppresses citrus disease resistance, comprehensively, in a complicated manner. Ubiquitin-mediated protein  degradation might play a vital role in CaLas virulence. Deep characterization of  the interactions between the identified virulence factors and their prey will shed light on HLB. Eventually, it will help in developing HLB-resistant citrus and save the endangered citrus industry worldwide.","tobacco","カンキツグリーニングとしても知られるHuanglongbing（HLB）は、世界で最も破壊的な柑橘類の病気です。HLBは、米国では培養不可能な細菌であるCandidatus Liberibacter asiaticus（CaLas）に関連しています。CaLasの病原性メカニズムは、変異ライブラリーがないこともあり、ほとんど知られていません。この研究では、CaLasの毒性因子の大規模なスクリーニングにタバコモザイクウイルス（TMV）とニコチアナベンタミアナ（N.ベンタミアナ）を使用しました。N.ベンタミアナにおける60の推定毒性因子の農業浸潤は、成長阻害や細胞死などのN.ベンタミアナに重篤な症状を引き起こした4つの候補の同定につながりました。CLIBASIA_05150およびCLIBASIA_04065C（CLIBASIA_04065のC末端）は、浸潤後5日で浸潤した葉に細胞死を引き起こす可能性があります。2つの低分子量候補、CLIBASIA_00470およびCLIBASIA_04025は、植物の成長を阻害する可能性があります。開始コドンを終止コドンまたはフレームシフトに変換することにより、4つの遺伝子はN.ベンサミアナタバコへの有害な影響を失いました。それは、4つの病原性因子がRNAレベルではなくタンパク質レベルで機能することを示した。4つの候補の細胞内局在は共焦点レーザー走査顕微鏡によって決定されました。ゴルジ装置にあるCLIBASIA_05150; ミトコンドリアにあるCLIBASIA_04065; CLIBASIA_00470およびCLIBASIA_04025は、フリーGFPとしてセルに配布されました。4つの毒性因子と相互作用する宿主タンパク質は、酵母ツーハイブリッドによって同定されました。CLIBASIA_00470およびCLIBASIA_04025と相互作用するホストタンパク質は重複していました。表現型に基づいて、酵母ツーハイブリッド、CLIBASIA_00470およびCLIBASIA_04025によって同定された細胞内局在および宿主タンパク質は重複して機能した。CaLasの病原性の仮説が提案されました。CaLasは柑橘類の発育に影響を与え、複雑な方法で包括的に柑橘類の耐病性を抑制します。ユビキチンを介したタンパク質分解は、CaLasの病原性に重要な役割を果たす可能性があります。同定された毒性因子とその獲物との間の相互作用の詳細な特性評価は、HLBに光を当てます。最終的には、HLB耐性の柑橘類の開発に役立ち、世界中の絶滅危惧種の柑橘類産業を救うでしょう。"]
[248,31158515,"plant","Nicotiana benthamiana","Agroinfiltration;","NbSGT1","Journal of proteomics","In planta proximity-dependent biotin identification (BioID) identifies a TMV replication co-chaperone NbSGT1 in the vicinity of 126kDa replicase.",2019,"204:103402","[Das PP et al.]","National University of Singapore (NUS), Singapore.",31158515,"10.1016/j.jprot.2019.103402 ","Tobacco mosaic virus (TMV) is a positive, single-stranded RNA virus. It encodes two replicases (126kDa and 183kDa), a movement protein and a coat protein. These  proteins interact with host proteins for successful infection. Some host proteins such as eEF1alpha, Tm-1, TOM1, 14-3-3 proteins directly interact with Tobamovirus replication proteins. There are host proteins in the virus replication complex which do not interact with viral replicases directly, such as pyruvate kinase and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. We have used Proximity-dependent biotin identification (BioID) technique to screen for transient or weak protein interactions of host proteins and viral replicase in vivo. We transiently expressed BirA* tagged TMV 126kDa replicase in TMV infected Nicotiana benthamiana plants. Among 18 host proteins, we identified NbSGT1 as a potential target for further characterization. Silencing of NbSGT1 in N. benthamiana plants increased  its susceptibility to TMV infection, and overexpression of NbSGT1 increased resistance to TMV infection. There were weak interactions between NbSGT1 and TMV  replicases but no interaction between them was found in Y2H assay. It suggests that the interaction might be transient or indirect. Therefore, the BioID technique is a valuable method to identify weak or transient/indirect interaction(s) between pathogen proteins and host proteins in plants. BIOLOGICAL  SIGNIFICANCE: TMV is a well characterized positive-strand RNA virus model for study of virus-plant host interactions. It infects >350 plant species and is one  of the significant pathogens of crop loss globally. Many host proteins are involved in TMV replication complex formation. To date there are few techniques available for identifying interacting host proteins to viral proteins. There is limited knowledge on transient or non-interacting host proteins during virus infection/replication. In this study, we used agroinfiltration-mediated in planta BioID technique to identify transiently or non-interacting host proteins to viral proteins in TMV-infected N. benthamiana plants. This technique allowed us to identify potential candidate proteins in the vicinity of TMV 126kDa replicase. We have selected NbSGT1 and its overexpression suppresses TMV replication and increase plant resistance. NbSGT1 is believed to interact transiently or indirectly with TMV replicases in the presence of Hsp90/Hsp70. BioID is a novel and powerful technique to identify transiently or indirectly interacting proteins in the study of pathogen-host interactions.","tobacco","タバコモザイクウイルス（TMV）は、陽性の一本鎖RNAウイルスです。これは、2つのレプリカ（126kDaと183kDa）、移動タンパク質とコートタンパク質をエンコードします。これらのタンパク質は、感染を成功させるために宿主タンパク質と相互作用します。eEF1alpha、Tm-1、TOM1、14-3-3タンパク質などの一部のホストタンパク質は、トバモウイルス複製タンパク質と直接相互作用します。ウイルス複製複合体には、ピルビン酸キナーゼやグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼなど、ウイルスレプリカと直接相互作用しない宿主タンパク質があります。近接依存性ビオチン同定（BioID）技術を使用して、invivoでの宿主タンパク質とウイルスレプリカーゼの一時的または弱いタンパク質相互作用をスクリーニングしました。TMVに感染したNicotianabenthamiana植物でBirA *タグ付きTMV126kDaレプリカーゼを一時的に発現させました。18のホストタンパク質の中で、NbSGT1をさらなる特性評価の潜在的なターゲットとして特定しました。N.ベンタミアナ植物におけるNbSGT1のサイレンシングは、TMV感染に対する感受性を高め、NbSGT1の過剰発現はTMV感染に対する耐性を高めました。NbSGT1とTMVレプリカの間には弱い相互作用がありましたが、Y2Hアッセイではそれらの間の相互作用は見つかりませんでした。これは、相互作用が一時的または間接的である可能性があることを示唆しています。したがって、BioID技術は、植物の病原体タンパク質と宿主タンパク質の間の弱いまたは一過性/間接的な相互作用を特定するための貴重な方法です。生物学的意義：TMVは、ウイルスと植物の宿主の相互作用を研究するための、十分に特徴付けられたポジティブストランドRNAウイルスモデルです。350を超える植物種に感染し、世界的に作物損失の重要な病原体の1つです。多くの宿主タンパク質がTMV複製複合体の形成に関与しています。今日まで、ウイルスタンパク質と相互作用する宿主タンパク質を同定するために利用できる技術はほとんどありません。ウイルス感染/複製中の一過性または非相互作用の宿主タンパク質に関する知識は限られています。この研究では、アグロインフィルトレーションを介したプランタBioID技術を使用して、TMVに感染したベンサミアナタバコ植物のウイルスタンパク質に対する一過性または非相互作用の宿主タンパク質を同定しました。この手法により、TMV126kDaレプリカーゼの近くにある潜在的な候補タンパク質を特定することができました。NbSGT1を選択し、その過剰発現はTMV複製を抑制し、植物の抵抗性を高めます。NbSGT1は、Hsp90 / Hsp70の存在下でTMVレプリカと一時的または間接的に相互作用すると考えられています。BioIDは、病原体と宿主の相互作用の研究において、一時的または間接的に相互作用するタンパク質を特定するための斬新で強力な手法です。"]
[249,31350564,"plant","Nicotiana benthamiana","CRISPR;Cas9;","oxidosqualane cyclase friedelin synthase","Plant & cell physiology","CYP712K4 Catalyzes the C-29 Oxidation of Friedelin in the Maytenus ilicifolia Quinone Methide Triterpenoid Biosynthesis Pathway.",2019,"60(11):2510-2522","[Bicalho KU et al.]","Ghent University, Ghent, Belgium.",31350564,"10.1093/pcp/pcz144 ","The native Brazilian plant Maytenus ilicifolia accumulates a set of quinone methide triterpenoids with important pharmacological properties, of which maytenin, pristimerin and celastrol accumulate exclusively in the root bark of this medicinal plant. The first committed step in the quinone methide triterpenoid biosynthesis is the cyclization of 2,3-oxidosqualene to friedelin, catalyzed by the oxidosqualene cyclase friedelin synthase (FRS). In this study, we produced heterologous friedelin by the expression of M. ilicifolia FRS in Nicotiana benthamiana leaves and in a Saccharomyces cerevisiae strain engineered  using CRISPR/Cas9. Furthermore, friedelin-producing N. benthamiana leaves and S.  cerevisiae cells were used for the characterization of CYP712K4, a cytochrome P450 from M. ilicifolia that catalyzes the oxidation of friedelin at the C-29 position, leading to maytenoic acid, an intermediate of the quinone methide triterpenoid biosynthesis pathway. Maytenoic acid produced in N. benthamiana leaves was purified and its structure was confirmed using high-resolution mass spectrometry and nuclear magnetic resonance analysis. The three-step oxidation of friedelin to maytenoic acid by CYP712K4 can be considered as the second step of the quinone methide triterpenoid biosynthesis pathway, and may form the basis for further discovery of the pathway and heterologous production of friedelanes and ultimately quinone methide triterpenoids.","tobacco","ブラジル原産の植物Maytenusilicifoliaは、重要な薬理学的特性を持つキノンメチドトリテルペノイドのセットを蓄積します。そのうち、メイテニン、プリスチメリン、セラストロールは、この薬用植物の根皮にのみ蓄積します。キノンメチドトリテルペノイド生合成の最初のコミットされたステップは、オキシドスクアレンシクラーゼフリーデリンシンターゼ（FRS）によって触媒される、2,3-オキシドスクアレンのフリーデリンへの環化である。この研究では、Nicotianabenthamianaの葉とCRISPR / Cas9を使用して設計されたSaccharomycescerevisiae株でM.ilicifoliaFRSを発現させることにより異種フリーデリンを生成しました。さらに、フリーデリン産生N.ベンタミアナ葉およびS.セレビシエ細胞を使用して、C-29位置でフリーデリンの酸化を触媒し、メイテノ酸の中間体をもたらすM.イリシフォリア由来のチトクロームP450であるCYP712K4の特性評価を行った。キノンメチドトリテルペノイド生合成経路。ベンサミアナタバコの葉で生成されたメイテノ酸を精製し、高分解能質量分析と核磁気共鳴分析を使用してその構造を確認しました。CYP712K4によるフリーデリンのメイテノ酸への3段階酸化は、キノンメチドトリテルペノイド生合成経路の第2段階と見なすことができ、フリーデラン、最終的にはキノンメチドトリテルペノイドの経路と異種生産のさらなる発見の基礎を形成する可能性があります。"]
[250,30791210,"plant","Nicotiana benthamiana","Agroinfiltration;","porcine circovirus type 2 capsid protein","Plant biotechnology journal","Immunogenicity of plant-produced porcine circovirus-like particles in mice.",2019,"17(9):1751-1759","[Gunter CJ et al.]","University of Cape Town, Cape Town, South Africa.",30791210,"10.1111/pbi.13097 ","Porcine circovirus type 2 (PCV-2) is the main causative agent associated with a group of diseases collectively known as porcine circovirus-associated disease (PCAD). There is a significant economic strain on the global swine industry due to PCAD and the production of commercial PCV-2 vaccines is expensive. Plant expression systems are increasingly regarded as a viable technology to produce recombinant proteins for use as pharmaceutical agents and vaccines. However, successful production and purification of PCV-2 capsid protein (CP) from plants is an essential first step towards the goal of a plant-produced PCV-2 vaccine candidate. In this study, the PCV-2 CP was transiently expressed in Nicotiana benthamiana plants via agroinfiltration and PCV-2 CP was successfully purified using sucrose gradient ultracentrifugation. The CP self-assembled into virus-like particles (VLPs) resembling native virions and up to 6.5 mg of VLPs could be purified from 1 kg of leaf wet weight. Mice immunized with the plant-produced PCV-2 VLPs elicited specific antibody responses to PCV-2 CP. This is the first report describing the expression of PCV-2 CP in plants, the confirmation of its assembly into VLPs and the demonstration of their use to elicit a strong immune response in a mammalian model.","tobacco","ブタサーコウイルス2型（PCV-2）は、ブタサーコウイルス関連疾患（PCAD）として集合的に知られている疾患のグループに関連する主な原因物質です。PCADにより、世界の豚産業には大きな経済的負担があり、市販のPCV-2ワクチンの製造には費用がかかります。植物発現システムは、医薬品やワクチンとして使用するための組換えタンパク質を生産するための実行可能な技術としてますます見なされています。ただし、植物からのPCV-2キャプシドタンパク質（CP）の生成と精製の成功は、植物で生成されたPCV-2ワクチン候補の目標に向けた重要な最初のステップです。この研究では、PCV-2 CPは、アグロインフィルトレーションを介してニコチアナベンタミアナ植物で一時的に発現され、PCV-2 CPは、スクロース勾配超遠心分離を使用して正常に精製されました。天然のビリオンに似たウイルス様粒子（VLP）に自己組織化されたCPと最大6.5 mgのVLPは、1kgの葉の湿重量から精製できます。植物が産生したPCV-2VLPで免疫したマウスは、PCV-2CPに対する特異的な抗体反応を誘発しました。これは、植物におけるPCV-2 CPの発現、VLPへのアセンブリの確認、および哺乳類モデルで強力な免疫応答を誘発するためのそれらの使用の実証を説明する最初のレポートです。"]
[251,29969180,"plant","Nicotiana benthamiana","CRISPR;Cas9;","6 genes that cause alpha-1,3-fucosyltransferase and beta-1,2-xylosyltransferase deficiency","Plant biotechnology journal","CRISPR/Cas9-mediated knockout of six glycosyltransferase genes in Nicotiana benthamiana for the production of recombinant proteins lacking beta-1,2-xylose and core alpha-1,3-fucose.",2019,"17(2):350-361","[Jansing J  et al.]","RWTH Aachen University, Aachen, Germany.",29969180,"10.1111/pbi.12981 ","Plants offer fast, flexible and easily scalable alternative platforms for the production of pharmaceutical proteins, but differences between plant and mammalian N-linked glycans, including the presence of beta-1,2-xylose and core alpha-1,3-fucose residues in plants, can affect the activity, potency and immunogenicity of plant-derived proteins. Nicotiana benthamiana is widely used for the transient expression of recombinant proteins so it is desirable to modify the endogenous N-glycosylation machinery to allow the synthesis of complex N-glycans lacking beta-1,2-xylose and core alpha-1,3-fucose. Here, we used multiplex CRISPR/Cas9 genome editing to generate N. benthamiana production lines  deficient in plant-specific alpha-1,3-fucosyltransferase and beta-1,2-xylosyltransferase activity, reflecting the mutation of six different genes. We confirmed the functional gene knockouts by Sanger sequencing and mass spectrometry-based N-glycan analysis of endogenous proteins and the recombinant monoclonal antibody 2G12. Furthermore, we compared the CD64-binding affinity of 2G12 glycovariants produced in wild-type N. benthamiana, the newly generated FX-KO line, and Chinese hamster ovary (CHO) cells, confirming that the glyco-engineered antibody performed as well as its CHO-produced counterpart.","tobacco","植物は、医薬品タンパク質の生産のための高速で柔軟性があり、簡単に拡張可能な代替プラットフォームを提供しますが、ベータ-1,2-キシロースおよびコアアルファ-1,3-フコース残基の存在を含む、植物と哺乳類のN結合グリカンの違い植物は、植物由来タンパク質の活性、効力、免疫原性に影響を与える可能性があります。ニコチアナベンタミアナは組換えタンパク質の一過性発現に広く使用されているため、内因性のN-グリコシル化機構を変更して、ベータ-1,2-キシロースとコアアルファ-1,3-フコースを欠く複雑なN-グリカンの合成を可能にすることが望ましい。ここでは、マルチプレックスCRISPR / Cas9ゲノム編集を使用して、6つの異なる遺伝子の変異を反映して、植物特異的なアルファ-1,3-フコシルトランスフェラーゼおよびベータ-1,2-キシロシルトランスフェラーゼ活性を欠くN.ベンタミアナ生産ラインを生成しました。内因性タンパク質および組換えモノクローナル抗体2G12のサンガーシーケンシングおよび質量分析ベースのN-グリカン分析により、機能的な遺伝子ノックアウトを確認しました。さらに、野生型N.ベンタミアナ、新たに生成されたFX-KO系統、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞で産生された2G12糖変異体のCD64結合親和性を比較し、糖鎖工学抗体が同様に機能することを確認しました。 CHO製のカウンターパート。"]
[252,31124249,"plant","Nicotiana benthamiana","Agroinfiltration;","NbUGT73A24; NbUGT73A25 ","Plant journal","Glucosylation of the phytoalexin N-feruloyl tyramine modulates the levels of pathogen-responsive metabolites in Nicotiana benthamiana.",2019,"100(1):20-37","[Sun G et al.]","Technische Universitat Munchen, Freising, Germany.",31124249,"10.1111/tpj.14420 ","Enzyme promiscuity, a common property of many uridine diphosphate sugar-dependent glycosyltransferases (UGTs) that convert small molecules, significantly hinders the identification of natural substrates and therefore the characterization of the physiological role of enzymes. In this paper we present a simple but effective strategy to identify endogenous substrates of plant UGTs using LC-MS-guided targeted glycoside analysis of transgenic plants. We successfully identified natural substrates of two promiscuous Nicotiana benthamiana UGTs (NbUGT73A24 and NbUGT73A25), orthologues of pathogen-induced tobacco UGT (TOGT) from Nicotiana tabacum, which is involved in the hypersensitive reaction. While in N. tabacum, TOGT glucosylated scopoletin after treatment with salicylate, fungal elicitors and the tobacco mosaic virus, NbUGT73A24 and NbUGT73A25 produced glucosides of phytoalexin N-feruloyl tyramine, which may strengthen cell walls to prevent the intrusion of pathogens, and flavonols after agroinfiltration of the corresponding genes in N. benthamiana. Enzymatic glucosylation of fractions of a  physiological aglycone library confirmed the biological substrates of UGTs. In addition, overexpression of both genes in N. benthamiana produced clear lesions on the leaves and led to a significantly reduced content of pathogen-induced plant metabolites such as phenylalanine and tryptophan. Our results revealed some additional biological functions of TOGT enzymes and indicated a multifunctional role of UGTs in plant resistance.","tobacco","小分子を変換する多くのウリジン二リン酸糖依存性グリコシルトランスフェラーゼ（UGT）の共通の特性である酵素乱雑性は、天然基質の同定、したがって酵素の生理学的役割の特徴づけを著しく妨げます。この論文では、トランスジェニック植物のLC-MSガイド下標的配糖体分析を使用して植物UGTの内因性基質を同定するためのシンプルで効果的な戦略を提示します。2つの無差別なNicotianabenthamiana UGT（NbUGT73A24およびNbUGT73A25）の天然基質、過敏反応に関与するNicotiana tabacumからの病原体誘発タバコUGT（TOGT）のオルソログの同定に成功しました。N. tabacumにいる間、サリチル酸塩、真菌エリシター、タバコモザイクウイルスで処理した後のTOGTグルコシル化スコポレチン、NbUGT73A24とNbUGT73A25は、ファイトアレキシンN-フェルロイルチラミンのグルコシドを生成し、細胞壁を強化して病原体の侵入を防ぎ、フラボノールN.ベンサミアナタバコの対応する遺伝子の。生理学的アグリコンライブラリーの画分の酵素的グルコシル化により、UGTの生物学的基質が確認された。さらに、N。ベンタミアナにおける両方の遺伝子の過剰発現は、葉に明確な病変を生じさせ、フェニルアラニンやトリプトファンなどの病原体誘発性植物代謝産物の含有量を大幅に減少させました。我々の結果は、TOGT酵素のいくつかの追加の生物学的機能を明らかにし、植物抵抗性におけるUGTの多機能的役割を示した。"]
[253,31065786,"plant","Nicotiana benthamiana","CRISPR;Cas9;","RNA-dependent RNA polymerase 6","Planta","CRISPR/Cas9-mediated knockout of the RDR6 gene in Nicotiana benthamiana for efficient transient expression of recombinant proteins.",2019,"250(2):463-473","[Matsuo K  et al.]","National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Sapporo, Japan.",31065786,"10.1007/s00425-019-03180-9 ","MAIN CONCLUSION: RDR6 gene knockout Nicotiana benthamiana plant was successfully  produced using CRISPR/Cas9 technology. The production of recombinant proteins in  plants has many advantages, such as safety and reduced costs. However, there are  several problems with this technology, especially low levels of protein production. The dysfunction of the RNA silencing mechanism in plant cells would be effective to improve recombinant protein production because the RNA silencing  mechanism efficiently degrades transgene-derived mRNAs. Therefore, to overcome this problem, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology was used to develop RNA silencing-related gene knockout  transgenic Nicotiana benthamiana. We successfully produced RNA-dependent RNA polymerase 6 (RDR6), one of the most important components of the RNA silencing mechanism-knockout N. benthamiana (DeltaRDR6 plants). The DeltaRDR6 plants had abnormal flowers and were sterile, as with the Arabidopsis RDR6 mutants. However, a transient gene expression assay showed that the DeltaRDR6 plants accumulated larger amounts of green fluorescent protein (GFP) and GFP mRNA than the wild-type (WT) plants. Small RNA sequencing analysis revealed that levels of small interfering RNA against the GFP gene were greatly reduced in the DeltaRDR6 plants, as compared to that of the WT plants. These findings demonstrate that the DeltaRDR6 plants can express larger amounts of recombinant proteins than WT plants and, therefore, would be useful for recombinant protein production and understanding the contributions of RDR6 to genetic and physiological events in plants.","tobacco","主な結論：RDR6遺伝子ノックアウトニコチアナベンタミアナ植物は、CRISPR / Cas9技術を使用して首尾よく生産されました。植物での組換えタンパク質の生産には、安全性やコスト削減など、多くの利点があります。ただし、このテクノロジーにはいくつかの問題があり、特に低レベルのタンパク質生産があります。RNAサイレンシングメカニズムは導入遺伝子由来のmRNAを効率的に分解するため、植物細胞におけるRNAサイレンシングメカニズムの機能不全は、組換えタンパク質の産生を改善するのに効果的である。したがって、この問題を克服するために、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ Cas9テクノロジーを使用して、RNAサイレンシング関連遺伝子ノックアウトトランスジェニックニコチアナベンサミアナを開発しました。RNAサイレンシングメカニズムの最も重要なコンポーネントの1つであるノックアウトN.ベンタミアナ（DeltaRDR6植物）であるRNA依存性RNAポリメラーゼ6（RDR6）の製造に成功しました。DeltaRDR6植物は、Arabidopsis RDR6変異体と同様に、異常な花を持ち、無菌でした。ただし、一過性遺伝子発現アッセイは、DeltaRDR6植物が野生型（WT）植物よりも大量の緑色蛍光タンパク質（GFP）およびGFPmRNAを蓄積することを示しました。small RNAシーケンス分析により、GFP遺伝子に対するsmall干渉RNAのレベルが、WTプラントと比較してDeltaRDR6プラントで大幅に減少していることが明らかになりました。これらの発見は、DeltaRDR6植物がWT植物よりも大量の組換えタンパク質を発現できることを示しており、したがって、組換えタンパク質の生産と、植物の遺伝的および生理学的イベントへのRDR6の寄与の理解に役立つでしょう。"]
[254,31493652,"plant","Nicotiana benthamiana","CRISPR;Cas9;","RNA dependent RNA polymerase (rdr6)","Virology","The virological model plant, Nicotiana benthamiana expresses a single functional  RDR6 homeolog.",2019,"537:143-148","[Ludman M et al.]","National Agricultural Research and Innovation Centre, Godollo, Hungary.",31493652,"10.1016/j.virol.2019.08.017 ","The RNA dependent RNA polymerase, RDR6 is involved in a variety of processes including the biogenesis of endogenous regulatory small RNAs, maintaining post-transcriptional gene silencing of transgenes and establishing efficient antiviral RNA silencing. In the virological model plant, Nicotiana benthamiana, functional studies of RDR6 has so far only been depended on RNAi based methodologies. These techniques however have inherent limitations, especially in  the context of antiviral RNA silencing. To overcome this issue, we created rdr6 mutant N. benthamiana by the CRISPR/Cas9 genome editing system. Using the mutant, most of the proposed functions of RDR6 was confirmed. Additionally, the rdr6 N. benthamiana plant recapitulated closely the phenotype of the equivalent Arabidopsis mutant. In summary, the rdr6 N. benthamiana described here may be employed as a model system not only for the better understanding of the role of RDR6 in pathogen elicited immune responses but in various developmental processes as well.","tobacco","RNA依存性RNAポリメラーゼであるRDR6は、内因性調節低分子RNAの生合成、導入遺伝子の転写後遺伝子サイレンシングの維持、効率的な抗ウイルスRNAサイレンシングの確立などのさまざまなプロセスに関与しています。ウイルス学的モデル植物であるニコチアナ・ベンタミアナでは、これまでRDR6の機能研究はRNAiベースの方法論にのみ依存してきました。ただし、これらの手法には、特に抗ウイルスRNAサイレンシングのコンテキストでは、固有の制限があります。この問題を克服するために、CRISPR / Cas9ゲノム編集システムによってrdr6変異体N.benthamianaを作成しました。変異体を使用して、RDR6の提案された機能のほとんどが確認されました。さらに、rdr6 N.ベンタミアナ植物は、同等のアラビドプシス変異体の表現型を厳密に再現しました。要約すると、ここで説明するrdr6 N.ベンタミアナは、病原体誘発免疫応答におけるRDR6の役割をよりよく理解するためだけでなく、さまざまな発達過程においてもモデルシステムとして使用できます。"]
[255,30342301,"plant","Nicotiana benthamiana","Agroinfiltration;","green fluorescent protein (GFP)","Virology","Identification and subcellular location of an RNA silencing suppressor encoded by mulberry crinkle leaf virus.",2019,"526:45-51","[Lu QY et al.]","Jiangsu University of Science and Technology, Zhenjiang, Jiangsu, China.",30342301,"10.1016/j.virol.2018.10.007 ","Mulberry crinkle leaf virus (MCLV) is a novel geminivirus recently identified from the woody plant mulberry (Morus alba L.). Little is known about the functions of the proteins encoded by the MCLV genome. Here, all the MCLV-encoded  proteins were examined for the ability to suppress gene silencing by an agroinfiltration assay in combination with northern blot analysis of green fluorescent protein (GFP) mRNA and western blot analysis. Of the six proteins, only one protein, V3, which has been predicted to play a role in viral movement,  was found to suppress the gene silencing induced by a sense GFP gene in Nicotiana benthamiana 16c. The minimal amino acid sequence of V3 that maintains suppressor  activity was also determined by constructing truncated mutants lacking different  lengths of the amino acid sequences at the N- or C-terminus of the V3 protein. The results showed that the 94 N-terminal amino acid residues of V3 are sufficient to maintain V3 suppressor activity. In addition, the subcellular location of the V3 protein was investigated by confocal laser scanning microscopy after the expression of a V3-RFP fused protein in leaf epidermal cells of N. benthamiana. The results indicated that the V3 protein localized not only to the  cytoplasm but also to the nucleus of N. benthamiana, implying that V3 can shuttle between the nucleus and the cytoplasm. Deletion mutant analysis indicated that a  putative nuclear localization signal (NLS) between aa 118-134 might be responsible for the nuclear distribution of the V3 protein. Given the importance  of RNA silencing in plant-virus interactions, the identification of a silencing suppressor of MCLV should be valuable in understanding the pathogenicity and molecular biology of this virus.","tobacco","マルベリークリンクルリーフウイルス（MCLV）は、木質植物マルベリー（Morus alba L.）から最近同定された新しいジェミニウイルスです。MCLVゲノムによってコードされるタンパク質の機能についてはほとんど知られていない。ここでは、すべてのMCLVでエンコードされたタンパク質を、緑色蛍光タンパク質（GFP）mRNAのノーザンブロット分析およびウエスタンブロット分析と組み合わせたアグロインフィルトレーションアッセイによって遺伝子サイレンシングを抑制する能力について調べました。6つのタンパク質のうち、ウイルスの動きに関与すると予測されている1つのタンパク質、V3のみが、ニコチアナベンタミアナ16cのセンスGFP遺伝子によって誘発される遺伝子サイレンシングを抑制することがわかりました。サプレッサー活性を維持するV3の最小アミノ酸配列は、V3タンパク質のN末端またはC末端に異なる長さのアミノ酸配列を欠く短縮型変異体を構築することによっても決定されました。結果は、V3の94個のN末端アミノ酸残基がV3サプレッサー活性を維持するのに十分であることを示した。さらに、V3タンパク質の細胞内位置は、N.benthamianaの葉の表皮細胞におけるV3-RFP融合タンパク質の発現後に共焦点レーザー走査顕微鏡法によって調査された。結果は、V3タンパク質が細胞質だけでなくベンサミアナタバコの核にも局在することを示し、V3が核と細胞質の間を往復できることを示唆している。削除変異体分析は、aa 118-134間の推定核局在化シグナル（NLS）がV3タンパク質の核分布に関与している可能性があることを示した。植物とウイルスの相互作用におけるRNAサイレンシングの重要性を考えると、MCLVのサイレンシングサプレッサーの特定は、このウイルスの病原性と分子生物学を理解する上で価値があるはずです。"]
[256,31834959,"plant","Nicotiana benthamiana; Arabidopsis thaliana","CRISPR;Cas9;TALENs;","telomeric hisotnes and chromatin","Plant journal","Two combinatorial patterns of telomere histone marks in plants with canonical and non-canonical telomere repeats.",2019,null,"[Adamusova K et al.]","Masaryk University, Brno, Czech Republic.",31834959,"10.1111/tpj.14653 ","Telomeres, nucleoprotein structures at the ends of linear eukaryotic chromosomes, are crucial for the maintenance of genome integrity. In most plants, telomeres consist of conserved tandem repeat units comprising the TTTAGGG motif. Recently,  non-canonical telomeres were described in several plants and plant taxons, including the carnivorous plant Genlisea hispidula (TTCAGG/TTTCAGG), the genus Cestrum (Solanaceae; TTTTTTAGGG), and plants from the Asparagales order with either a vertebrate-type telomere repeat TTAGGG or Allium genus-specific CTCGGTTATGGG repeat. We analyzed epigenetic modifications of telomeric histones in plants with canonical and non-canonical telomeres, and further in telomeric chromatin captured from leaves of Nicotiana benthamiana transiently transformed by telomere CRISPR-dCas9-eGFP, and of Arabidopsis thaliana stably transformed with TALE_telo C-3xGFP. Two combinatorial patterns of telomeric histone modifications were identified: (i) an Arabidopsis-like pattern (A. thaliana, G. hispidula, Genlisea nigrocaulis, Allium cepa, Narcissus pseudonarcissus, Petunia  hybrida, Solanum tuberosum, Solanum lycopersicum) with telomeric histones decorated predominantly by H3K9me2; (ii) a tobacco-like pattern (Nicotiana tabacum, N. benthamiana, C. elegans) with a strong H3K27me3 signal. Our data suggest that epigenetic modifications of plant telomere-associated histones are related neither to the sequence of the telomere motif nor to the lengths of the telomeres. Nor the phylogenetic position of the species plays the role; representatives of the Solanaceae family are included in both groups. As both patterns of histone marks are compatible with fully functional telomeres in respective plants, we conclude that the described specific differences in histone marks are not critical for telomere functions.","tobacco","線形真核生物染色体の末端にある核タンパク質構造であるテロメアは、ゲノムの完全性を維持するために重要です。ほとんどの植物では、テロメアはTTTAGGGモチーフを含む保存されたタンデムリピートユニットで構成されています。最近、非標準的なテロメアは、肉食性植物Genlisea hispidula（TTCAGG / TTTCAGG）、Cestrum属（Solanaceae; TTTTTTAGGG）、および脊椎動物型テロメア反復を伴うアスパラガレスオーダーの植物を含む、いくつかの植物および植物分類群で説明されました。 TTAGGGまたはAllium属固有のCTCGGTTATGGGリピート。カノニカルおよび非カノニカルテロメアを有する植物、さらにテロメアCRISPR-dCas9-eGFPによって一時的に形質転換されたニコチアナベンタミアナの葉、およびTALE_teloC-3xGFPで安定的に形質転換されたアラビドプシスタリアナの葉から捕捉されたテロメアクロマチンにおけるテロメアヒストンのエピジェネティック修飾を分析した。テロメアヒストン修飾の2つの組み合わせパターンが特定されました：（i）テロメアヒストンが主に装飾されたアラビドプシス様パターン（A. thaliana、G。hispidula、Genlisea nigrocaulis、Allium cepa、Narcissus pseudonarcissus、Petunia hybrida、Solanum tuberosum、Solanum lycopersicum） H3K9me2による; （ii）強いH3K27me3信号を伴うタバコのようなパターン（Nicotiana tabacum、N。benthamiana、C。elegans）。私たちのデータは、植物のテロメア関連ヒストンのエピジェネティックな修飾が、テロメアモチーフの配列にもテロメアの長さにも関連していないことを示唆しています。また、種の系統発生的位置も役割を果たしません。Solanaceaeファミリーの代表者は両方のグループに含まれています。ヒストンマークの両方のパターンは、それぞれの植物の完全に機能するテロメアと互換性があるため、ヒストンマークの説明された特定の違いはテロメア機能にとって重要ではないと結論付けます。"]
[257,31435821,"plant","Nicotiana benthamiana; Arabidopsis thaliana","Agroinfiltration;","GAL4-VP16","Transgenic research","Development of a Gateway-compatible two-component expression vector system for plants.",2019,"28(5-6):561-572","[Li N et al.]","Key Laboratory of Cultivation and Protection for Non-Wood Forest Trees (Central South University of Forestry and Technology), Ministry of Education, Changsha, Hunan, China.",31435821,"10.1007/s11248-019-00167-w ","Genetic transformation of plants offers the possibility of functional characterization of individual genes and the improvement of plant traits. Development of novel transformation vectors is essential to improve plant genetic transformation technologies for various applications. Here, we present the development of a Gateway-compatible two-component expression vector system for Agrobacterium-mediated plant transformation. The expression system contains two independent plasmid vector sets, the activator vector and the reporter vector, based on the concept of the GAL4/UAS trans-activation system. The activator vector expresses a modified GAL4 protein (GAL4-VP16) under the control of specific promoter. The GAL4-VP16 protein targets the UAS in the reporter vector and subsequently activates reporter gene expression. Both the activator and reporter vectors contain the Gateway recombination cassette, which can be rapidly and efficiently replaced by any specific promoter and reporter gene of interest,  to facilitate gene cloning procedures. The efficiency of the activator-reporter expression system has been assessed using agroinfiltration mediated transient expression assay in Nicotiana benthamiana and stable transgenic expression in Arabidopsis thaliana. The reporter genes were highly expressed with precise tissue-specific and subcellular localization. This Gateway-compatible two-component expression vector system will be a useful tool for advancing plant  gene engineering.","tobacco","植物の遺伝的形質転換は、個々の遺伝子の機能的特徴づけと植物形質の改善の可能性を提供します。新規の形質転換ベクターの開発は、さまざまな用途の植物遺伝子形質転換技術を改善するために不可欠です。ここでは、アグロバクテリウムを介した植物の形質転換のためのゲートウェイ互換性のある2成分発現ベクターシステムの開発を紹介します。発現システムには、GAL4 / UASトランス活性化システムの概念に基づいて、2つの独立したプラスミドベクターセット、アクチベーターベクターとレポーターベクターが含まれています。アクチベーターベクターは、特定のプロモーターの制御下で修飾されたGAL4タンパク質（GAL4-VP16）を発現します。GAL4-VP16タンパク質は、レポーターベクターのUASを標的とし、その後レポーター遺伝子の発現を活性化します。アクチベーターベクターとレポーターベクターの両方にゲートウェイ組換えカセットが含まれています。ゲートウェイ組換えカセットは、特定のプロモーターおよびレポーター遺伝子に迅速かつ効率的に置き換えることができ、遺伝子クローニング手順を容易にします。アクチベーター-レポーター発現システムの効率は、ニコチアナ・ベンタミアナにおけるアグロインフィルトレーション媒介一過性発現アッセイおよびアラビドプシス・タリアナにおける安定したトランスジェニック発現を使用して評価されています。レポーター遺伝子は、正確な組織特異的および細胞内局在で高度に発現されていました。このゲートウェイ互換の2成分発現ベクターシステムは、植物遺伝子工学を進歩させるための有用なツールとなるでしょう。"]
[258,31140413,"plant","Nicotiana benthamiana; Nicotiana excelsiana","Agroinfiltration;","recombinant human plasminogen activator (rhPA)","Nan fang yi ke da xue xue bao = Journal of Southern Medical University","[Transient expression of bioactive recombinant human plasminogen activator in tobacco leaf].",2019,"39(5):515-522","[Ma J et al.]","Key Laboratory of Ministry of Education for Protection and Utilization of Special Biological Resources in the Western China, Yinchuan, China.",31140413,"10.12122/j.issn.1673-4254.2019.05.03 ","OBJECTIVE: To assess the potential of transient expression of recombinant human plasminogen activator (rhPA) in plants as a cost-effective approach for recombinant rhPA production. METHODS: Tobacco mosaic virus-based expression vector pTMV rhPA-NSK and plant binary expression vector pJ Zera-rhPA were constructed by in vitro sequence synthesis and subcloning. The two vectors were inoculated on either Nicotiana benthamiana or N. excelsiana leaves via agroinfiltration. The expression of recombinant rhPA in Nicotiana leaves was examined using Western blotting and ELISA, and the in vitro fibrinolysis activity of plant-produced rhPA was assessed by fibrin agarose plate assay (FAPA). RESULTS: Five to nine days after infiltration with an Agrobacterium inoculum containing pTMV rhPA-NSK, necrosis appeared in the infiltrated area on the leaves of both Nicotiana plants, but intact recombinant rhPA was still present in the necrotic leaf tissues. The accumulation level of recombinant rhPA in infiltrated  N. benthamiana leaves was significantly higher than that in N. excelsiana leaves  (P &lt; 0.05). The yield of recombinant rhPA was up to 0.6% of the total soluble  protein (or about 60.0 mug per gram) in the fresh leaf biomass at 7 days post-inoculation. The plant-derived rhPA was bioactive to convert inactive plasminogen to active plasmin. No necrosis occurred in pJ Zera-rhPA-infiltrated leaves. The Zera-rhPA protein was partially cleaved between the site of Zera tag  and rhPA sequence in both Nicotiana leaves. We speculated that the formation of Zera tags-induced particles in the plant cells was a dynamic process of progressive aggregation in which some of the soluble polypeptides were encapsulated in these particles. CONCLUSIONS: Enzymatically active recombinant rhPA can be rapidly expressed in tobacco plants using the plant viral ampliconbased system, which offers a promising alternative for cost-effective production of recombinant rhPA.","tobacco","目的：組換えrhPA生産のための費用効果の高いアプローチとして、植物における組換えヒトプラスミノーゲンアクチベーター（rhPA）の一過性発現の可能性を評価すること。方法：タバコモザイクウイルスベースの発現ベクターpTMVrhPA-NSKおよび植物バイナリー発現ベクターpJZera-rhPAは、invitro配列合成およびサブクローニングによって構築されました。2つのベクターは、アグロインフィルトレーションを介してニコチアナベンタミアナまたはN.エクセルシアナの葉のいずれかに接種されました。ニコチアナの葉における組換えrhPAの発現をウエスタンブロッティングおよびELISAを使用して調べ、植物産生rhPAのインビトロフィブリン分解活性をフィブリンアガロースプレートアッセイ（FAPA）によって評価した。結果：pTMV rhPA-NSKを含むアグロバクテリウム接種物の浸潤後5〜9日で、両方のニコチアナ植物の葉の浸潤領域に壊死が現れましたが、無傷の組換えrhPAはまだ壊死葉組織に存在していました。浸潤したN.ベンタミアナの葉における組換えrhPAの蓄積レベルは、N。エクセルシアナの葉におけるそれよりも有意に高かった（P <0.05）。組換えrhPAの収量は、接種後7日で、新鮮な葉のバイオマス中の総可溶性タンパク質の最大0.6％（またはグラムあたり約60.0マグ）でした。植物由来のrhPAは生物活性があり、不活性なプラスミノーゲンを活性なプラスミンに変換しました。pJZera-rhPAを浸透させた葉では壊死は起こらなかった。Zera-rhPAタンパク質は、両方のニコチアナの葉のZeraタグの部位とrhPA配列の間で部分的に切断されました。植物細胞におけるゼラタグ誘導粒子の形成は、可溶性ポリペプチドのいくつかがこれらの粒子にカプセル化された進行性凝集の動的プロセスであると推測した。結論：酵素的に活性な組換えrhPAは、植物ウイルスアンプリコンベースのシステムを使用してタバコ植物で迅速に発現させることができ、組換えrhPAの費用効果の高い生産のための有望な代替手段を提供します。"]
[259,30736799,"plant","Nicotiana benthamiana; Nicotiana occidental","Agroinfiltration;","YFP-ASPV-CPs; PVX-ASPV-CPs","Virology journal","Functional analysis of apple stem pitting virus coat protein variants.",2019,"16(1):20","[Ma X et al.]","Huazhong Agricultural University, Wuhan, Hubei, China.",30736799,"10.1186/s12985-019-1126-8 ","BACKGROUND: Although the canonical function of viral coat protein (CP) is to encapsidate the viral genome, they have come to be recognized as multifunctional  proteins, involved in almost every stage of the viral infection cycle. However, CP functions of Apple stem pitting virus (ASPV) has not been comprehensively documented. This study aimed to characterize the functions of ASPV CP and any functional diversification caused by sequence diversity of six ASPV CP variants and studied their biological, serological, pathogenic and viral suppressor of RNA silencing (VSR) functions. METHODS: Six ASPV CP variants that have previously been shown to belong to different subgroups were selected here to study their diversity functions. Agrobacterium mediated infiltration (Agroinfiltration) was used to express YFP-ASPV-CPs in Nicotiana. benthamiana and infect Nicotiana. occidental with PVX-ASPV-CPs in. Confocal microscopy was used to detect YFP-ASPV-CPs florescence. CPs expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) were induced by IPTG. RESULTS: In this study, we showed that recombinant CPs expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) had different levels of serological reactivity to  three anti-ASPV antibodies used to detect ASPV. Furthermore, fusion CPs with YFP  (YFP-CPs) expressed in N. benthamiana cells differed in their ability to form aggregates. We also showed that ASPV isolates that harbour these CPs induced different biological symptoms on its herbaceous host N. occidentalis. At the same time, we found that all six CPs when expressed in PVX vector showed similar VSR activity and produced similar symptoms in N. occidentalis, despite their differences in amino acids. CONCLUSIONS: Different ASPV isolates induced different symptoms in N. occidentalis, however, ASPV CP variants expressed in PVX vector showed the same symptoms in N. occidentalis plants. Also, we showed that ASPV CP variants has the same level of VSR activity, but they have different abilities to aggregate in N. benthamiana.","tobacco","背景：ウイルスコートタンパク質（CP）の標準的な機能は、ウイルスゲノムをカプセル化することですが、ウイルス感染サイクルのほぼすべての段階に関与する多機能タンパク質として認識されるようになりました。ただし、Appleステムピッチングウイルス（ASPV）のCP機能は包括的に文書化されていません。この研究は、ASPV CPの機能と、6つのASPV CP変異体の配列多様性によって引き起こされる機能の多様化を特徴づけることを目的とし、RNAサイレンシング（VSR）機能の生物学的、血清学的、病原性およびウイルス抑制因子を研究しました。方法：異なるサブグループに属することが以前に示された6つのASPV CPバリアントをここで選択して、それらの多様性機能を研究しました。アグロバクテリウムを介した浸潤（アグロインフィルトレーション）を使用して、ニコチアナでYFP-ASPV-CPを発現させました。ベンタミアナとニコチアナに感染します。共焦点顕微鏡を使用して、YFP-ASPV-CPの蛍光を検出しました。Escherichia coli BL21（DE3）で発現したCPは、IPTGによって誘導されました。結果：この研究では、Escherichia coli BL21（DE3）で発現した組換えCPが、ASPVの検出に使用される3つの抗ASPV抗体に対して異なるレベルの血清学的反応性を示すことを示しました。さらに、ベンサミアナタバコ細胞で発現したYFPとの融合CP（YFP-CP）は、凝集体を形成する能力が異なっていました。また、これらのCPを含むASPV分離株が、その草本宿主であるN.occidentalisに異なる生物学的症状を誘発することも示しました。同時に、PVXベクターで発現させた6つのCPはすべて、アミノ酸の違いにもかかわらず、N。occidentalisで同様のVSR活性を示し、同様の症状を示すことがわかりました。結論：異なるASPV分離株はN.オクシデンタリスで異なる症状を誘発しましたが、PVXベクターで発現したASPVCP変異体はN.オクシデンタリス植物で同じ症状を示しました。また、ASPV CPバリアントは同じレベルのVSRアクティビティを持っていますが、N。ベンタミアナで凝集する能力が異なることを示しました。"]
[260,30950179,"plant","Nicotiana benthamiana; Solanum lycopersicum; Arabidopsis thaliana","CRISPR;Cas9;Cpf1;","8 Nicotiana benthamiana loci","Plant biotechnology journal","Assessment of Cas12a-mediated gene editing efficiency in plants.",2019,"17(10):1971-1984","[Bernabe-Orts JM  et al.]","Universidad Politecnica de Valencia, Valencia, Spain.",30950179,"10.1111/pbi.13113 ","The CRISPR/Cas12a editing system opens new possibilities for plant genome engineering. To obtain a comparative assessment of RNA-guided endonuclease (RGEN) types in plants, we adapted the CRISPR/Cas12a system to the GoldenBraid (GB) modular cloning platform and compared the efficiency of Acidaminococcus (As) and  Lachnospiraceae (Lb) Cas12a variants with the previously described GB-assembled Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) constructs in eight Nicotiana benthamiana loci using transient expression. All three nucleases showed drastic target-dependent differences in efficiency, with LbCas12 producing higher mutagenesis rates in five of the eight loci assayed, as estimated with the T7E1 endonuclease assay. Attempts to engineer crRNA direct repeat (DR) had little effect improving on-target efficiency for AsCas12a and resulted deleterious in the case of LbCas12a. To complete the assessment of Cas12a activity, we carried out genome editing experiments in three different model plants, namely N. benthamiana, Solanum lycopersicum and Arabidopsis thaliana. For the latter, we also resequenced Cas12a-free segregating T2 lines to assess possible off-target effects. Our results showed that the mutagenesis footprint of Cas12a is enriched  in deletions of -10 to -2 nucleotides and included in some instances complex rearrangements in the surroundings of the target sites. We found no evidence of off-target mutations neither in related sequences nor somewhere else in the genome. Collectively, this study shows that LbCas12a is a viable alternative to SpCas9 for plant genome engineering.","tobacco","CRISPR / Cas12a編集システムは、植物ゲノム工学の新しい可能性を開きます。植物のRNA誘導エンドヌクレアーゼ（RGEN）タイプの比較評価を得るために、CRISPR / Cas12aシステムをGoldenBraid（GB）モジュラークローニングプラットフォームに適合させ、Acidaminococcus（As）およびLachnospiraceae（Lb）Cas12aバリアントの効率を前述のGBで組み立てられたStreptococcuspyogenes Cas9（SpCas9）は、一過性の発現を使用して、8つのNicotianabenthamiana遺伝子座に構築されます。T7E1エンドヌクレアーゼアッセイで推定されたように、3つのヌクレアーゼはすべて、ターゲットに依存した劇的な効率の違いを示し、LbCas12はアッセイされた8つの遺伝子座のうち5つでより高い突然変異誘発率を示しました。crRNAダイレクトリピート（DR）を設計する試みは、AsCas12aのオンターゲット効率を改善する効果がほとんどなく、LbCas12aの場合は有害でした。Cas12a活性の評価を完了するために、3つの異なるモデル植物、すなわちN.ベンタミアナ、ソラナムリコペルシカム、アラビドプシスタリアナでゲノム編集実験を実施しました。後者については、Cas12aを含まない分離T2ラインを再シーケンスして、オフターゲット効果の可能性を評価しました。我々の結果は、Cas12aの突然変異誘発フットプリントが-10から-2ヌクレオチドの欠失に富んでおり、場合によっては標的部位の周囲の複雑な再配列を含むことを示した。関連する配列にもゲノムの他の場所にも、オフターゲット変異の証拠は見つかりませんでした。まとめると、この研究は、LbCas12aが植物ゲノム工学のためのSpCas9の実行可能な代替物であることを示しています。"]
[261,30565826,"plant","Nicotiana benthamiana; sugar beet","Cas9;","NbPDS","Plant biotechnology journal","Development of Beet necrotic yellow vein virus-based vectors for multiple-gene expression and guide RNA delivery in plant genome editing.",2019,"17(7):1302-1315","[Jiang N et al.]","China Agricultural University, Beijing, China.",30565826,"10.1111/pbi.13055 ","Many plant viruses with monopartite or bipartite genomes have been developed as efficient expression vectors of foreign recombinant proteins. Nonetheless, due to lack of multiple insertion sites in these plant viruses, it is still a big challenge to simultaneously express multiple foreign proteins in single cells. The genome of Beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) offers an attractive system for expression of multiple foreign proteins owning to a multipartite genome composed of five positive-stranded RNAs. Here, we have established a BNYVV full-length infectious cDNA clone under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter. We further developed a set of BNYVV-based vectors that permit efficient expression of four recombinant proteins, including some large proteins  with lengths up to 880 amino acids in the model plant Nicotiana benthamiana and native host sugar beet plants. These vectors can be used to investigate the subcellular co-localization of multiple proteins in leaf, root and stem tissues of systemically infected plants. Moreover, the BNYVV-based vectors were used to deliver NbPDS guide RNAs for genome editing in transgenic plants expressing Cas9, which induced a photobleached phenotype in systemically infected leaves. Collectively, the BNYVV-based vectors will facilitate genomic research and expression of multiple proteins, in sugar beet and related crop plants.","tobacco","単一部分または二部分のゲノムを持つ多くの植物ウイルスは、外来組換えタンパク質の効率的な発現ベクターとして開発されてきました。それにもかかわらず、これらの植物ウイルスには複数の挿入部位がないため、単一の細胞で複数の外来タンパク質を同時に発現させることは依然として大きな課題です。ビート壊死性黄静脈ウイルス（BNYVV）のゲノムは、5つの正鎖RNAで構成される多分割ゲノムを所有する複数の外来タンパク質を発現するための魅力的なシステムを提供します。ここでは、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターの制御下にあるBNYVV完全長感染性cDNAクローンを確立しました。さらに、モデル植物ニコチアナベンタミアナおよびネイティブ宿主サトウキビ植物における最大880アミノ酸の長さのいくつかの大きなタンパク質を含む、4つの組換えタンパク質の効率的な発現を可能にするBNYVVベースのベクターのセットを開発しました。これらのベクターは、全身感染した植物の葉、根、幹組織における複数のタンパク質の細胞内共局在を調査するために使用できます。さらに、BNYVVベースのベクターを使用して、Cas9を発現するトランスジェニック植物でゲノム編集用のNbPDSガイドRNAを送達し、全身感染した葉で光退色表現型を誘発しました。まとめると、BNYVVベースのベクターは、サトウキビおよび関連する作物植物における複数のタンパク質のゲノム研究および発現を促進します。"]
[262,31998348,"plant","Nicotiana tabacum","CRISPR;Cas9;","NtFT5","Frontiers in plant science","The Major Floral Promoter NtFT5 in Tobacco (Nicotiana tabacum) Is a Promising Target for Crop Improvement.",2019,"10:1666","[Schmidt FJ et al.]","University of Munster, Munster, Germany.",31998348,"10.3389/fpls.2019.01666 ","The FLOWERING LOCUS T (FT)-like gene family encodes key regulators of flower induction that affect the timing of reproduction in many angiosperm species. Agricultural research has therefore focused on such genes to improve the success  of breeding programs and enhance agronomic traits. We recently identified a novel FT-like gene (NtFT5) that encodes a day-neutral floral activator in the model tobacco crop Nicotiana tabacum. However, further characterization is necessary to determine its value as a target for breeding programs. We therefore investigated  the function of NtFT5 by expression analysis and mutagenesis. Expression analysis revealed that NtFT5 is transcribed in phloem companion cells, as is typical for FT-like genes. However, high levels of NtFT5 mRNA accumulated not only in the leaves but also in the stem. Loss-of-function mutants (generated using CRISPR/Cas9) were unable to switch to reproductive growth under long-day conditions, indicating that NtFT5 is an indispensable major floral activator during long-days. Backcrossing was achieved by grafting the mutant scions onto wild-type rootstock, allowing the restoration of flowering and pollination by a wild-type donor. The resulting heterozygous Ntft5(-) /NtFT5(+) plants flowered with a mean delay of only ~2 days, demonstrating that one functional allele is sufficient for near-normal reproductive timing. However, this minor extension of  the vegetative growth phase also conferred beneficial agronomic traits, including a >10% increase in vegetative leaf biomass on the main shoot and the production of more seeds. The agronomic benefits of the heterozygous plants persisted under  various abiotic stress conditions, confirming that NtFT5 is a promising target for crop improvement to address the effects of climate change.","tobacco","FLOWERING LOCUS T（FT）のような遺伝子ファミリーは、多くの被子植物種の生殖のタイミングに影響を与える花の誘導の主要な調節因子をコードしています。したがって、農業研究は、繁殖プログラムの成功を改善し、農業特性を強化するために、そのような遺伝子に焦点を合わせてきました。最近、モデルタバコ作物Nicotiana tabacumで、日中性の花の活性化因子をコードする新しいFT様遺伝子（NtFT5）を特定しました。ただし、育種プログラムのターゲットとしての価値を判断するには、さらなる特性評価が必要です。したがって、本発明者らは、発現分析および突然変異誘発によって、NtFT5の機能を調査した。発現解析により、FT様遺伝子に典型的なように、NtFT5が師部コンパニオン細胞で転写されることが明らかになりました。しかし、高レベルのNtFT5 mRNAは、葉だけでなく茎にも蓄積しました。機能喪失型変異体（CRISPR / Cas9を使用して生成）は、長日条件下で生殖成長に切り替えることができず、NtFT5が長日中の不可欠な主要な花の活性化因子であることを示しています。戻し交配は、突然変異体の穂木を野生型台木に接ぎ木することによって達成され、野生型ドナーによる開花と受粉の回復を可能にしました。得られたヘテロ接合型Ntft5（-）/ NtFT5（+）植物は、平均遅延が約2日で開花し、1つの機能的対立遺伝子がほぼ正常な生殖タイミングに十分であることを示しています。しかし、この栄養成長期のわずかな延長は、メインシュートでの栄養葉バイオマスの> 10％の増加や、より多くの種子の生産など、有益な農業形質ももたらしました。ヘテロ接合植物の農業上の利点は、さまざまな非生物的ストレス条件下で持続し、NtFT5が気候変動の影響に対処するための作物改良の有望なターゲットであることを確認しました。"]
[263,31360827,"plant","Nicotiana tabacum","ZFN;","neomycin phosphotransferase II; Discosoma sp. red fluorescent protein","Plant direct","Targeted insertion of large DNA sequences by homology-directed repair or non-homologous end joining in engineered tobacco BY-2 cells using designed zinc finger nucleases.",2019,"3(7):e00153","[Schiermeyer A et al.]","Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology, Aachen Germany.",31360827,"10.1002/pld3.153 ","Targeted integration of recombinant DNA fragments into plant genomes by DNA double-strand break (DSB) repair mechanisms has become a powerful tool for precision engineering of crops. However, many targeting platforms require the screening of many transgenic events to identify a low number of targeted events among many more random insertion events. We developed an engineered transgene integration platform (ETIP) that uses incomplete marker genes at the insertion site to enable rapid phenotypic screening and recovery of targeted events upon functional reconstitution of the marker genes. The two marker genes, encoding neomycin phosphotransferase II (nptII) and Discosoma sp. red fluorescent protein  (DsRed) enable event selection on kanamycin-containing selective medium and subsequent screening for red fluorescent clones. The ETIP design allows targeted  integration of donor DNA molecules either by homology-directed repair (HDR) or non-homologous end joining (NHEJ)-mediated mechanisms. Targeted donor DNA integration is facilitated by zinc finger nucleases (ZFN). The ETIP cassette was  introduced into Nicotiana tabacum BY-2 suspension cells to generate target cell lines containing a single copy locus of the transgene construct. The utility of the ETIP platform has been demonstrated by targeting DNA constructs containing up to 25-kb payload. The success rate for clean targeted DNA integration was up to 21% for HDR and up to 41% for NHEJ based on the total number of calli analyzed by next-generation sequencing (NGS). The rapid generation of targeted events with large DNA constructs expands the utility of the nuclease-mediated gene addition platform both for academia and the commercial sector.","tobacco","DNA二本鎖切断（DSB）修復メカニズムによる植物ゲノムへの組換えDNAフラグメントの標的化された統合は、作物の精密工学のための強力なツールになりました。ただし、多くのターゲティングプラットフォームでは、より多くのランダムな挿入イベントの中から少数のターゲティングイベントを特定するために、多くのトランスジェニックイベントをスクリーニングする必要があります。挿入部位で不完全なマーカー遺伝子を使用して、マーカー遺伝子の機能的再構成時に標的イベントの迅速な表現型スクリーニングと回復を可能にする、操作された導入遺伝子統合プラットフォーム（ETIP）を開発しました。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（nptII）とDiscosomasp。をコードする2つのマーカー遺伝子。赤色蛍光タンパク質（DsRed）は、カナマイシン含有選択培地でのイベント選択と、それに続く赤色蛍光クローンのスクリーニングを可能にします。ETIP設計により、相同性指向修復（HDR）または非相同性末端結合（NHEJ）を介したメカニズムのいずれかによって、ドナーDNA分子のターゲットを絞った統合が可能になります。標的ドナーDNAの統合は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ZFN）によって促進されます。ETIPカセットをNicotianatabacum BY-2浮遊細胞に導入して、導入遺伝子構築物の単一コピー遺伝子座を含む標的細胞株を生成した。ETIPプラットフォームの有用性は、最大25kbのペイロードを含むDNAコンストラクトをターゲットにすることで実証されています。次世代シーケンシング（NGS）によって分析されたカルスの総数に基づくと、クリーンなターゲットDNA統合の成功率はHDRで最大21％、NHEJで最大41％でした。大きなDNAコンストラクトを使用したターゲットイベントの迅速な生成により、アカデミアと商業部門の両方で、ヌクレアーゼを介した遺伝子追加プラットフォームの有用性が広がります。"]
[264,31401729,"plant","Nicotiana tabacum","CRISPR;Cas9;Cpf1;","ethylene receptor 1","Plant molecular biology","Application of Cas12a and nCas9-activation-induced cytidine deaminase for genome  editing and as a non-sexual strategy to generate homozygous/multiplex edited plants in the allotetraploid genome of tobacco.",2019,"101(4-5):355-371","[Hsu CT et al.]","Agricultural Biotechnology Research Center, Academia Sinica, Taipei, Taiwan.",31401729,"10.1007/s11103-019-00907-w ","KEY MESSAGE: Protoplasts can be used for genome editing using several different CRISPR systems, either separately or simultaneously, and that the resulting mutations can be recovered in regenerated non-chimaeric plants. Protoplast transfection and regeneration systems are useful platforms for CRISPR/Cas mutagenesis and genome editing. In this study, we demonstrate the use of Cpf1 (Cas12a) and nCas9-activation-induced cytidine deaminase (nCas9-Target-AID) systems to mutagenize Nicotiana tabacum protoplasts and to regenerate plants harboring the resulting mutations. We analyzed 20 progeny plants of Cas12a-mediated phytoene desaturase (PDS) mutagenized regenerants, as well as regenerants from wild-type protoplasts, and confirmed that their genotypes were inherited in a Mendelian manner. We used a Cas9 nickase (nCas9)-cytidine deaminase to conduct C to T editing of the Ethylene receptor 1 (ETR1) gene in tobacco protoplasts and obtained edited regenerates. It is difficult to obtain homozygous edits of polyploid genomes when the editing efficiency is low. A second round of mutagenesis of partially edited regenerants (a two-step transfection protocol) allowed us to derive ETR1 fully edited regenerants without the need for sexual reproduction. We applied three different Cas systems (SaCas9, Cas12a, and nCas9-Traget AID) using either a one-step or a two-step transfection  platform to obtain triply mutated and/or edited tobacco regenerants. Our results  indicate that these three Cas systems can function simultaneously within a single cell.","tobacco","重要なメッセージ：プロトプラストは、いくつかの異なるCRISPRシステムを使用して、別々にまたは同時にゲノム編集に使用でき、結果として生じる変異は、再生された非キメラ植物で回復できます。プロトプラストトランスフェクションおよび再生システムは、CRISPR / Cas変異誘発およびゲノム編集に役立つプラットフォームです。この研究では、Cpf1（Cas12a）およびnCas9活性化誘導シチジンデアミナーゼ（nCas9-Target-AID）システムを使用して、Nicotiana tabacumプロトプラストを変異誘発し、結果として生じる変異を含む植物を再生する方法を示します。Cas12aを介したフィトエンデサチュラーゼ（PDS）変異誘発再生体の20の子孫植物、および野生型プロトプラストからの再生体を分析し、それらの遺伝子型がメンデル様式で継承されていることを確認しました。Cas9ニッカーゼ（nCas9）-シチジンデアミナーゼを使用して、タバコプロトプラストのエチレン受容体1（ETR1）遺伝子のCからTへの編集を行い、編集された再生物を取得しました。編集効率が低い場合、倍数体ゲノムのホモ接合編集を取得することは困難です。部分的に編集された再生剤の2回目の突然変異誘発（2段階のトランスフェクションプロトコル）により、性的複製を必要とせずに、ETR1の完全に編集された再生剤を導出することができました。1ステップまたは2ステップのトランスフェクションプラットフォームを使用して、3つの異なるCasシステム（SaCas9、Cas12a、およびnCas9-Traget AID）を適用し、三重に変異および/または編集されたタバコ再生剤を取得しました。私たちの結果は、これら3つのCasシステムが単一のセル内で同時に機能できることを示しています。"]
[265,31549887,"plant","Nicotiana tabacum L.","Agroinfiltration;","hepatitis B surface antigen (HBsAg), mouse granulocyte macrophage colony stimulating factor (mGM-CSF) (mono or bicistronic cassettes)","Pharmaceutical biology","Construction of bicistronic cassette for co-expressing hepatitis B surface antigen and mouse granulocyte-macrophage colony stimulating factor as adjuvant in tobacco plant.",2019,"57(1):669-675","[Mohammadzadeh S et al.]","Kermanshah University of Medical Sciences, Kermanshah, Iran.",31549887,"10.1080/13880209.2019.1662458 ","Context: The co-delivery of adjuvant and antigen has shown to be more effective for targeting the immune response than antigen alone. Therefore, designing an efficient bicistronic system is more assuring for production of both elements in  the same tobacco cells as a plant model system. Objective: Comparing the efficient transient co-expression of hepatitis B surface antigen (HBsAg) and mouse granulocyte macrophage colony stimulating factor (mGM-CSF) in tobacco leaves by designing either mono or bicistronic cassettes. Materials and methods:  Four expression cassettes containing tobacco etch virus (TEV) leader sequence were constructed with and without above genes in different orders. The cassettes  were transferred into tobacco, Nicotiana tabacum L. (Solanaceae), leaves by agroinfiltration technique. The expression levels were compared using ELISA and western blotting and bioactivity of cytokine was assessed by in vitro proliferation of mouse GM-CSF-responsive progenitor cells. Results: Agroinfiltrated leaves contained recombinant HBsAg protein at 20-50 ng/mg and mGM-CSF at 0.2-4 ng/mg in both nonglycosylated and glycosylated forms. The highest expression obtained in HBsAg and mGM-CSF monocistronic co-agroinfiltrated leaves. The expression of mGM-CSF was 1.1 and 0.2 ng/mg in two different orders of bicistronic cassettes. The growth frequency of GM progenitors was approximately 1/187 cells for standard rGM-CSF and 3.2 times less activity for the plant produced. Discussion and conclusions: The recombinant mGM-CSF was produced less in bicistronic cassette than other forms; however, co-presenting of both vaccine candidate and adjuvant is confirmed and could be promising for amelioration of plant expression system as a means for vaccine production.","tobacco","コンテキスト：アジュバントと抗原の同時送達は、抗原単独よりも免疫応答を標的にするのにより効果的であることが示されています。したがって、効率的なバイシストロンシステムを設計することは、植物モデルシステムと同じタバコ細胞で両方の要素を生産することをより確実にします。目的：モノまたはバイシストロン性カセットを設計することにより、タバコの葉におけるB型肝炎表面抗原（HBsAg）とマウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（mGM-CSF）の効率的な一過性共発現を比較します。材料と方法：タバコエッチングウイルス（TEV）リーダー配列を含む4つの発現カセットを、上記の遺伝子の有無にかかわらず、異なる順序で構築しました。カセットは、アグロインフィルトレーション技術により、タバコ、Nicotiana tabacum L.（ソラナ科）の葉に移された。ELISAとウエスタンブロッティングを使用して発現レベルを比較し、サイトカインの生物活性をマウスGM-CSF応答性前駆細胞のinvitro増殖によって評価した。結果：アグロインフィルトレーションされた葉には、20〜50 ng / mgの組換えHBsAgタンパク質と、0.2〜4 ng / mgのmGM-CSFが、非グリコシル化型とグリコシル化型の両方で含まれていました。HBsAgおよびmGM-CSFモノシストロン性共アグロ浸潤葉で得られた最高の発現。mGM-CSFの発現は、バイシストロンカセットの2つの異なる順序で1.1および0.2 ng / mgでした。GM前駆細胞の成長頻度は、標準的なrGM-CSFでは約1/187細胞であり、生産された植物では3.2分の1の活性でした。考察と結論：組換えmGM-CSFは、他の形態よりもバイシストロン性カセットで生成されませんでした。しかし、ワクチン候補とアジュバントの両方の同時提示が確認されており、ワクチン生産の手段としての植物発現システムの改善に有望である可能性があります。"]
[266,30006757,"plant","Nicotiana tabacum L. 'SR-1'","CRISPR;Cas9;agroinfiltration","acetolactate synthase (SuRB); MYB transcription factor (An2)","Plant cell reports","CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination in tobacco.",2019,"38(4):463-473","[Hirohata A et al.]","Osaka Prefecture University, Sakai, Osaka, Japan.",30006757,"10.1007/s00299-018-2320-7 ","KEY MESSAGE: Co-transformation of multiple T-DNA in a binary vector enabled CRISPR/Cas9-mediated HR in tobacco. HR occurred in a limited region around the gRNA target site. In this study, CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination (HR) in tobacco (Nicotiana tabacum L. 'SR-1') was achieved using binary vectors comprising two (T1-T2) or three (T1-T2-T3) independent T-DNA regions. For HR donor with the tobacco acetolactate synthase gene, SuRB, T-DNA1 contained DeltaSuRB(W568L), which lacked the N-terminus region of SuRB and was created by three nucleotide substitutions (ATG to GCT; W568L), leading to herbicide chlorsulfuron (Cs) resistance, flanked by the hygromycin (Hm)-resistant gene. T-DNA2 consisted of the hSpCas9 gene and two gRNA inserts targeting SuRB and An2. For the 2nd HR donor with the tobacco An2 gene encoding a MYB transcription factor involved in anthocyanin biosynthesis, T-DNA3 had a 35S promoter-driven An2 gene lacking the 3rd exon resulting in anthocyanin accumulation after successful  HR. After selecting for Hm and Cs resistance from among the 7462 Agrobacterium-inoculated explants, 77 independent lines were obtained. Among them, the ATG to GCT substitution of endogenous SuRB was detected in eight T1-T2-derived lines and two T1-T2-T3-derived lines. Of these mutations, four T1-T2-derived lines were bi-allelic. All the HR events occurred across the endogenous SuRB and 5' homology arm of the randomly integrated T-DNA1. HR of the  SuRB paralog, SuRA, was also found in one of the T1-T2-derived lines. Sequence analysis of its SuRA-targeted region indicated that the HR occurred in a limited  (< 153 bp) region around the gRNA target site. Even though some T1-T2-T3-derived  lines introduced three different T-DNAs and modified the An2 gRNA target site, no signs of HR in the endogenous An2 could be observed.","tobacco","重要なメッセージ：バイナリベクターでの複数のT-DNAの同時変換により、タバコでCRISPR / Cas9を介したHRが可能になりました。HRは、gRNAターゲットサイト周辺の限られた領域で発生しました。この研究では、タバコ（Nicotiana tabacum L.'SR-1 '）におけるCRISPR / Cas9を介した相同組換え（HR）は、2つ（T1-T2）または3つ（T1-T2-T3）の独立したTを含むバイナリーベクターを使用して達成されました。 -DNA領域。タバコアセトラクテートシンターゼ遺伝子SuRBを有するHRドナーの場合、T-DNA1はDeltaSuRB（W568L）を含み、これはSuRBのN末端領域を欠き、3つのヌクレオチド置換（ATGからGCT; W568L）によって作成され、除草剤クロルスルフロン（ Cs）耐性、ハイグロマイシン（Hm）耐性遺伝子に隣接。T-DNA2は、hSpCas9遺伝子と、SuRBおよびAn2をターゲットとする2つのgRNAインサートで構成されていました。アントシアニン生合成に関与するMYB転写因子をコードするタバコAn2遺伝子を持つ2番目のHRドナーの場合、T-DNA3には3番目のエクソンを欠く35Sプロモーター駆動型An2遺伝子があり、HRが成功するとアントシアニンが蓄積しました。7462アグロバクテリウムを接種した外植片の中からHmおよびCs耐性を選択した後、77の独立した系統が得られました。その中で、内因性SuRBのATGからGCTへの置換は、8つのT1-T2由来の系統と2つのT1-T2-T3由来の系統で検出されました。これらの変異のうち、4つのT1-T2由来の系統は2対立遺伝子でした。すべてのHRイベントは、ランダムに統合されたT-DNA1の内因性SuRBおよび5 '相同性アーム全体で発生しました。SuRBパラログのHRであるSuRAは、T1-T2由来の系統の1つでも見つかりました。そのSuRA標的領域の配列分析は、HRがgRNA標的部位の周りの限られた（<153 bp）領域で発生したことを示しました。一部のT1-T2-T3由来の系統は3つの異なるT-DNAを導入し、An2 gRNA標的部位を改変しましたが、内因性An2にHRの兆候は観察されませんでした。"]
[267,30806150,"plant","Nicotiana tabacum Xanthi","Agroinfiltration;","anthocyanin VlmybA1-2","Plant signaling & behavior","Use of a visible reporter marker- myb-related gene in crop plants to minimize herbicide usage against weeds.",2019,"14(4):e1581558","[Aly R  et al.]","Agricultural Research Organization, Newe Ya'ar Research Center , Ramat Yishay , Israel.",30806150,"10.1080/15592324.2019.1581558 ","Weeds, a main threat to agricultural productivity worldwide, are mostly controlled by herbicides. To minimize herbicide usage by targeting only weedy areas, we developed a new methodology for robust weed detection that relies on manipulating the crop plant's leaf hue, without affecting crop fitness. We generated transgenic tobacco (Nicotiana tabacum Xanthi) lines overexpressing the  anthocyanin pigment as a traceable marker that differentiates transgenes from the surrounding weeds at an early stage. Transformation with the anthocyanin VlmybA1-2 gene produced purple-colored leaves. Subsequent gene silencing with vector pTRV2:VlmybA1-2 significantly reduced anthocyanin pigments in tobacco leaves 40 days after agroinfiltration, with a concomitant reduction in VlmybA1-2  transcript levels. Purple hue faded gradually, and there were no fitness costs in terms of plant height or leaf number in the silenced vs. non-silenced tobacco transgenes. These results could lead to a new sustainable weed-control method that will alleviate weed-related ecological, agricultural and economic issues.","tobacco","世界中の農業生産性に対する主な脅威である雑草は、主に除草剤によって防除されています。雑草の多い地域のみを対象として除草剤の使用を最小限に抑えるために、作物の健康状態に影響を与えることなく、作物の葉の色相を操作することに依存する堅牢な雑草検出のための新しい方法を開発しました。トランスジーンを周囲の雑草から早期に区別する追跡可能なマーカーとして、アントシアニン色素を過剰発現するトランスジェニックタバコ（Nicotiana tabacum Xanthi）系統を生成しました。アントシアニンVlmybA1-2遺伝子による形質転換により、紫色の葉が生成されました。ベクターpTRV2：VlmybA1-2によるその後の遺伝子サイレンシングは、アグロインフィルトレーションの40日後にタバコの葉のアントシアニン色素を有意に減少させ、同時にVlmybA1-2転写レベルを減少させました。紫の色合いは徐々に薄れ、沈黙したタバコのトランスジーンと沈黙していないタバコのトランスジーンでは、草丈や葉の数に関してフィットネスコストはありませんでした。これらの結果は、雑草に関連する生態学的、農業的、経済的問題を軽減する新しい持続可能な雑草防除方法につながる可能性があります。"]
[268,31446470,"plant","Nicotiana tabacum; grape","CRISPR;Cas9;","enhanced green fluorescence protein (EGFP); phytoene desaturase gene (PDS)","Plant cell reports","Recovery of the non-functional EGFP-assisted identification of mutants generated  by CRISPR/Cas9.",2019,"38(12):1541-1549","[Ren C et al.]","Institute of Botany, Chinese Academy of Science, Beijing, China.",31446470,"10.1007/s00299-019-02465-3 ","KEY MESSAGE: The recovery of non-functional-enhanced green fluorescence protein can be used as indicator to facilitate the identification of mutants generated by CRISPR/Cas9. The CRISPR/Cas9 system is a powerful tool for genome editing and it  has been employed to knock out genes of interest in multiple plant species. Identification of desired mutants from regenerated plants is necessary prior to functional study. Current screening methods work based on the purification of genomic DNA and it would be laborious and time consuming using these methods to screen mutants from a large population of seedlings. Here, we developed the non-functional enhanced green fluorescence protein (nEGFP) reporter gene by inserting a single guide RNA (sgRNA) and the protospacer adjacent motif in the 5' coding region of EGFP, and the activity of nEGFP could be recovered after successful targeted editing. Using the nEGFP as the reporter gene in Nicotiana tabacum, we found that over 94% of the plants exhibiting EGFP fluorescence were confirmed to be desired mutants. The use of this nEGFP reporter construct had limited negative effect on editing efficiency, and the expression of Cas9 and sgRNA was not affected. Moreover, this method was also applied in grape by targeting the phytoene desaturase gene (PDS), and the grape cells with EGFP signal were revealed to contain targeted mutations in VvPDS. Our results show that the nEGFP gene can be used as reporter to help screen mutants according to the recovered EGFP fluorescence during the application of CRISPR/Cas9 in plants.","tobacco","重要なメッセージ：機能が強化されていない緑色の蛍光タンパク質の回収は、CRISPR / Cas9によって生成された変異体の識別を容易にするための指標として使用できます。CRISPR / Cas9システムは、ゲノム編集のための強力なツールであり、複数の植物種の対象遺伝子をノックアウトするために使用されています。機能研究の前に、再生植物からの所望の変異体の同定が必要です。現在のスクリーニング方法は、ゲノムDNAの精製に基づいて機能し、これらの方法を使用して多数の苗木から変異体をスクリーニングすることは、手間と時間がかかります。ここでは、EGFPの5 'コーディング領域にシングルガイドRNA（sgRNA）とプロトスペーサー隣接モチーフを挿入することにより、非機能性エンハンスドグリーン蛍光タンパク質（nEGFP）レポーター遺伝子を開発しました。nEGFPの活性は成功後に回復することができました。ターゲットを絞った編集。Nicotiana tabacumのレポーター遺伝子としてnEGFPを使用すると、EGFP蛍光を示す植物の94％以上が望ましい変異体であることが確認されました。このnEGFPレポーターコンストラクトの使用は、編集効率に限定的な悪影響を及ぼし、Cas9およびsgRNAの発現は影響を受けませんでした。さらに、この方法はフィトエンデサチュラーゼ遺伝子（PDS）を標的とするブドウにも適用され、EGFPシグナルを持つブドウ細胞はVvPDSに標的変異を含むことが明らかになりました。私たちの結果は、nEGFP遺伝子をレポーターとして使用して、植物にCRISPR / Cas9を適用する際に回収されたEGFP蛍光に従って変異体をスクリーニングできることを示しています。"]
[269,30880184,"plant","tobacco (Xanthi Brad)","Agroinfiltration;","victoviral Vin gene (encoding Victoriocin)","Journal of biotechnology","Synthetic Salicylic acid inducible recombinant promoter for translational research.",2019,"297:9-18","[Deb D et al.]"," Institute of Life Sciences, Government of India, Chandrasekharpur, Bhubaneswar, Odisha, India.",30880184,"10.1016/j.jbiotec.2019.03.004 ","In the present study, we have developed an inter-molecularly shuffled caulimoviral promoter for protein over-expression by placing the Upstream Activation Sequence (UAS) of Figwort Mosaic Virus (FMV; -249 to -54) at the 5'-end of the Cassava Vein Mosaic Virus (CsVMV) promoter fragment 8 (CsVMV8; -215 to +166) to design a hybrid promoter; FUASCsV8CP. The FUASCsV8CP promoter exhibited approximately 2.1 and 2.0 times higher GUS-activities than that obtained from the CaMV35S promoter, in tobacco (Xanthi Brad) protoplasts and in Agroinfiltration assays respectively. Hereto, when FUASCsV8CP was assayed using transgenic tobacco plants (T2- generation), it showed 2.0 times stronger activity than CaMV35S promoter and almost equivalent activity to that of CaMV35S(2) promoter. The promoter displayed Salicylic acid (SA) inducibility and hence can also be used for ensuring effective gene expression in plants under constitutive  as well as specific inducible conditions. Furthermore, FUASCsV8CP was used to drive the expression of victoviral Vin gene (encoding Victoriocin) transiently in tobacco. The recombinant Victoriocin could be successfully detected by western blotting three days post infiltration. Also, the in vitro Agar-based killing zone assays employing plant-derived Victoriocin-His (obtained from transient expression of Vin) revealed enhanced antifungal activity of Victoriocin against hemi-biotrophic pathogen Phoma exigua Desm. var. exigua.","tobacco","本研究では、Figwort Mosaic Virus（FMV; -249〜-54）の上流活性化配列（UAS）を5 '末端に配置することにより、タンパク質の過剰発現のための分子間シャッフルカウリモウイルスプロモーターを開発しました。ハイブリッドプロモーターを設計するためのCassavaVein Mosaic Virus（CsVMV）プロモーターフラグメント8（CsVMV8; -215〜 + 166）。FUASCsV8CP。FUASCsV8CPプロモーターは、CaMV35Sプロモーターから得られたものよりも、タバコ（Xanthi Brad）プロトプラストおよびアグロインフィルトレーションアッセイでそれぞれ約2.1倍および2.0倍高いGUS活性を示しました。これまで、トランスジェニックタバコ植物（T2世代）を使用してFUASCsV8CPをアッセイした場合、CaMV35Sプロモーターより2.0倍強い活性を示し、CaMV35S（2）プロモーターとほぼ同等の活性を示しました。プロモーターはサリチル酸（SA）誘導性を示したため、構成的および特定の誘導性条件下で植物の効果的な遺伝子発現を確保するためにも使用できます。さらに、FUASCsV8CPを使用して、タバコで一時的にビクトウイルスのVin遺伝子（ビクトリオシンをコードする）の発現を促進しました。組換えビクトリオシンは、浸潤の3日後にウエスタンブロッティングによって首尾よく検出できた。また、植物由来のビクトリオシン-His（Vinの一過性発現から得られた）を使用するインビトロ寒天ベースのキリングゾーンアッセイは、半生物栄養性病原体Phoma exiguaDesmに対するビクトリオシンの増強された抗真菌活性を明らかにした。var。exigua。"]
[270,30376036,"plant","tomato","CRISPR;Cas9;","6 lncRNAs including lncRNA2155","Annals of botany","Genome-wide identification of long non-coding RNA targets of the tomato MADS box  transcription factor RIN and function analysis.",2019,"123(3):469-482","[Yu T et al.]","China Agricultural University, Beijing, China.",30376036,"10.1093/aob/mcy178 ","BACKGROUND AND AIMS: In recent years, increasing numbers of long non-coding RNAs  (lncRNAs) have been identified in humans, animals and plants, and several of them have been shown to play important roles in diverse biological processes. However, little work has been performed on the regulation mechanism of lncRNA biogenesis and expression, especially in plants. Compared with studies of tomato MADS-box transcription factor RIPENING INHIBITOR (RIN) target coding genes, there are few  reports on its relationship to non-coding RNAs. The aim of the present study was  to identify and explore the specific role of RIN target lncRNAs in tomato fruit development and ripening. METHODS: lncRNA targets of RIN were identified by chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) combined with RNA deep sequencing analysis. Six selected lncRNA targets were validated by quantitative real-time PCR, ChIP and electrophoretic mobility shift assays, and we further confirmed differential expression between wild-type and ripening-deficient mutant fruit, and RIN direct binding in the promoter regions. By means of virus-induced  gene silencing (VIGS) assays and a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) genome editing strategy, the ripening-related function of a specific target lncRNA (lncRNA2155)  was studied. KEY RESULTS: We identified 187 lncRNAs as direct RIN targets, which  exhibited RIN binding sites in their promoters and showed different expression between the wild-type and rin mutant. Six target lncRNAs were shown to bind with  RIN directly in their promoters in vivo and in vitro. Moreover, using CRISPR/Cas9 technology to knock out the locus of the target lncRNA2155 indicated that it delayed fruit ripening in tomato. CONCLUSIONS: Collectively, these findings provide new insight into RIN in the transcriptional regulation of lncRNAs and suggest that lncRNAs will contribute to a better understanding of the RIN regulatory network that controls fruit ripening.","tomato","背景と目的：近年、ヒト、動物、植物で長い非コードRNA（lncRNA）の数が増加しており、それらのいくつかは多様な生物学的プロセスで重要な役割を果たすことが示されています。しかし、特に植物において、lncRNAの生合成と発現の調節メカニズムについてはほとんど研究が行われていません。トマトMADSボックス転写因子RIPENINGINHIBITOR（RIN）ターゲットコーディング遺伝子の研究と比較して、非コーディングRNAとの関係についての報告はほとんどありません。本研究の目的は、トマト果実の発育と成熟におけるRIN標的lncRNAの特定の役割を特定して調査することでした。方法：RINのlncRNAターゲットは、RNAディープシーケンス分析と組み合わせたクロマチン免疫沈降シーケンス（ChIP-seq）によって識別されました。6つの選択されたlncRNAターゲットは、定量的リアルタイムPCR、ChIP、および電気泳動移動度シフトアッセイによって検証され、さらに、野生型と成熟欠損変異体の間の発現差、およびプロモーター領域でのRIN直接結合を確認しました。ウイルス誘発性遺伝子サイレンシング（VIGS）アッセイと、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9（Cas9）ゲノム編集戦略により、特定のターゲットlncRNA（lncRNA2155）の熟成関連機能は勉強した。主な結果：187個のlncRNAを直接RINターゲットとして特定しました。これは、プロモーターにRIN結合部位を示し、野生型とrin変異体の間で異なる発現を示しました。6つの標的lncRNAは、invivoおよびinvitroでプロモーター内でRINと直接結合することが示されました。さらに、CRISPR / Cas9テクノロジーを使用してターゲットlncRNA2155の遺伝子座をノックアウトすると、トマトの果実の成熟が遅れることが示されました。結論：まとめると、これらの調査結果は、lncRNAの転写調節におけるRINへの新しい洞察を提供し、lncRNAが果実の成熟を制御するRIN調節ネットワークのより良い理解に寄与することを示唆しています。"]
[271,31434162,"plant","tomato","agroinfiltration","A region of cell surface protein PAc (PAcA) coding gene of mutans streptococci with cholera toxin  B subunit coding gene (CTB) fusion","Biotechnology and applied biochemistry","Construction of a fusion anti-caries DNA vaccine in transgenic tomato plants for  PAcA gene and cholera toxin B subunit.",2019,"66(6):924-929","[Bai G  et al.]","Zunyi Medical University, Zunyi, China.",31434162,"10.1002/bab.1806 ","Chronic bacterial infections in the oral cavity influence the development of dental caries. Mutans streptococci are the major pathogenic cause of dental caries. The World Health Organization (WHO) ranks dental caries, cancer, and cardiovascular diseases as the three major global diseases that need urgent preventative and curative measures. However, substantial evidence suggests that traditional prevention and treatment strategies are inefficient in reducing the prevalence of dental caries. For protection against caries, it is important to develop effective vaccines that induce anticolonizing immunity against Streptococcus mutans infections. In the present investigation, we constructed a fusion anti-caries DNA vaccine (PAcA-ctxB) through fusing A region of cell surface protein PAc (PAcA) coding gene of mutans streptococci with cholera toxin  B subunit coding gene (CTB). Afterward, the plasmids were integrated into tomato  genomes through agrobacterium-mediated plant transformation technology. The presence of transgenes in the tomato genome was confirmed by PCR, beta-glucuronidase gene (GUS), and western blot. The expression of genes was confirmed at transcription and protein level. Altogether, the results presented herein showed that transgenic tomatoes may provide a useful system for the production of human caries antigen.","tomato","口腔内の慢性細菌感染症は虫歯の発症に影響を及ぼします。ミュータンス連鎖球菌は虫歯の主な病原性の原因です。世界保健機関（WHO）は、歯のう蝕、癌、および心血管疾患を、緊急の予防および治療措置を必要とする3つの主要な世界的疾患としてランク付けしています。しかし、実質的な証拠は、従来の予防および治療戦略が歯のう蝕の有病率を減らすのに非効率的であることを示唆しています。齲蝕に対する保護のためには、Streptococcusmutans感染に対する抗コロニー形成免疫を誘導する効果的なワクチンを開発することが重要です。本研究では、ミュータンス連鎖球菌の細胞表面タンパク質PAc（PAcA）コード遺伝子のA領域をコレラ毒素Bサブユニットコード遺伝子（CTB）と融合させることにより、融合抗齲蝕DNAワクチン（PAcA-ctxB）を構築しました。その後、プラスミドはアグロバクテリウムを介した植物形質転換技術を通じてトマトのゲノムに組み込まれました。トマトゲノムにおける導入遺伝子の存在は、PCR、ベータグルクロニダーゼ遺伝子（GUS）、およびウエスタンブロットによって確認されました。遺伝子の発現は、転写およびタンパク質レベルで確認されました。要するに、本明細書に提示された結果は、トランスジェニックトマトがヒトう蝕抗原の産生のための有用なシステムを提供し得ることを示した。"]
[272,31412779,"plant","tomato","CRISPR;Cas9;","Mitogen-activated protein kinase (SlMAPK3)","BMC plant biology","Knockout of SlMAPK3 enhances tolerance to heat stress involving ROS homeostasis in tomato plants.",2019,"19(1):354","[Yu W et al.]","China Agricultural University, Beijing, China.",31412779,"10.1186/s12870-019-1939-z ","BACKGROUND: High temperature is a major environmental stress that limits plant growth and agriculture productivity. Mitogen-activated protein kinases (MAPKs) are highly conserved serine and threonine protein kinases that participate in response to diverse environmental stresses in plants. A total of 16 putative SlMAPK genes are identified in tomato, and SlMAPK3 is one of the most extensively studied SlMAPKs. However, the role of SlMAPK3 in response to heat stress is not clearly understood in tomato plants. In this study, we performed functional analysis of SlMAPK3 for its possible role in response to heat stress. RESULTS: qRT-PCR analyses revealed that SlMAPK3 relative expression was depressed by heat  stress. Here, wild-type (WT) tomato plants and CRISPR/Cas9-mediated slmapk3 mutant lines (L8 and L13) were used to investigate the function of SlMAPK3 in response to heat stress. Compared with WT plants, slmapk3 mutants exhibited less  severe wilting and less membrane damage, showed lower reactive oxygen species (ROS) contents, and presented higher both activities and transcript levels of antioxidant enzymes, as well as elevated expressions of genes encoding heat stress transcription factors (HSFs) and heat shock proteins (HSPs). CONCLUSIONS:  CRISPR/Cas9-mediated slmapk3 mutants exhibited more tolerance to heat stress than WT plants, suggesting that SlMAPK3 was a negative regulator of thermotolerance. Moreover, antioxidant enzymes and HSPs/HSFs genes expression were involved in SlMAPK3-mediated heat stress response in tomato plants.","tomato","背景：高温は、植物の成長と農業の生産性を制限する主要な環境ストレスです。ミトゲン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）は、高度に保存されたセリンおよびスレオニンプロテインキナーゼであり、植物の多様な環境ストレスへの応答に関与します。トマトでは合計16の推定SlMAPK遺伝子が同定されており、SlMAPK3は最も広く研究されているSlMAPKの1つです。しかし、熱ストレスに応答するSlMAPK3の役割は、トマト植物では明確に理解されていません。この研究では、熱ストレスに応答してその可能な役割についてSlMAPK3の機能分析を実行しました。結果：qRT-PCR分析により、SlMAPK3の相対的発現が熱ストレスによって抑制されたことが明らかになりました。ここでは、野生型（WT）トマト植物とCRISPR / Cas9を介したslmapk3変異株（L8およびL13）を使用して、熱ストレスに応答したSlMAPK3の機能を調査しました。WT植物と比較して、slmapk3変異体は、しおれや膜損傷が少なく、活性酸素種（ROS）の含有量が少なく、抗酸化酵素の活性と転写レベルの両方が高く、熱ストレス転写因子をコードする遺伝子の発現が高いことを示しました。 （HSF）および熱ショックタンパク質（HSP）。結論：CRISPR / Cas9を介したslmapk3変異体は、WT植物よりも熱ストレスに対する耐性が高く、SlMAPK3が耐熱性の負の調節因子であったことを示唆しています。さらに、抗酸化酵素とHSP / HSF遺伝子の発現は、トマト植物のSlMAPK3を介した熱ストレス応答に関与していた。"]
[273,30669982,"plant","tomato","CRISPR;Cas9;","nonexpressor of pathogenesis-related gene 1 (SlNPR1)","BMC plant biology","CRISPR/Cas9-Mediated SlNPR1 mutagenesis reduces tomato plant drought tolerance.",2019,"19(1):38","[Li R et al.]","China Agricultural University, Beijing, China.",30669982,"10.1186/s12870-018-1627-4 ","BACKGROUND: NPR1, nonexpressor of pathogenesis-related gene 1, is a master regulator involved in plant defense response to pathogens, and its regulatory mechanism in the defense pathway has been relatively clear. However, information  about the function of NPR1 in plant response to abiotic stress is still limited.  Tomato is the fourth most economically crop worldwide and also one of the best-characterized model plants employed in genetic studies. Because of the lack  of a stable tomato NPR1 (SlNPR1) mutant, little is known about the function of SlNPR1 in tomato response to biotic and abiotic stresses. RESULTS: Here we isolated SlNPR1 from tomato 'Ailsa Craig' and generated slnpr1 mutants using the  CRISPR/Cas9 system. Analysis of the cis-acting elements indicated that SlNPR1 might be involved in tomato plant response to drought stress. Expression pattern  analysis showed that SlNPR1 was expressed in all plant tissues, and it was strongly induced by drought stress. Thus, we investigated the function of SlNPR1  in tomato-plant drought tolerance. Results showed that slnpr1 mutants exhibited reduced drought tolerance with increased stomatal aperture, higher electrolytic leakage, malondialdehyde (MDA) and hydrogen peroxide (H2O2) levels, and lower activity levels of antioxidant enzymes, compared to wild type (WT) plants. The reduced drought tolerance of slnpr1 mutants was further reflected by the down-regulated expression of drought related key genes, including SlGST, SlDHN, and SlDREB. CONCLUSIONS: Collectively, the data suggest that SlNPR1 is involved in regulating tomato plant drought response. These results aid in further understanding the molecular basis underlying SlNPR1 mediation of tomato drought sensitivity.","tomato","背景：病因関連遺伝子1の非発現因子であるNPR1は、病原体に対する植物防御反応に関与するマスターレギュレーターであり、防御経路におけるその調節メカニズムは比較的明確です。ただし、非生物的ストレスに対する植物の応答におけるNPR1の機能に関する情報はまだ限られています。トマトは世界で4番目に経済的な作物であり、遺伝子研究で採用されている最も特徴的なモデル植物の1つでもあります。安定したトマトNPR1（SlNPR1）変異体がないため、生物的および非生物的ストレスに対するトマトの反応におけるSlNPR1の機能についてはほとんど知られていません。結果：ここでは、トマト「Ailsa Craig」からSlNPR1を分離し、CRISPR / Cas9システムを使用してslnpr1変異体を生成しました。シス作用要素の分析は、SlNPR1が干ばつストレスに対するトマト植物の反応に関与している可能性があることを示した。発現パターン分析は、SlNPR1がすべての植物組織で発現され、干ばつストレスによって強く誘導されたことを示した。したがって、トマト植物の干ばつ耐性におけるSlNPR1の機能を調査した。結果は、slnpr1変異体が、野生型（WT）植物と比較して、気孔開口の増加、電解漏れの増加、マロンジアルデヒド（MDA）および過酸化水素（H2O2）レベル、および抗酸化酵素の活性レベルの低下を伴う干ばつ耐性の低下を示したことを示しました。slnpr1変異体の干ばつ耐性の低下は、SlGST、SlDHN、SlDREBなどの干ばつ関連の重要な遺伝子の発現のダウンレギュレーションによってさらに反映されました。結論：まとめると、データは、SlNPR1がトマト植物の干ばつ応答の調節に関与していることを示唆しています。これらの結果は、トマトの干ばつ感受性のSlNPR1媒介の根底にある分子基盤をさらに理解するのに役立ちます。"]
[274,31645950,"plant","tomato","CRISPR;Cas9;","transglutaminases","Horticulture research","TGase positively regulates photosynthesis via activation of Calvin cycle enzymes  in tomato.",2019,"6:92","[Zhong M et al.]","Nanjing Agricultural University, Nanjing, China.",31645950,"10.1038/s41438-019-0173-z ","Transglutaminases (TGases), which are widespread cross-linking enzymes in plants, play key roles in photosynthesis and abiotic/biotic stress responses; however, evidence concerning the genetics underlying how TGase improves the capability of  photosynthesis and the mechanism of TGase-mediated photosynthesis are not clear in this crop species. In this study, we clarified the function of TGase in the regulation of photosynthesis in tomato by comparing wild-type (WT) plants, tgase  mutants generated by the CRISPR/Cas9 system and TGase-overexpressing (TGaseOE) plants. Our results showed that increasing the transcript level of TGase resulted in an enhanced net photosynthetic rate (Pn), whereas the tgase mutants presented  significantly inhibited Pns and CO2 assimilation compared with the WT. Although the total RuBisCO activity was not affected by TGase, the initial and activation  status of RuBisCO and the activity of RuBisCO activase (RCA) and fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase) in TGaseOE plants were significantly higher  than that in WT plants. Except for RuBisCO small subunit (RbcS), the transcription levels of Benson-Calvin cycle-related genes were positively related to the endogenous TGase activity. Furthermore, TGaseOE plants had higher protein  levels of RuBisCO large subunit (RbcL) and RCA than did WT plants and showed a reduced redox status by enhancing the activity of dehydroascorbate reductase (DHAR) and glutathione reductase (GR), which was compromised in TGase-deficient plants. Overall, TGase positively regulated photosynthesis by maintaining the activation states of the Benson-Calvin cycle and inducing changes in cellular redox homeostasis in tomato.","tomato","植物に広く見られる架橋酵素であるトランスグルタミナーゼ（TGase）は、光合成および非生物的/生物的ストレス応答において重要な役割を果たします。しかし、TGaseが光合成能力をどのように改善するか、およびTGaseを介した光合成のメカニズムの根底にある遺伝学に関する証拠は、この作物種では明らかではありません。本研究では、野生型（WT）植物、CRISPR / Cas9システムによって生成されたtgase変異体、およびTGase過剰発現（TGaseOE）植物を比較することにより、トマトの光合成の調節におけるTGaseの機能を明らかにしました。我々の結果は、TGaseの転写レベルを増加させると正味の光合成速度（Pn）が向上するのに対し、提示されたtgase変異体はWTと比較してPnsとCO2の同化を有意に阻害することを示しました。総RuBisCO活性は、TGaseの影響を受けませんでしたが、RuBisCOの初期および活性化状態と、TGaseOE植物におけるRuBisCOアクチバーゼ（RCA）およびフルクトース-1,6-ビスホスファターゼ（FBPase）の活性は、WT植物よりも有意に高かった。RuBisCO小サブユニット（RbcS）を除いて、Benson-Calvinサイクル関連遺伝子の転写レベルは、内因性TGase活性と正の相関がありました。さらに、TGaseOE植物は、WT植物よりもRuBisCOラージサブユニット（RbcL）およびRCAのタンパク質レベルが高く、TGase-で損なわれたデヒドロアスコルビン酸レダクターゼ（DHAR）およびグルタチオンレダクターゼ（GR）の活性を増強することにより、レドックス状態の低下を示しました。不足している植物。全体として、TGaseは、ベンソン-カルバンサイクルの活性化状態を維持し、トマトの細胞レドックスホメオスタシスの変化を誘発することにより、光合成を積極的に調節しました。"]
[275,30774962,"plant","tomato","CRISPR;Cas9;","SBP-CNR and NAC-NOR transcription factors","Horticulture research","Diversity and redundancy of the ripening regulatory networks revealed by the fruitENCODE and the new CRISPR/Cas9 CNR and NOR mutants.",2019,"6:39","[Gao Y et al.]","China Agricultural University, Beijing, China.",30774962,"10.1038/s41438-019-0122-x ","Tomato is considered as the genetic model for climacteric fruits, in which three  major players control the fruit ripening process: ethylene, ripening transcription factors, and DNA methylation. The fruitENCODE project has now shown that there are multiple transcriptional circuits regulating fruit ripening in different species, and H3K27me3, instead of DNA methylation, plays a conserved role in restricting these ripening pathways. In addition, the function of the core tomato ripening transcription factors is now being questioned. We have employed CRISPR/Cas9 genome editing to mutate the SBP-CNR and NAC-NOR transcription factors, both of which are considered as master regulators in the current tomato ripening model. These plants only displayed delayed or partial non-ripening phenotypes, distinct from the original mutant plants, which categorically failed to ripen, suggesting that they might be gain-of-function mutants. Besides increased DNA methylation genome-wide, the original mutants also have hyper-H3K27me3 in ripening gene loci such as ACS2, RIN, and TDR4. It is most likely that multiple genetic and epigenetic factors have contributed to their strong non-ripening phenotypes. Hence, we propose that the field should move beyond these linear and two-dimensional models and embrace the fact that important biological processes such as ripening are often regulated by highly redundant network with inputs from multiple levels.","tomato","トマトは、クライマクテリックフルーツの遺伝モデルと見なされており、エチレン、成熟転写因子、DNAメチル化の3つの主要なプレーヤーがフルーツの成熟プロセスを制御します。FruitENCODEプロジェクトは、異なる種の果実の成熟を調節する複数の転写回路があり、DNAメチル化の代わりにH3K27me3がこれらの成熟経路を制限する上で保存された役割を果たしていることを示しました。さらに、コアトマト熟成転写因子の機能が現在疑問視されています。CRISPR / Cas9ゲノム編集を使用して、SBP-CNRおよびNAC-NOR転写因子を変異させました。これらは両方とも、現在のトマト熟成モデルのマスターレギュレーターと見なされています。これらの植物は、成熟に断固として失敗した元の突然変異体植物とは異なり、遅延または部分的な非成熟表現型のみを示し、機能獲得型突然変異体である可能性があることを示唆している。ゲノム全体でのDNAメチル化の増加に加えて、元の変異体は、ACS2、RIN、TDR4などの成熟遺伝子遺伝子座にハイパーH3K27me3も持っています。複数の遺伝的およびエピジェネティックな要因が、それらの強い非熟成表現型に寄与している可能性が最も高いです。したがって、フィールドはこれらの線形および2次元モデルを超えて移動し、熟成などの重要な生物学的プロセスが複数のレベルからの入力を持つ非常に冗長なネットワークによって規制されることが多いという事実を受け入れる必要があることを提案します。"]
[276,31564035,"plant","tomato","Agroinfiltration;","PaM6PR; PaCWI; PaSUS1","Molecular biotechnology","Host-Induced Silencing of Some Important Genes Involved in Osmoregulation of Parasitic Plant Phelipanche aegyptiaca.",2019,"61(12):929-937","[Farrokhi Z et al.]","University of Tehran, Karaj, Iran.",31564035,"10.1007/s12033-019-00215-0 ","Broomrape is an obligate root-parasitic weed that acts as a competitive sink for  host photoassimilates. Disruption of essential processes for growth of broomrape  using host plant-mediated systemic signals can help to implement more specific and effective management plans of this parasite. Accordingly, we tested the possibility of transient silencing three involved genes (PaM6PR, PaCWI, and PaSUS1) in osmoregulation process of broomrape using syringe agroinfiltration of  dsRNA constructs in tomato. The highest decrease in mRNA levels, enzyme activity, and amount of total reducing sugars was observed in Phelipanche aegyptiaca when grown on agroinfiltrated tomato plants by PaM6PR dsRNA construct than control. In addition, PaSUS1 dsRNA construct showed high reduction in mRNA abundance (32-fold fewer than control). The lowest decrease in mRNA levels was observed after infiltration of PaCWI dsRNA construct (eightfold fewer than control). While the highest reduction in PaM6PR and PaSUS1 expression levels was detected in the parasite at 3 days post-infiltration (dpi), the maximum reduction in both of the  total reducing sugars amount and M6PR and SUS1 activities was observed at 8 dpi.  On the contrary, CWI activity, PaCWI expression level, and amount of total reducing sugars in broomrape shoots simultaneously decreased at the day 3 after the dsRNA construct infiltration against PaCWI. On the whole, our results indicated that the three studied genes especially PaM6PR may constitute appropriate targets for the development of transgenic resistance in host plants using silencing strategy.","tomato","ブルームレイプは、宿主の光同化物の競争力のあるシンクとして機能する義務的な根寄生性雑草です。宿主植物を介した全身シグナルを使用したほうきの成長に不可欠なプロセスの中断は、この寄生虫のより具体的で効果的な管理計画を実施するのに役立ちます。したがって、トマトのdsRNAコンストラクトのシリンジアグロインフィルトレーションを使用して、ほうきの浸透圧調節プロセスで3つの関与する遺伝子（PaM6PR、PaCWI、およびPaSUS1）を一時的にサイレンシングする可能性をテストしました。対照よりもPaM6PRdsRNA構築物によって農業浸潤トマト植物上で成長させた場合、mRNAレベル、酵素活性、および総還元糖の量の最大の減少がPhelipancheaegyptiacaで観察された。さらに、PaSUS1 dsRNAコンストラクトは、mRNA量の大幅な減少を示しました（コントロールの32分の1）。mRNAレベルの最低の減少は、PaCWI dsRNAコンストラクトの浸潤後に観察されました（コントロールの8分の1）。PaM6PRとPaSUS1の発現レベルの最大の低下は浸潤後3日（dpi）の寄生虫で検出されましたが、総還元糖量とM6PRおよびSUS1活性の両方の最大の低下は8dpiで観察されました。逆に、ほうきの芽のCWI活性、PaCWI発現レベル、および総還元糖の量は、PaCWIに対するdsRNAコンストラクトの浸潤後3日目に同時に減少しました。全体として、我々の結果は、3つの研究された遺伝子、特にPaM6PRが、サイレンシング戦略を使用した宿主植物におけるトランスジェニック耐性の発生のための適切な標的を構成する可能性があることを示した。"]
[277,31814125,"plant","tomato","CRISPR;Cas9;","ripening inhibitor","New phytologist","Roles of RIN and ethylene in tomato fruit ripening and ripening-associated traits.",2019,null,"[Li S et al.]","Zhejiang University, Zijingang Campus, Hangzhou, China.",31814125,"10.1111/nph.16362 ","RIPENING INHIBITOR (RIN)-deficient fruits generated by CRISPR/Cas9 initiated partial ripening at a similar time to wild-type (WT) fruits but only 10% WT concentrations of carotenoids and ethylene (ET) were synthesized. RIN-deficient fruit never ripened completely, even when supplied with exogenous ET. The low amount of endogenous ET that they did produce was sufficient to enable ripening initiation and this could be suppressed by the ET perception inhibitor 1-MCP. The reduced ET production by RIN-deficient tomatoes was due to an inability to induce autocatalytic system-2 ET synthesis, a characteristic feature of climacteric ripening. Production of volatiles and transcripts of key volatile biosynthetic genes also were greatly reduced in the absence of RIN. By contrast, the initial extent and rates of softening in the absence of RIN were similar to WT fruits, although detailed analysis showed that the expression of some cell wall-modifying enzymes was delayed and others increased in the absence of RIN. These results support a model where RIN and ET, via ERFs, are required for full expression of ripening genes. Ethylene initiates ripening of mature green fruit, upregulates RIN expression and other changes, including system-2 ET production. RIN, ET and other factors are required for completion of the full fruit-ripening programme.","tomato","熟成阻害剤（RIN）-CRISPR / Cas9によって生成された欠損果実は、野生型（WT）果実と同じ時期に部分熟成を開始しましたが、カロテノイドとエチレン（ET）のWT濃度はわずか10％でした。RINが不足している果物は、外因性のETが供給された場合でも、完全に熟することはありません。彼らが生成した少量の内因性ETは、熟成の開始を可能にするのに十分であり、これはET知覚阻害剤1-MCPによって抑制できた。RIN欠損トマトによるET産生の低下は、クライマクテリック熟成の特徴である自己触媒システム2ET合成を誘導できないことが原因でした。揮発性物質の生成および主要な揮発性生合成遺伝子の転写物も、RINの非存在下で大幅に減少しました。対照的に、RINの非存在下での軟化の初期の程度と速度は、WT果実と同様でしたが、詳細な分析では、RINの非存在下で一部の細胞壁修飾酵素の発現が遅延し、他の酵素の発現が増加したことが示されました。これらの結果は、ERFを介したRINおよびETが成熟遺伝子の完全な発現に必要なモデルをサポートしています。エチレンは成熟した緑色の果実の熟成を開始し、RINの発現およびシステム2ETの生成を含むその他の変化をアップレギュレートします。完全な果実熟成プログラムを完了するには、RIN、ET、およびその他の要素が必要です。"]
[278,30537089,"plant","tomato","CRISPR;Cas9;","PHOSPHATE 1 (SlPHO1;1)","Physiologia plantarum","A CRISPR/Cas9 deletion into the phosphate transporter SlPHO1;1 reveals its role in phosphate nutrition of tomato seedlings.",2019,"167(4):556-563","[Zhao P  et al.]","Nanchang Normal University, Nanchang, China.",30537089,"10.1111/ppl.12897 ","In vascular (Arabidopsis thaliana) and non-vascular (Physcomitrella patens) plants, PHOSPHATE 1 (PHO1) homologs play important roles in the acquisition and transfer of phosphate. The tomato genome contains six genes (SlPHO1;1-SlPHO1;6) homologous to AtPHO1. The six proteins have typical characteristics of the plant  PHO1 family, such as the three Syg1/Pho81/XPRI (SPX) subdomains in the N-terminal portion and one ERD1/XPR1/SYG1 (EXS) domain in the C-terminal portion. Phylogenetic analysis revealed that the SlPHO1 family is subdivided into three clusters. A pairwise comparison indicated that SlPHO1;1 showed the highest level  of sequence identity/similarity (67.39/76.21%) to AtPHO1. SlPHO1;1 deletion mutants induced by clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 displayed typical phenotypes of Pi starvation, such as decreased shoot fresh weight and increased root fresh weight, therefore having a greater root-to-shoot ratio. Mutants also accumulated more anthocyanin and had more soluble Pi content in the root and less in the shoot. These results indicate that SlPHO1;1 plays an important role in Pi transport in the tomato at seedling stage.","tomato","血管（Arabidopsisthaliana）および非血管（Physcomitrella patens）植物では、リン酸1（PHO1）ホモログがリン酸の獲得と移動に重要な役割を果たします。トマトのゲノムには、AtPHO1に相同な6つの遺伝子（SlPHO1; 1-SlPHO1; 6）が含まれています。6つのタンパク質は、N末端部分に3つのSyg1 / Pho81 / XPRI（SPX）サブドメイン、C末端部分に1つのERD1 / XPR1 / SYG1（EXS）ドメインなど、植物PHO1ファミリーの典型的な特性を備えています。系統発生学的分析により、SlPHO1ファミリーは3つのクラスターに細分されていることが明らかになりました。ペアワイズ比較は、SlPHO1; 1がAtPHO1に対して最高レベルの配列同一性/類似性（67.39 / 76.21％）を示したことを示しました。クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ Cas9によって誘発されたSlPHO1; 1欠失変異体は、シュートの新鮮重量の減少や根の新鮮重量の増加など、Pi飢餓の典型的な表現型を示したため、根とシュートの比率が高くなりました。変異体はまた、より多くのアントシアニンを蓄積し、根に多くの可溶性Pi含有量を持ち、シュートには少なかった。これらの結果は、SlPHO1; 1が苗の段階でトマトのPi輸送に重要な役割を果たしていることを示しています。"]
[279,30597099,"plant","tomato","CRISPR;Cas9;","bZIP transcription factor (SlHY5)","Plant & cell physiology","Identification of Candidate HY5-Dependent and -Independent Regulators of Anthocyanin Biosynthesis in Tomato.",2019,"60(3):643-656","[Qiu Z et al.]","South China Agricultural University, Guangzhou, China.",30597099,"10.1093/pcp/pcy236 ","High quantities of anthocyanins in plants confer potential protective benefits against biotic and abiotic stressors. Studies have shown that the bZIP transcription factor HY5 plays a key role in controlling anthocyanin accumulation in response to light. However, in hy5 mutants, residual anthocyanins have been detected, indicating that other regulators exist to regulate anthocyanin biosynthesis in an HY5-independent manner. Here, we employed the CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspersed short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9) system specifically to induce targeted mutagenesis of SlHY5 in the purple tomato cultivar 'Indigo Rose'. The T2 generation of tomato plants homozygous for the null allele of the SlHY5 frameshift mutated by a 1 bp insertion contained a lower anthocyanin content. Transcriptional analysis showed  that most of the anthocyanin biosynthesis structural genes and several regulatory genes were down-regulated in the hy5 mutant lines. With transcriptome analyses of the various tissues from hy5 mutant lines, eight candidate transcription factors  were identified that may regulate anthocyanin biosynthesis in an HY5-independent  manner. These findings deepen our understanding of how light controls anthocyanin accumulation and facilitate the identification of the regulators of anthocyanin biosynthesis in an HY5-independent manner.","tomato","植物中の大量のアントシアニンは、生物的および非生物的ストレス要因に対する潜在的な保護効果をもたらします。研究によると、bZIP転写因子HY5は、光に反応してアントシアニンの蓄積を制御する上で重要な役割を果たしています。ただし、hy5変異体では、残留アントシアニンが検出されており、HY5に依存しない方法でアントシアニン生合成を調節する他の調節因子が存在することを示しています。ここでは、特に紫色のトマト栽培品種「インディゴローズ」でSlHY5の標的突然変異誘発を誘発するために、CRISPR / Cas9（クラスター化された規則的に散在する短いパリンドロームリピート/ CRISPR関連タンパク質9）システムを採用しました。1 bpの挿入によって変異したSlHY5フレームシフトのヌル対立遺伝子についてホモ接合性のトマト植物のT2世代は、より低いアントシアニン含有量を含んでいました。転写分析は、ほとんどのアントシアニン生合成構造遺伝子といくつかの調節遺伝子がhy5変異株でダウンレギュレートされていることを示しました。hy5変異株からのさまざまな組織のトランスクリプトーム解析により、HY5に依存しない方法でアントシアニン生合成を調節する可能性のある8つの候補転写因子が同定されました。これらの発見は、光がアントシアニンの蓄積をどのように制御するかについての理解を深め、HY5に依存しない方法でアントシアニン生合成の調節因子の同定を容易にします。"]
[280,31983879,"plant","tomato","CRISPR;Cas9;","SlS5alphaR1; SlS5alphaR2","Plant biotechnology","Characterization of steroid 5alpha-reductase involved in alpha-tomatine biosynthesis in tomatoes.",2019,"36(4):253-263","[Akiyama R et al.]","Kobe University, Kobe, Hyogo, Japan.",31983879,"10.5511/plantbiotechnology.19.1030a ","alpha-tomatine and dehydrotomatine are steroidal glycoalkaloids (SGAs) that accumulate in the mature green fruits, leaves, and flowers of tomatoes (Solanum lycopersicum) and function as defensive compounds against pathogens and predators. The aglycones of alpha-tomatine and dehydrotomatine are tomatidine and dehydrotomatidine (5,6-dehydrogenated tomatidine), and tomatidine is derived from dehydrotomatidine via four reaction steps: C3 oxidation, isomerization, C5alpha reduction, and C3 reduction. Our previous studies (Lee et al. 2019) revealed that Sl3betaHSD is involved in the three reactions except for C5alpha reduction, and in the present study, we aimed to elucidate the gene responsible for the C5alpha  reduction step in the conversion of dehydrotomatidine to tomatidine. We characterized the two genes, SlS5alphaR1 and SlS5alphaR2, which show high homology with DET2, a brassinosteroid 5alpha reductase of Arabidopsis thaliana. The expression pattern of SlS5alphaR2 is similar to those of SGA biosynthetic genes, while SlS5alphaR1 is ubiquitously expressed, suggesting the involvement of SlS5alphaR2 in SGA biosynthesis. Biochemical analysis of the recombinant proteins revealed that both of SlS5alphaR1 and SlS5alphaR2 catalyze the reduction of tomatid-4-en-3-one at C5alpha to yield tomatid-3-one. Then, SlS5alphaR1- or SlS5alphaR2-knockout hairy roots were constructed using CRISPR/Cas9 mediated genome editing. In the SlS5alphaR2-knockout hairy roots, the alpha-tomatine level was significantly decreased and dehydrotomatine was accumulated. On the other hand, no change in the amount of alpha-tomatine was observed in the SlS5alphaR1-knockout hairy root. These results indicate that SlS5alphaR2 is responsible for the C5alpha reduction in alpha-tomatine biosynthesis and that SlS5alphaR1 does not significantly contribute to alpha-tomatine biosynthesis.","tomato","アルファトマチンとデヒドロトマチンは、トマト（Solanum lycopersicum）の成熟した緑色の果物、葉、花に蓄積し、病原体や捕食者に対する防御化合物として機能するステロイド糖アルカロイド（SGA）です。アルファトマチンとデヒドロトマチンのアグリコンはトマチジンとデヒドロトマチジン（5,6-脱水素トマチジン）であり、トマチジンはデヒドロトマチジンから4つの反応ステップ（C3酸化、異性化、C5アルファ還元、C3還元）を介して誘導されます。私たちの以前の研究（Lee etal。2019）は、Sl3betaHSDがC5alpha還元を除く3つの反応に関与していることを明らかにし、本研究では、デヒドロトマチジンからトマチンへの変換におけるC5alpha還元ステップの原因となる遺伝子を解明することを目的としました。我々は、Arabidopsisthalianaのブラシノステロイド5alphaレダクターゼであるDET2と高い相同性を示す2つの遺伝子SlS5alphaR1とSlS5alphaR2を特徴づけました。SlS5alphaR2の発現パターンはSGA生合成遺伝子の発現パターンと類似していますが、SlS5alphaR1は遍在的に発現しており、SGA生合成におけるSlS5alphaR2の関与を示唆しています。組換えタンパク質の生化学的分析により、SlS5alphaR1とSlS5alphaR2の両方がC5alphaでのトマト-4-エン-3-オンの還元を触媒してトマト-3-オンを生成することが明らかになりました。次に、CRISPR / Cas9を介したゲノム編集を使用してSlS5alphaR1-またはSlS5alphaR2-ノックアウト毛状根を構築しました。SlS5alphaR2ノックアウト毛深い根では、アルファ-トマチンレベルが大幅に減少し、デヒドロトマチンが蓄積されました。一方、SlS5alphaR1ノックアウト毛根ではアルファトマチン量の変化は見られなかった。これらの結果は、SlS5alphaR2がアルファ-トマチン生合成のC5alpha減少に関与しており、SlS5alphaR1がアルファ-トマチン生合成に有意に寄与していないことを示しています。"]
[281,30183125,"plant","tomato","CRISPR;Cas9;","SlJAZ2","Plant biotechnology journal","Design of a bacterial speck resistant tomato by CRISPR/Cas9-mediated editing of SlJAZ2.",2019,"17(3):665-673","[Ortigosa A et al.]","Centro Nacional de Biotecnologia,  Consejo Superior de Investigaciones Cientificas (CNB-CSIC), Madrid, Spain.",30183125,"10.1111/pbi.13006 ","Due to their different lifestyles, effective defence against biotrophic pathogens normally leads to increased susceptibility to necrotrophs, and vice versa. Solving this trade-off is a major challenge for obtaining broad-spectrum resistance in crops and requires uncoupling the antagonism between the jasmonate  (JA) and salicylate (SA) defence pathways. Pseudomonas syringae pv. tomato (Pto)  DC3000, the causal agent of tomato bacterial speck disease, produces coronatine (COR) that stimulates stomata opening and facilitates bacterial leaf colonization. In Arabidopsis, stomata response to COR requires the COR co-receptor AtJAZ2, and dominant AtJAZ2Deltajas repressors resistant to proteasomal degradation prevent stomatal opening by COR. Here, we report the generation of a tomato variety resistant to the bacterial speck disease caused by PtoDC3000 without compromising resistance to necrotrophs. We identified the functional ortholog of AtJAZ2 in tomato, found that preferentially accumulates in stomata and proved that SlJAZ2 is a major co-receptor of COR in stomatal guard cells. SlJAZ2 was edited using CRISPR/Cas9 to generate dominant JAZ2 repressors lacking the C-terminal Jas domain (SlJAZ2Deltajas). SlJAZ2Deltajas prevented stomatal reopening by COR and provided resistance to PtoDC3000. Water transpiration rate and resistance to the necrotrophic fungal pathogen Botrytis cinerea, causal agent of the tomato gray mold, remained unaltered in Sljaz2Deltajas plants. Our results solve the defence trade-off in a crop, by spatially uncoupling the SA-JA hormonal antagonism at the stomata, entry gates of specific microbes such as PtoDC3000. Moreover, our results also constitute a novel CRISPR/Cas-based strategy for crop protection that could be readily implemented in the field.","tomato","ライフスタイルが異なるため、生物栄養性病原体に対する効果的な防御は通常、壊死栄養素に対する感受性の増加につながり、逆もまた同様です。このトレードオフを解決することは、作物の幅広い耐性を得るための主要な課題であり、ジャスモネート（JA）とサリチル酸（SA）の防御経路間の拮抗作用を切り離す必要があります。Pseudomonas syringaepv。トマト（Pto）DC3000は、トマトの細菌斑点病の原因物質であり、口蓋の開口部を刺激し、細菌の葉のコロニー形成を促進するコロナチン（COR）を生成します。アラビドプシスでは、CORに対する気孔反応には、COR共受容体AtJAZ2が必要であり、プロテアソーム分解に耐性のある優勢なAtJAZ2Deltajasリプレッサーは、CORによる気孔開口を防ぎます。ここでは、壊死栄養素に対する耐性を損なうことなく、PtoDC3000によって引き起こされる細菌斑点病に耐性のあるトマト品種の生成を報告します。トマトにおけるAtJAZ2の機能的オルソログを特定し、気孔に優先的に蓄積することを発見し、SlJAZ2が気孔孔辺細胞におけるCORの主要な補助受容体であることを証明しました。SlJAZ2は、CRISPR / Cas9を使用して編集され、C末端のJasドメイン（SlJAZ2Deltajas）を欠く主要なJAZ2リプレッサーを生成しました。SlJAZ2Deltajasは、CORによる気孔の再開を防ぎ、PtoDC3000への耐性を提供しました。Sljaz2Deltajas植物では、水の蒸散速度と壊死栄養性真菌病原体であるBotrytis cinerea（トマト灰色カビの原因物質）に対する耐性は変化していませんでした。私たちの結果は、PtoDC3000などの特定の微生物の入口ゲートである気孔でのSA-JAホルモン拮抗作用を空間的に切り離すことにより、作物の防御のトレードオフを解決します。さらに、私たちの結果は、現場で容易に実施できる作物保護のための新しいCRISPR / Casベースの戦略も構成しています。"]
[282,29797460,"plant","tomato","CRISPR;Cas9;","PROCERA","Plant biotechnology journal","Using CRISPR/Cas9 genome editing in tomato to create a gibberellin-responsive dominant dwarf DELLA allele.",2019,"17(1):132-140","[Tomlinson L  et al.]","Sainsbury Laboratory, Norwich, UK.",29797460,"10.1111/pbi.12952 ","The tomato PROCERA gene encodes a DELLA protein, and loss-of-function mutations derepress growth. We used CRISPR/Cas9 and a single guide RNAs (sgRNA) to target mutations to the PROCERA DELLA domain, and recovered several loss-of-function mutations and a dominant dwarf mutation that carries a deletion of one amino acid in the DELLA domain. This is the first report of a dominant dwarf PROCERA allele. This allele retains partial responsiveness to exogenously applied gibberellin. Heterozygotes show an intermediate phenotype at the seedling stage, but adult heterozygotes are as dwarfed as homozygotes.","tomato","トマトのPROCERA遺伝子はDELLAタンパク質をコードしており、機能喪失型変異は成長を抑制しません。CRISPR / Cas9とシングルガイドRNA（sgRNA）を使用して、変異をPROCERA DELLAドメインにターゲティングし、いくつかの機能喪失型変異と、DELLAドメインの1つのアミノ酸の欠失を伴う優勢な矮性変異を回収しました。これは、支配的な矮星PROCERA対立遺伝子の最初の報告です。この対立遺伝子は、外因的に適用されたジベレリンに対して部分的な応答性を保持します。ヘテロ接合体は苗の段階で中間の表現型を示しますが、成体のヘテロ接合体はホモ接合体と同じくらい矮小です。"]
[283,30894458,"plant","tomato","CRISPR;Cas9;","MYB transcription factor SlMYB21","Plant cell","Tomato MYB21 Acts in Ovules to Mediate Jasmonate-Regulated Fertility.",2019,"31(5):1043-1062","[Schubert R  et al.]","Institute of Plant Biochemistry, Halle, Germany.",30894458,"10.1105/tpc.18.00978 ","The function of the plant hormone jasmonic acid (JA) in the development of tomato (Solanum lycopersicum) flowers was analyzed with a mutant defective in JA perception (jasmonate-insensitive1-1, jai1-1). In contrast with Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) JA-insensitive plants, which are male sterile, the tomato  jai1-1 mutant is female sterile, with major defects in female development. To identify putative JA-dependent regulatory components, we performed transcriptomics on ovules from flowers at three developmental stages from wild type and jai1-1 mutants. One of the strongly downregulated genes in jai1-1 encodes the MYB transcription factor SlMYB21. Its Arabidopsis ortholog plays a crucial role in JA-regulated stamen development. SlMYB21 was shown here to exhibit transcription factor activity in yeast, to interact with SlJAZ9 in yeast  and in planta, and to complement Arabidopsis myb21-5 To analyze SlMYB21 function, we generated clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR associated protein 9 (Cas9) mutants and identified a mutant by Targeting Induced Local Lesions in Genomes (TILLING). These mutants showed female sterility, corroborating a function of MYB21 in tomato ovule development. Transcriptomics analysis of wild type, jai1-1, and myb21-2 carpels revealed processes that might be controlled by SlMYB21. The data suggest positive regulation of JA biosynthesis by SlMYB21, but negative regulation of auxin and gibberellins. The results demonstrate that SlMYB21 mediates at least partially the action of JA and might control the flower-to-fruit transition..","tomato","トマト（Solanum lycopersicum）の花の発育における植物ホルモンジャスモン酸（JA）の機能を、JA知覚に欠陥のある変異体（ジャスモン酸非感受性1-1、jai1-1）で分析しました。男性が無菌であるArabidopsis（Arabidopsis thaliana）JA非感受性植物とは対照的に、トマトjai1-1変異体は女性が無菌であり、女性の発育に大きな欠陥があります。推定上のJA依存の調節成分を特定するために、野生型およびjai1-1変異体からの3つの発達段階にある花からの卵子に対してトランスクリプトミクスを実行しました。jai1-1の強くダウンレギュレートされた遺伝子の1つは、MYB転写因子SlMYB21をコードしています。そのArabidopsisオルソログは、JAが規制する雄しべの発達に重要な役割を果たします。SlMYB21は、酵母で転写因子活性を示し、酵母および植物でSlJAZ9と相互作用し、Arabidopsis myb21-5を補完することがここに示されました。SlMYB21機能を分析するために、クラスター化された規則的な間隔の短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9を生成しました。 （Cas9）変異体であり、ゲノムの誘発局所病変を標的とすることにより変異体を同定しました（TILLING）。これらの変異体は雌の不稔を示し、トマト胚珠の発達におけるMYB21の機能を裏付けています。野生型、jai1-1、およびmyb21-2の心皮のトランスクリプトーム解析により、SlMYB21によって制御される可能性のあるプロセスが明らかになりました。データは、SlMYB21によるJA生合成の正の調節を示唆しているが、オーキシンおよびジベレリンの負の調節を示唆している。結果は、SlMYB21がJAの作用を少なくとも部分的に媒介し、花から果実への移行を制御する可能性があることを示しています。"]
[284,30828904,"plant","tomato","CRISPR;Cas9;","zinc-finger transcription factor LOL1 (LSD ONE LIKE1; CcLOL1) tomato ortholog","Plant journal","The zinc-finger transcription factor CcLOL1 controls chloroplast development and  immature pepper fruit color in Capsicum chinense and its function is conserved in tomato.",2019,"99(1):41-55","[Borovsky Y et al.]","Institute of Plant Science, Agricultural Research Organization, Rishon LeZion, Israel.",30828904,"10.1111/tpj.14305 ","Chloroplast development and chlorophyll content in the immature fruit has a major impact on the morphology and quality in pepper (Capsicum spp.) fruit. Two major quantitative trait loci (QTLs), pc1 and pc10 that affect chlorophyll content in the pepper fruit by modulation of chloroplast compartment size were previously identified in chromosomes 1 and 10, respectively. The pepper homolog of GOLDEN2-LIKE transcription factor (CaGLK2) has been found as underlying pc10, similar to its effect on tomato chloroplast development. In the present study, we identified the pepper homolog of the zinc-finger transcription factor LOL1 (LSD ONE LIKE1; CcLOL1) as the gene underlying pc1. LOL1 has been identified in Arabidopsis as a positive regulator of programmed cell death and we report here on its role in controlling fruit development in the Solanaceae in a fruit-specific manner. The light-green C. chinense parent used for QTL mapping was found to carry a null mutation in CcLOL1. Verification of the function of the gene was done by generating CRISPR/Cas9 knockout mutants of the orthologous tomato gene resulting in light-green tomato fruits, indicating functional conservation of the orthologous genes in controlling chlorophyll content in the Solanaceae. Transcriptome profiling of light and dark-green bulks differing for pc1, showed that the QTL affects multiple photosynthesis and oxidation-reduction  associated genes in the immature green fruit. Allelic diversity of three known genes CcLOL1, CaGLK2, and CcAPRR2 that influence pepper immature fruit color, was found to be associated with variation in chlorophyll content primarily in C. chinense.","tomato","未熟な果実のクロロプラストの発達とクロロフィル含有量は、コショウ（Capsicum spp。）果実の形態と品質に大きな影響を及ぼします。葉緑体コンパートメントサイズの調節によってコショウ果実のクロロフィル含有量に影響を与える2つの主要な定量的形質遺伝子座（QTL）、pc1およびpc10は、それぞれ染色体1および10で以前に同定されました。GOLDEN2-LIKE転写因子（CaGLK2）のペッパーホモログは、トマト葉緑体の発達への影響と同様に、基礎となるpc10として発見されています。本研究では、pc1の基礎となる遺伝子として亜鉛指転写因子LOL1（LSD ONE LIKE1; CcLOL1）のペッパーホモログを同定しました。LOL1は、プログラムされた細胞死の正の調節因子としてアラビドプシスで同定されており、ここでは、ソラナ科の果実の発達を果実特異的に制御する上でのその役割について報告します。QTLマッピングに使用された薄緑色のC.chinenseの親は、CcLOL1にヌル変異を持っていることがわかりました。遺伝子の機能の検証は、オーソロガストマト遺伝子のCRISPR / Cas9ノックアウト変異体を生成することによって行われ、薄緑色のトマト果実が得られました。これは、ソラナ科のクロロフィル含有量の制御におけるオーソロガス遺伝子の機能的保存を示しています。pc1で異なる明緑色と暗緑色のバルクのトランスクリプトームプロファイリングは、QTLが未熟な緑色の果実の複数の光合成と酸化還元関連遺伝子に影響を与えることを示しました。コショウの未熟な果実の色に影響を与える3つの既知の遺伝子CcLOL1、CaGLK2、およびCcAPRR2の対立遺伝子の多様性は、主にC.chinenseのクロロフィル含有量の変動に関連していることがわかりました。"]
[285,30673841,"plant","tomato","CRISPR;Cas9;","Brassinosteroid-insensitive 1 (SlBRI1)","Planta","Brassinosteroids facilitate xylem differentiation and wood formation in tomato.",2019,"249(5):1391-1403","[Lee J et al.]","Chungbuk National University, Cheongju, Korea.",30673841,"10.1007/s00425-019-03094-6 ","MAIN CONCLUSION: BR signaling pathways facilitate xylem differentiation and wood  formation by fine tuning SlBZR1/SlBZR2-mediated gene expression networks involved in plant secondary growth. Brassinosteroid (BR) signaling and BR crosstalk with diverse signaling cues are involved in the pleiotropic regulation of plant growth and development. Recent studies reported the critical roles of BR biosynthesis and signaling in vascular bundle development and plant secondary growth; however, the molecular bases of these roles are unclear. Here, we performed comparative physiological and anatomical analyses of shoot morphological growth in a cultivated wild-type tomato (Solanum lycopersicum cv. BGA) and a BR biosynthetic  mutant [Micro Tom (MT)]. We observed that the canonical BR signaling pathway was  essential for xylem differentiation and sequential wood formation by facilitating plant secondary growth. The gradual retardation of xylem development phenotypes during shoot vegetative growth in the BR-deficient MT tomato mutant recovered completely in response to exogenous BR treatment or genetic complementation of the BR biosynthetic DWARF (D) gene. By contrast, overexpression of the tomato Glycogen synthase kinase 3 (SlGSK3) or CRISPR-Cas9 (CR)-mediated knockout of the  tomato Brassinosteroid-insensitive 1 (SlBRI1) impaired BR signaling and resulted  in severely defective xylem differentiation and secondary growth. Genetic modulation of the transcriptional activity of the tomato Brassinazole-resistant 1/2 (SlBZR1/SlBZR2) confirmed the positive roles of BR signaling pathways for xylem differentiation and secondary growth. Our data indicate that BR signaling pathways directly promote xylem differentiation and wood formation by canonical BR-activated SlBZR1/SlBZR2.","tomato","主な結論：BRシグナル伝達経路は、植物の二次成長に関与するSlBZR1 / SlBZR2を介した遺伝子発現ネットワークを微調整することにより、キシレムの分化と木材の形成を促進します。ブラシノステロイド（BR）シグナル伝達と、多様なシグナル伝達キューを備えたBRクロストークは、植物の成長と発達の多面的調節に関与しています。最近の研究では、維管束の発達と植物の二次成長におけるBR生合成とシグナル伝達の重要な役割が報告されています。ただし、これらの役割の分子基盤は不明です。ここでは、栽培された野生型トマト（Solanum lycopersicumcv。BGA）とBR生合成変異体[Micro Tom（MT）]におけるシュートの形態学的成長の生理学的および解剖学的比較分析を行いました。我々は、標準的なBRシグナル伝達経路が、植物の二次成長を促進することにより、木部の分化と連続的な木材形成に不可欠であることを観察しました。BR欠損MTトマト変異体のシュート栄養成長中のキシレム発達表現型の漸進的な遅延は、外因性BR治療またはBR生合成DWARF（D）遺伝子の遺伝的補完に応答して完全に回復した。対照的に、トマトグリコーゲンシンターゼキナーゼ3（SlGSK3）またはCRISPR-Cas9（CR）を介したトマトブラシノステロイド非感受性1（SlBRI1）のノックアウトの過剰発現は、BRシグナル伝達を損ない、キシレムの分化と二次成長に深刻な欠陥をもたらしました。トマトのブラッシナゾール耐性1/2（SlBZR1 / SlBZR2）の転写活性の遺伝的調節により、キシレムの分化と二次成長に対するBRシグナル伝達経路の正の役割が確認されました。私たちのデータは、BRシグナル伝達経路が標準的なBR活性化SlBZR1 / SlBZR2による木部分化と木材形成を直接促進することを示しています。"]
[286,31391538,"plant","tomato","CRISPR;Cas9;","carotenoid cleavage dioxygenase 8","Scientific reports","CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of CAROTENOID CLEAVAGE DIOXYGENASE 8 in tomato provides resistance against the parasitic weed Phelipanche aegyptiaca.",2019,"9(1):11438","[Bari VK  et al.]","Agricultural Research Organization (ARO), Volcani Center, Ramat Yishay, Israel.",31391538,"10.1038/s41598-019-47893-z ","Broomrapes (Phelipanche aegyptiaca and Orobanche spp.) are obligate plant parasites that cause extreme damage to crop plants. The parasite seeds have strict requirements for germination, involving preconditioning and exposure to specific chemicals strigolactones [SLs] exuded by the host roots. SLs are plant hormones derived from plant carotenoids via a pathway involving the Carotenoid Cleavage Dioxygenase 8 (CCD8). Having no effective means to control parasitic weeds in most crops, and with CRISPR/Cas9 being an effective gene-editing tool, here we demonstrate that CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of the CCD8 gene can be used to develop host resistance to the parasitic weed P. aegyptiaca. Cas9/single  guide (sg) RNA constructs were targeted to the second exon of CCD8 in tomato (Solanum lycopersicum L.) plants. Several (CCD8)Cas9 mutated tomato lines with variable insertions or deletions in CCD8 were obtained with no identified off-targets. Genotype analysis of T1 plants showed that the introduced CCD8 mutations are inherited. Compared to control tomato plants, the (CCD8)Cas9 mutant had morphological changes that included dwarfing, excessive shoot branching and adventitious root formation. In addition, SL-deficient (CCD8)Cas9 mutants showed  a significant reduction in parasite infestation compared to non-mutated tomato plants. In the (CCD8)Cas9 mutated lines, orobanchol (SL) content was significantly reduced but total carotenoids level and expression of genes related to carotenoid biosynthesis were increased, as compared to control plants. Taking  into account, the impact of plant parasitic weeds on agriculture and difficulty to constitute efficient control methods, the current study offers insights into the development of a new, efficient method that could be combined with various collections of resistant tomato rootstocks.","tomato","ブルームレイプ（PhelipancheaegyptiacaおよびOrobanchespp。）は、作物植物に極度の損傷を与える義務的な植物寄生虫です。寄生虫の種子には、発芽に厳しい要件があり、プレコンディショニングと、宿主の根から滲出する特定の化学物質であるストリゴラクトン[SL]への曝露が含まれます。SLは、カロテノイド開裂ジオキシゲナーゼ8（CCD8）が関与する経路を介して植物カロテノイドに由来する植物ホルモンです。ほとんどの作物で寄生雑草を制御する効果的な手段がなく、CRISPR / Cas9が効果的な遺伝子編集ツールであるため、ここでは、CCD8遺伝子のCRISPR / Cas9を介した突然変異誘発を使用して、寄生雑草に対する宿主の耐性を発達させることができることを示します。 P.aegyptiaca。Cas9 /シングルガイド（sg）RNAコンストラクトは、トマト（Solanum lycopersicum L.）植物のCCD8の2番目のエクソンを標的としました。CCD8にさまざまな挿入または削除があるいくつかの（CCD8）Cas9変異トマト系統が、特定されたオフターゲットなしで得られました。T1植物の遺伝子型分析は、導入されたCCD8突然変異が遺伝することを示しました。対照のトマト植物と比較して、（CCD8）Cas9変異体は、矮化、過剰なシュートの分岐、および不定の根の形成を含む形態学的変化を示した。さらに、SL欠損（CCD8）Cas9変異体は、変異していないトマト植物と比較して、寄生虫の侵入の有意な減少を示しました。（CCD8）Cas9変異株では、オロバンコール（SL）含有量は大幅に減少しましたが、対照植物と比較して、総カロテノイドレベルとカロテノイド生合成に関連する遺伝子の発現が増加しました。植物寄生雑草が農業に与える影響と効率的な防除方法を構成することの難しさを考慮に入れて、現在の研究は、耐性トマト根株のさまざまなコレクションと組み合わせることができる新しい効率的な方法の開発への洞察を提供します。"]
[287,30737425,"plant","tomato","CRISPR;Cas9;","Transcription Factors APETALA2a (AP2a), NON-RIPENING (NOR) and FRUITFULL (FUL1/TDR4 and FUL2/MBP7)","Scientific reports","Re-evaluation of transcription factor function in tomato fruit development and ripening with CRISPR/Cas9-mutagenesis.",2019,"9(1):1696","[Wang R  et al.]","Wageningen University, Wageningen, The Netherlands.",30737425,"10.1038/s41598-018-38170-6 ","Tomato (Solanum lycopersicum) is a model for climacteric fleshy fruit ripening studies. Tomato ripening is regulated by multiple transcription factors together  with the plant hormone ethylene and their downstream effector genes. Transcription Factors APETALA2a (AP2a), NON-RIPENING (NOR) and FRUITFULL (FUL1/TDR4 and FUL2/MBP7) were reported as master regulators controlling tomato fruit ripening. Their proposed functions were derived from studies of the phenotype of spontaneous mutants or RNAi knock-down lines rather than, as it appears now, actual null mutants. To study TF function in tomato fruit ripening in more detail, we used CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis to knock out the encoding genes, and phenotypes of these mutants are reported for the first time.  While the earlier ripening, orange-ripe phenotype of ap2a mutants was confirmed,  the nor null mutant exhibited a much milder phenotype than the spontaneous nor mutant. Additional analyses revealed that the severe phenotype in the spontaneous mutant is caused by a dominant-negative allele. Our approach also provides new insight into the independent and overlapping functions of FUL1 and FUL2. Single and combined null alleles of FUL1 and FUL2 illustrate that these two genes have partially redundant functions in fruit ripening, but also unveil an additional role for FUL2 in early fruit development.","tomato","トマト（Solanum lycopersicum）は、クライマクテリックな肉質の果実熟成研究のモデルです。トマトの熟成は、植物ホルモンであるエチレンとその下流のエフェクター遺伝子とともに、複数の転写因子によって調節されています。転写因子APETALA2a（AP2a）、NON-RIPENING（NOR）およびFRUITFULL（FUL1 / TDR4およびFUL2 / MBP7）は、トマト果実の成熟を制御するマスターレギュレーターとして報告されました。彼らが提案した機能は、現在のように実際のヌル変異体ではなく、自発的変異体またはRNAiノックダウンラインの表現型の研究から導き出されたものです。トマト果実の熟成におけるTF機能をより詳細に研究するために、CRISPR / Cas9を介した突然変異誘発を使用してコード遺伝子をノックアウトし、これらの突然変異体の表現型が初めて報告されました。ap2a変異体の早期の成熟、オレンジ熟した表現型が確認されたが、nor null変異体は、自発的nor変異体よりもはるかに穏やかな表現型を示した。追加の分析により、自発的変異体の重度の表現型はドミナントネガティブ対立遺伝子によって引き起こされることが明らかになりました。私たちのアプローチはまた、FUL1とFUL2の独立した重複する機能への新しい洞察を提供します。FUL1とFUL2の単一および結合されたヌル対立遺伝子は、これら2つの遺伝子が果実の成熟において部分的に冗長な機能を持っていることを示していますが、初期の果実の発達におけるFUL2の追加の役割も明らかにしています。"]
[288,31483929,"plant","tomato (Solanum lycopersicum and S. pimpinellifolium)","CRISPR;Cas9;","RecQ4","Plant biotechnology journal","CRISPR/Cas inactivation of RECQ4 increases homeologous crossovers in an interspecific tomato hybrid.",2019,null,"[de Maagd RA  et al.]","Wageningen University & Research, Wageningen, The Netherlands.",31483929,"10.1111/pbi.13248 ","Crossover formation during meiosis in plants is required for proper chromosome segregation and is essential for crop breeding as it allows an (optimal) combination of traits by mixing parental alleles on each chromosome. Crossover formation commences with the production of a large number of DNA double-strand breaks, of which only a few result in crossovers. A small number of genes, which  drive the resolution of DNA crossover intermediate structures towards non-crossovers, have been identified in Arabidopisis thaliana. In order to explore the potential of modification of these genes in interspecific hybrids between crops and their wild relatives towards increased production of crossovers, we have used CRISPR/Cas9-mutagenesis in an interspecific tomato hybrid to knockout RecQ4. A biallelic recq4 mutant was obtained in the F1 hybrid  of Solanum lycopersicum and S. pimpinellifolium. Compared with the wild-type F1 hybrid, the F1 recq4 mutant was shown to have a significant increase in crossovers: a 1.53-fold increase when directly observing ring bivalents in male meiocytes microscopically and a 1.8-fold extension of the genetic map when measured by analysing SNP markers in the progeny (F2) plants. This is one of the  first demonstrations of increasing crossover frequency in interspecific hybrids by manipulating genes in crossover intermediate resolution pathways and the first to do so by directed mutagenesis. SIGNIFICANCE STATEMENT: Increasing crossover frequency during meiosis can speed up or simplify crop breeding that relies on meiotic crossovers to introduce favourable alleles controlling important traits from wild relatives into crops. Here we show for the first time that knocking out an inhibitor of crossovers in an interspecific hybrid between tomato and its relative wild species using CRISPR/Cas9-mutagenesis results in increased recombination between the two genomes.","tomato","植物の減数分裂中のクロスオーバー形成は、適切な染色体分離に必要であり、各染色体上で親対立遺伝子を混合することによって特性の（最適な）組み合わせを可能にするため、作物育種に不可欠です。クロスオーバーの形成は、多数のDNA二本鎖切断の生成から始まりますが、クロスオーバーが発生するのはごくわずかです。少数の遺伝子が、DNAクロスオーバー中間構造の分解を非クロスオーバーに向けて推進し、Arabidopisisthalianaで同定されています。作物とその野生の近縁種との間の種間雑種におけるこれらの遺伝子の改変の可能性を調査するために、種間トマト雑種でCRISPR / Cas9-突然変異誘発を使用してRecQ4をノックアウトしました。SolanumlycopersicumとS.pimpinellifoliumのF1ハイブリッドで2対立遺伝子のrecq4変異体が得られました。野生型F1ハイブリッドと比較して、F1 recq4変異体は、クロスオーバーが大幅に増加することが示されました。男性の減数分裂細胞のリング二価を顕微鏡で直接観察すると1.53倍に増加し、によって測定すると遺伝子マップが1.8倍に拡大します。子孫（F2）植物のSNPマーカーの分析。これは、クロスオーバー中間解像度経路で遺伝子を操作することによって種間ハイブリッドでクロスオーバー頻度を増加させる最初のデモンストレーションの1つであり、指示された突然変異誘発によってそうする最初のデモンストレーションです。重要な声明：減数分裂中の交雑頻度の増加は、減数分裂の交雑に依存する作物育種をスピードアップまたは簡素化して、野生の親類から作物への重要な形質を制御する好ましい対立遺伝子を導入することができます。ここでは、CRISPR / Cas9-mutagenesisを使用して、トマトとその相対的な野生種との間の種間雑種におけるクロスオーバーの阻害剤をノックアウトすると、2つのゲノム間の組換えが増加することを初めて示します。"]
[289,30652405,"plant","tomato (Solanum lycopersicum)","CRISPR;Cas9;","Methyltransferase 1 (SlMET1)","Journal of integrative plant biology","Critical function of DNA methyltransferase 1 in tomato development and regulation of the DNA methylome and transcriptome.",2019,"61(12):1224-1242","[Yang Y et al.]","Shanghai Center for Plant Stress Biology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China.",30652405,"10.1111/jipb.12778 ","DNA methylation confers epigenetic regulation on gene expression and thereby on various biological processes. Tomato has emerged as an excellent system to study  the function of DNA methylation in plant development. To date, regulation and function of DNA methylation maintenance remains unclear in tomato plants. Here, we report the critical function of tomato (Solanum lycopersicum) Methyltransferase 1 (SlMET1) in plant development and DNA methylome and transcriptome regulation. Using CRISPR-Cas9 gene editing, we generated slmet1 mutants and observed severe developmental defects with a frame-shift mutation, including small and curly leaves, defective inflorescence, and parthenocarpy. In  leaf tissues, mutations in SlMET1 caused CG hypomethylation and CHH hypermethylation on a whole-genome scale, leading to a disturbed transcriptome including ectopic expression of many RIN target genes such as ACC2 in leaf tissues, which are normally expressed in fruits. Neither the CG hypomethylation nor CHH hypermethylation in the slmet1 mutants is related to tissue culture. Meanwhile, tissue culture induces non-CG hypomethylation, which occurs more frequently at gene regions than at TE regions. Our results depict SlMET1- and tissue culture-dependent tomato DNA methylomes, and that SlMET1 is required for maintaining a normal transcriptome and normal development of tomato.","tomato","DNAメチル化は、遺伝子発現、ひいてはさまざまな生物学的プロセスにエピジェネティックな調節をもたらします。トマトは、植物の発育におけるDNAメチル化の機能を研究するための優れたシステムとして登場しました。今日まで、DNAメチル化維持の調節と機能はトマト植物では不明なままです。ここでは、植物の発育とDNAメチロームとトランスクリプトームの調節におけるトマト（Solanum lycopersicum）メチルトランスフェラーゼ1（SlMET1）の重要な機能を報告します。CRISPR-Cas9遺伝子編集を使用して、slmet1変異体を生成し、フレームシフト変異を伴う重度の発達障害を観察しました。これには、小さな巻き毛の葉、花序の欠陥、分娩期が含まれます。葉組織では、SlMET1の変異により、全ゲノムスケールでCGの低メチル化とCHHの高メチル化が引き起こされ、通常は果実で発現するACC2などの多くのRIN標的遺伝子の異所性発現を含むトランスクリプトームの乱れが生じました。slmet1変異体のCG低メチル化もCHH高メチル化も組織培養とは関係ありません。一方、組織培養は非CG低メチル化を誘発し、これはTE領域よりも遺伝子領域でより頻繁に発生します。私たちの結果は、SlMET1と組織培養に依存するトマトDNAメチロームを示しており、SlMET1は正常なトランスクリプトームとトマトの正常な発達を維持するために必要です。"]
[290,31076539,"plant","tomato (Solanum lycopersicum)","CRISPR;","gibberellin-insensitive dwarf1","Plant cell","Multiple Gibberellin Receptors Contribute to Phenotypic Stability under Changing  Environments.",2019,"31(7):1506-1519","[Illouz-Eliaz N  et al.]","Hebrew University of Jerusalem, Rehovot, Israel.",31076539,"10.1105/tpc.19.00235 ","The pleiotropic and complex gibberellin (GA) response relies on targeted proteolysis of DELLA proteins mediated by a GA-activated GIBBERELLIN-INSENSITIVE  DWARF1 (GID1) receptor. The tomato (Solanum lycopersicum) genome encodes for a single DELLA protein, PROCERA (PRO), and three receptors, SlGID1a (GID1a), GID1b1, and GID1b2, that may guide specific GA responses. In this work, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) /CRISPR associated protein 9-derived gid1 mutants were generated and their effect on GA responses was studied. The gid1 triple mutant was extremely dwarf and fully insensitive to  GA. Under optimal growth conditions, the three receptors function redundantly and the single gid1 mutants exhibited very mild phenotypic changes. Among the three receptors, GID1a had the strongest effects on germination and growth. Yeast two-hybrid assays suggested that GID1a has the highest affinity to PRO. Analysis  of lines with a single active receptor demonstrated a unique role for GID1a in protracted response to GA that was saturated only at high doses. When the gid1 mutants were grown in the field under ambient changing environments, they showed  phenotypic instability, the high redundancy was lost, and gid1a exhibited dwarfism that was strongly exacerbated by the loss of another GID1b receptor gene. These results suggest that multiple GA receptors contribute to phenotypic stability under environmental extremes.","tomato","プレイオトロピックで複雑なジベレリン（GA）応答は、GA活性化GIBBERELLIN-INSENSITIVE DWARF1（GID1）受容体によって媒介されるDELLAタンパク質の標的タンパク質分解に依存しています。トマト（Solanum lycopersicum）ゲノムは、単一のDELLAタンパク質であるPROCERA（PRO）と、特定のGA応答を導く可能性のある3つの受容体であるSlGID1a（GID1a）、GID1b1、およびGID1b2をエンコードします。この作業では、クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ CRISPR関連タンパク質9由来のgid1変異体が生成され、GA応答に対するそれらの影響が研究されました。gid1トリプル変異体は非常に矮小でGAに完全に鈍感でした。最適な成長条件下では、3つの受容体は重複して機能し、単一のgid1変異体は非常に穏やかな表現型の変化を示しました。3つの受容体の中で、GID1aは発芽と成長に最も強い影響を及ぼしました。酵母ツーハイブリッドアッセイは、GID1aがPROに対して最も高い親和性を有することを示唆しました。単一の活性受容体を有する系統の分析は、高用量でのみ飽和したGAへの長期応答におけるGID1aの独特の役割を示した。gid1変異体が周囲の変化する環境下で野外で成長したとき、それらは表現型の不安定性を示し、高い冗長性が失われ、gid1aは別のGID1b受容体遺伝子の喪失によって強く悪化した矮小化を示しました。これらの結果は、複数のGA受容体が極端な環境下での表現型の安定性に寄与することを示唆しています。"]
[291,30459263,"plant","tomato (Solanum lycopersicum)","CRISPR;","pectate lyase; polygalacturonase 2a; beta-galactanase","Plant physiology","Characterization of CRISPR Mutants Targeting Genes Modulating Pectin Degradation  in Ripening Tomato.",2019,"179(2):544-557","[Wang D et al.]","University of Nottingham, Loughborough, UK.",30459263,"10.1104/pp.18.01187 ","Tomato (Solanum lycopersicum) is a globally important crop with an economic value in the tens of billions of dollars, and a significant supplier of essential vitamins, minerals, and phytochemicals in the human diet. Shelf life is a key quality trait related to alterations in cuticle properties and remodeling of the  fruit cell walls. Studies with transgenic tomato plants undertaken over the last  20 years have indicated that a range of pectin-degrading enzymes are involved in  cell wall remodeling. These studies usually involved silencing of only a single gene and it has proved difficult to compare the effects of silencing these genes  across the different experimental systems. Here we report the generation of CRISPR-based mutants in the ripening-related genes encoding the pectin-degrading  enzymes pectate lyase (PL), polygalacturonase 2a (PG2a), and beta-galactanase (TBG4). Comparison of the physiochemical properties of the fruits from a range of PL, PG2a, and TBG4 CRISPR lines demonstrated that only mutations in PL resulted in firmer fruits, although mutations in PG2a and TBG4 influenced fruit color and  weight. Pectin localization, distribution, and solubility in the pericarp cells of the CRISPR mutant fruits were investigated using the monoclonal antibody probes LM19 to deesterified homogalacturonan, INRA-RU1 to rhamnogalacturonan I, LM5 to beta-1,4-galactan, and LM6 to arabinan epitopes, respectively. The data indicate that PL, PG2a, and TBG4 act on separate cell wall domains and the importance of cellulose microfibril-associated pectin is reflected in its increased occurrence in the different mutant lines.","tomato","トマト（Solanum lycopersicum）は、数百億ドルの経済的価値を持つ世界的に重要な作物であり、人間の食事に不可欠なビタミン、ミネラル、植物化学物質の重要な供給者です。貯蔵寿命は、キューティクルの特性の変化と果実の細胞壁のリモデリングに関連する重要な品質特性です。過去20年間に行われたトランスジェニックトマト植物を用いた研究では、さまざまなペクチン分解酵素が細胞壁のリモデリングに関与していることが示されています。これらの研究は通常、単一の遺伝子のみのサイレンシングを含み、異なる実験システム間でこれらの遺伝子をサイレンシングする効果を比較することは困難であることが証明されています。ここでは、ペクチン分解酵素であるペクチン酸リアーゼ（PL）、ポリガラクツロナーゼ2a（PG2a）、およびベータガラクタナーゼ（TBG4）をコードする熟成関連遺伝子におけるCRISPRベースの変異体の生成について報告します。PL、PG2a、およびTBG4 CRISPR系統の範囲からの果実の物理化学的特性の比較は、PG2aおよびTBG4の変異が果実の色と重量に影響を与えたものの、PLの変異のみがより硬い果実をもたらすことを示しました。CRISPR変異体果実の果皮細胞におけるペクチンの局在、分布、および溶解性を、脱エステル化ホモガラクツロナンに対するモノクローナル抗体プローブLM19、ラムノガラクツロナンIに対するINRA-RU1、ベータ-1,4-ガラクタンに対するLM5、およびアラビナンエピトープに対するLM6を使用して調査した。 、それぞれ。データは、PL、PG2a、およびTBG4が別々の細胞壁ドメインに作用し、セルロースミクロフィブリル関連ペクチンの重要性が異なる変異株での発生の増加に反映されていることを示しています。"]
[292,30230636,"plant","tomato (Solanum neorickii)","Agroinfiltration;","phenylalanine ammonia-lyase and cystathionine gamma-lyase","Plant journal","A Solanum neorickii introgression population providing a powerful complement to the extensively characterized Solanum pennellii population.",2019,"97(2):391-403","[Brog YM et al.]","Hebrew University of Jerusalem, Rehovot, Israel.",30230636,"10.1111/tpj.14095 ","We present a complementary resource for trait fine-mapping in tomato to those based on the intra-specific cross between cultivated tomato and the wild tomato species Solanum pennellii, which have been extensively used for quantitative genetics in tomato over the last 20 years. The current population of backcross inbred lines (BILs) is composed of 107 lines derived after three backcrosses of progeny of the wild species Solanum neorickii (LA2133) and cultivated tomato (cultivar TA209) and is freely available to the scientific community. These S. neorickii BILs were genotyped using the 10K SolCAP single nucleotide polymorphism chip, and 3111 polymorphic markers were used to map recombination break points relative to the physical map of Solanum lycopersicum. The BILs harbor on average  4.3 introgressions per line, with a mean introgression length of 34.7 Mbp, allowing partitioning of the genome into 340 bins and thereby facilitating rapid  trait mapping. We demonstrate the power of using this resource in comparison with archival data from the S. pennellii resources by carrying out metabolic quantitative trait locus analysis following gas chromatography-mass spectrometry  on fruits harvested from the S. neorickii BILs. The metabolic candidate genes phenylalanine ammonia-lyase and cystathionine gamma-lyase were then tested and validated in F2 populations and via agroinfiltration-based overexpression in order to exemplify the fidelity of this method in identifying the genes that drive tomato metabolic phenotypes.","tomato","過去20年間、トマトの定量的遺伝学に広く使用されてきた、栽培トマトと野生のトマト種であるSolanum pennelliiとの種内交雑に基づくものに、トマトの特性を細かくマッピングするための補足リソースを提示します。現在のバッククロス近交系（BIL）の個体数は、野生種Solanum neorickii（LA2133）と栽培トマト（栽培品種TA209）の子孫の3回のバッククロス後に得られた107系統で構成され、科学界で自由に利用できます。これらのS.neorickii BILは、10K SolCAP単一ヌクレオチド多型チップを使用して遺伝子型を決定し、3111多型マーカーを使用して、Solanumlycopersicumの物理マップと比較して組換えブレークポイントをマップしました。BILは、1行あたり平均4.3の侵入を含み、平均侵入長は34.7 Mbpであり、ゲノムを340のビンに分割できるため、迅速な特性マッピングが容易になります。S. neorickii BILから収穫された果実のガスクロマトグラフィー-質量分析に続いて代謝定量的形質遺伝子座分析を実行することにより、S。pennelliiリソースからのアーカイブデータと比較してこのリソースを使用する力を示します。次に、代謝候補遺伝子であるフェニルアラニンアンモニアリアーゼとシスタチオニンガンマリアーゼをF2集団でテストし、アグロインフィルトレーションベースの過剰発現を介して検証し、トマトの代謝表現型を駆動する遺伝子を特定する際のこの方法の忠実度を実証しました。"]
[293,30328507,"plant","tomato (Solanum pimpinellifolium (0043) and S. pimpinellifolium (0049-w1))","Agroinfiltration;","green fluorescent protein (GFP)","Plant cell reports","Efficient transient protein expression in tomato cultivars and wild species using agroinfiltration-mediated high expression system.",2019,"38(1):75-84","[Hoshikawa K et al.]","University of Tsukuba, Tsukuba, Ibaraki, Japan.",30328507,"10.1007/s00299-018-2350-1 ","KEY MESSAGE: The new transient protein expression system using the pBYR2HS vector is applicable to several tomato cultivars and wild species with high level of protein expression. Innovation and improvement of effective tools for transient protein expression in plant cells is critical for the development of plant biotechnology. We have created the new transient protein expression system using  the pBYR2HS vector that led to about 4 mg/g fresh weight of protein expression in Nicotiana benthamiana. In this study, we validated the adaptability of this transient protein expression system by agroinfiltration to leaves and fruits of several tomato cultivars and wild species. Although the GFP protein was transiently expressed in the leaves and fruits of all tomato cultivars and wild species, we observed species-specific differences in protein expression. In particular, GFP protein expression was higher in the leaves and fruits of Micro-Tom, Solanum pimpinellifolium (0043) and S. pimpinellifolium (0049-w1) than in those of cultivars and wild species. Furthermore, Agrobacterium with GABA transaminase enhanced transient expression in tomato fruits of Micro-Tom. Taken together with these results, our system is applicable to several tomato cultivars and species as well as a model tomato, even though characteristics are often different among tomato cultivars or species. Thus, the system is an effective, simple, and valuable tool to achieve rapid transgene expression to examine gene function in tomato plant cells.","tomato","重要なメッセージ：pBYR2HSベクターを使用した新しい一過性タンパク質発現システムは、高レベルのタンパク質発現を示すいくつかのトマト栽培品種および野生種に適用できます。植物細胞における一過性タンパク質発現のための効果的なツールの革新と改善は、植物バイオテクノロジーの開発にとって重要です。pBYR2HSベクターを使用して新しい一過性タンパク質発現システムを作成しました。これにより、Nicotianabenthamianaで約4mg / gの新鮮なタンパク質発現が得られました。この研究では、いくつかのトマト栽培種と野生種の葉と果実へのアグロインフィルトレーションによるこの一過性タンパク質発現システムの適応性を検証しました。GFPタンパク質は、すべてのトマト栽培品種と野生種の葉と果実で一時的に発現しましたが、タンパク質発現の種特異的な違いを観察しました。特に、GFPタンパク質の発現は、Micro-Tom、Solanum pimpinellifolium（0043）、S。pimpinellifolium（0049-w1）の葉と果実の方が、栽培種や野生種よりも高かった。さらに、GABAトランスアミナーゼを含むアグロバクテリウムは、Micro-Tomのトマト果実における一過性の発現を増強しました。これらの結果と合わせて、私たちのシステムは、トマトの品種や種によって特性が異なることが多い場合でも、モデルのトマトだけでなく、いくつかのトマトの品種や種にも適用できます。したがって、このシステムは、トマト植物細胞の遺伝子機能を調べるための迅速な導入遺伝子発現を達成するための効果的でシンプルかつ価値のあるツールです。"]
[294,31702097,"plant","tomato; Arabidopsis","Cas9;"," ","Journal of integrative plant biology","Expanding the scope of CRISPR/Cas9-mediated genome editing in plants using an xCas9 and Cas9-NG hybrid.",2019,null,"[Niu Q et al.]","Center of Excellence in Molecular Plant Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China.",31702097,"10.1111/jipb.12886 ","The widely used Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) requires NGG as a protospacer adjacent motif (PAM) for genome editing. Although SpCas9 is a powerful genome-editing tool, its use has been limited on the targetable genomic  locus lacking NGG PAM. The SpCas9 variants xCas9 and Cas9-NG have been developed  to recognize NG, GAA, and GAT PAMs in human cells. Here, we show that xCas9 cannot recognize NG PAMs in tomato, and Cas9-NG can recognize some of our tested  NG PAMs in the tomato and Arabidopsis genomes. In addition, we engineered SpCas9  (XNG-Cas9) based on mutations from both xCas9 and Cas9-NG, and found that XNG-Cas9 can efficiently mutagenize endogenous target sites with NG, GAG, GAA, and GAT PAMs in the tomato or Arabidopsis genomes. The PAM compatibility of XNG-Cas9 is the broadest reported to date among Cas9s (SpCas9 and Cas9-NG) active in plant.","tomato; Arabidopsis","広く使用されているStreptococcuspyogenes Cas9（SpCas9）は、ゲノム編集用のプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）としてNGGを必要とします。SpCas9は強力なゲノム編集ツールですが、その使用はNGGPAMを欠くターゲット可能なゲノム遺伝子座に限定されています。SpCas9バリアントxCas9およびCas9-NGは、ヒト細胞のNG、GAA、およびGATPAMを認識するために開発されました。ここでは、xCas9がトマトのNG PAMを認識できず、Cas9-NGがトマトとアラビドプシスのゲノムでテスト済みのNGPAMの一部を認識できることを示します。さらに、xCas9とCas9-NGの両方からの変異に基づいてSpCas9（XNG-Cas9）を設計し、XNG-Cas9がトマトまたはアラビドプシスゲノムのNG、GAG、GAA、およびGATPAMで内因性標的部位を効率的に変異誘発できることを発見しました。 。XNG-Cas9のPAM互換性は、プラントでアクティブなCas9（SpCas9およびCas9-NG）の中でこれまでに報告された中で最も広いものです。"]
[295,31873217,"plant","tomato; groundcherry","CRISPR;Cas9;","SlER (targeted); SP5G; SP (new traits)","Nature biotechnology","Rapid customization of Solanaceae fruit crops for urban agriculture.",2019,null,"[Kwon CT  et al.]","Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA.",31873217,"10.1038/s41587-019-0361-2 ","Cultivation of crops in urban environments might reduce the environmental impact  of food production(1-4). However, lack of available land in cities and a need for rapid crop cycling, to yield quickly and continuously, mean that so far only lettuce and related 'leafy green' vegetables are cultivated in urban farms(5). New fruit varieties with architectures and yields suitable for urban farming have proven difficult to breed(1,5). We identified a regulator of tomato stem length (SlER) and devised a trait-stacking strategy to combine mutations for condensed shoots, rapid flowering (SP5G) and precocious growth termination (SP). Application of our strategy using one-step CRISPR-Cas9 genome editing restructured vine-like tomato plants into compact, early yielding plants suitable for urban agriculture. Field data confirmed that yields were maintained, and we demonstrated cultivation in indoor farming systems. Targeting the same stem length regulator alone in groundcherry, another Solanaceae plant, also enabled engineering to a compact stature. Our approach can expand the repertoire of crops for urban agriculture.","tomato; groundcherry","都市環境での作物の栽培は、食品生産の環境への影響を減らすかもしれません（1-4）。しかし、都市に利用可能な土地がなく、迅速かつ継続的に収穫するための迅速な作物循環の必要性は、これまでのところ、レタスと関連する「葉の多い緑」の野菜のみが都市の農場で栽培されていることを意味します（5）。都市農業に適した構造と収量を備えた新しい果物の品種は、繁殖が難しいことが証明されています（1,5）。トマトの茎の長さ（SlER）の調節因子を特定し、凝縮したシュート、急速な開花（SP5G）、早熟な成長の終了（SP）の変異を組み合わせる特性スタッキング戦略を考案しました。ワンステップのCRISPR-Cas9ゲノム編集を使用した戦略の適用により、再構築されたつるのようなトマト植物が、都市農業に適したコンパクトで早期に収穫できる植物になりました。圃場データにより、収量が維持されていることが確認され、屋内農業システムでの栽培が実証されました。別のソラナ科植物であるグラウンドチェリーで同じ茎長レギュレーターのみをターゲットにすることで、コンパクトな身長へのエンジニアリングも可能になりました。私たちのアプローチは、都市農業のための作物のレパートリーを拡大することができます。"]
[296,30669298,"plant","tomato; potato","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","acetolactate synthase (ALS)","International journal of molecular sciences","Transgene-Free Genome Editing in Tomato and Potato Plants Using Agrobacterium-Mediated Delivery of a CRISPR/Cas9 Cytidine Base Editor.",2019,"20(2)","[Veillet F  et al.]","INRA, Universite Rennes 1, Ploudaniel, France.",30669298,"10.3390/ijms20020402 ","Genome editing tools have rapidly been adopted by plant scientists for gene function discovery and crop improvement. The current technical challenge is to efficiently induce precise and predictable targeted point mutations valuable for  crop breeding purposes. Cytidine base editors (CBEs) are CRISPR/Cas9 derived tools recently developed to direct a C-to-T base conversion. Stable genomic integration of CRISPR/Cas9 components through Agrobacterium-mediated transformation is the most widely used approach in dicotyledonous plants. However, elimination of foreign DNA may be difficult to achieve, especially in vegetatively propagated plants. In this study, we targeted the acetolactate synthase (ALS) gene in tomato and potato by a CBE using Agrobacterium-mediated transformation. We successfully and efficiently edited the targeted cytidine bases, leading to chlorsulfuron-resistant plants with precise base edition efficiency up to 71% in tomato. More importantly, we produced 12.9% and 10% edited but transgene-free plants in the first generation in tomato and potato, respectively. Such an approach is expected to decrease deleterious effects due to the random integration of transgene(s) into the host genome. Our successful approach opens up new perspectives for genome engineering by the co-edition of the ALS with other gene(s), leading to transgene-free plants harboring new traits of interest.","tomato;potato","ゲノム編集ツールは、遺伝子機能の発見と作物の改善のために植物科学者によって急速に採用されています。現在の技術的課題は、作物育種の目的に役立つ正確で予測可能な標的点突然変異を効率的に誘発することです。Cytidineベースエディタ（CBE）は、CからTへのベース変換を指示するために最近開発されたCRISPR / Cas9派生ツールです。アグロバクテリウムを介した形質転換によるCRISPR / Cas9成分の安定したゲノム統合は、双子葉植物で最も広く使用されているアプローチです。ただし、特に栄養繁殖植物では、外来DNAの除去を達成するのは難しい場合があります。この研究では、アグロバクテリウムを介した形質転換を用いたCBEにより、トマトとジャガイモのアセトラクテートシンターゼ（ALS）遺伝子を標的としました。対象となるシチジンベースを効率的に編集し、トマトで最大71％の正確なベースエディション効率を備えたクロルスルフロン耐性植物を生み出しました。さらに重要なことに、私たちは、トマトとジャガイモで、それぞれ12.9％と10％の編集済みで、トランスジーンを含まない第1世代の植物を生産しました。そのようなアプローチは、宿主ゲノムへの導入遺伝子のランダムな統合による有害な影響を減少させることが期待されます。私たちの成功したアプローチは、ALSを他の遺伝子と共編集することにより、ゲノムエンジニアリングの新しい展望を開き、新しい関心のある特性を備えたトランスジーンフリーの植物をもたらします。"]
[297,31684940,"plant","wheat","CRISPR;Cas9;","5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase","BMC biotechnology","gRNA validation for wheat genome editing with the CRISPR-Cas9 system.",2019,"19(1):71","[Arndell T  et al.]","CSIRO, Agriculture and Food, Canberra, ACT, Australia.",31684940,"10.1186/s12896-019-0565-z ","BACKGROUND: The CRISPR-Cas9 system is a powerful and versatile tool for crop genome editing. However, achieving highly efficient and specific editing in polyploid species can be a challenge. The efficiency and specificity of the CRISPR-Cas9 system depends critically on the gRNA used. Here, we assessed the activities and specificities of seven gRNAs targeting 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) in hexaploid wheat protoplasts. EPSPS is the biological target of the widely used herbicide glyphosate. RESULTS: The seven gRNAs differed substantially in their on-target activities, with mean indel frequencies ranging from 0% to approximately 20%. There was no obvious correlation between experimentally determined and in silico  predicted on-target gRNA activity. The presence of a single mismatch within the seed region of the guide sequence greatly reduced but did not abolish gRNA activity, whereas the presence of an additional mismatch, or the absence of a PAM, all but abolished gRNA activity. Large insertions (>/=20 bp) of DNA vector-derived sequence were detected at frequencies up to 8.5% of total indels.  One of the gRNAs exhibited several properties that make it potentially suitable for the development of non-transgenic glyphosate resistant wheat. CONCLUSIONS: We have established a rapid and reliable method for gRNA validation in hexaploid wheat protoplasts. The method can be used to identify gRNAs that have favourable  properties. Our approach is particularly suited to polyploid species, but should  be applicable to any plant species amenable to protoplast transformation.","wheat","背景：CRISPR-Cas9システムは、作物ゲノム編集のための強力で用途の広いツールです。ただし、倍数体種で非常に効率的で具体的な編集を実現することは困難な場合があります。CRISPR-Cas9システムの効率と特異性は、使用するgRNAに大きく依存します。ここでは、六倍体小麦プロトプラストの5-エノールピルビルシキメート-3-リン酸シンターゼ（EPSPS）を標的とする7つのgRNAの活性と特異性を評価しました。EPSPSは、広く使用されている除草剤グリフォセートの生物学的標的です。結果：7つのgRNAは、ターゲット上の活動が大幅に異なり、平均インデル頻度は0％から約20％の範囲でした。実験的に決定されたものとインシリコで予測されたオンターゲットgRNA活性との間に明らかな相関関係はありませんでした。ガイド配列のシード領域内の単一のミスマッチの存在は大幅に減少しましたが、gRNA活性を無効にしませんでしたが、追加のミスマッチの存在またはPAMの不在は、gRNA活性をほとんど無効にしました。DNAベクター由来配列の大きな挿入（> / = 20 bp）が、総インデルの最大8.5％の頻度で検出されました。gRNAの1つは、非トランスジェニックグリホサート耐性コムギの開発に潜在的に適したいくつかの特性を示しました。結論：六倍体小麦プロトプラストにおけるgRNA検証のための迅速で信頼性の高い方法を確立しました。この方法は、好ましい特性を持つgRNAを特定するために使用できます。私たちのアプローチは特に倍数体種に適していますが、プロトプラスト変換に適したすべての植物種に適用できるはずです。"]
[298,31370789,"plant","wheat","CRISPR;Cas9;","alpha- and gamma-gliadin","BMC plant biology","Outlook for coeliac disease patients: towards bread wheat with hypoimmunogenic gluten by gene editing of alpha- and gamma-gliadin gene families.",2019,"19(1):333","[Jouanin A et al.]","Wageningen University and Research, Wageningen, The Netherlands.",31370789,"10.1186/s12870-019-1889-5 ","BACKGROUND: Wheat grains contain gluten proteins, which harbour immunogenic epitopes that trigger Coeliac disease in 1-2% of the human population. Wheat varieties or accessions containing only safe gluten have not been identified and  conventional breeding alone struggles to achieve such a goal, as the epitopes occur in gluten proteins encoded by five multigene families, these genes are partly located in tandem arrays, and bread wheat is allohexaploid. Gluten immunogenicity can be reduced by modification or deletion of epitopes. Mutagenesis technologies, including CRISPR/Cas9, provide a route to obtain bread  wheat containing gluten proteins with fewer immunogenic epitopes. RESULTS: In this study, we analysed the genetic diversity of over 600 alpha- and gamma-gliadin gene sequences to design six sgRNA sequences on relatively conserved domains that we identified near coeliac disease epitopes. They were combined in four CRISPR/Cas9 constructs to target the alpha- or gamma-gliadins, or both simultaneously, in the hexaploid bread wheat cultivar Fielder. We compared the results with those obtained with random mutagenesis in cultivar Paragon by gamma-irradiation. For this, Acid-PAGE was used to identify T1 grains  with altered gliadin protein profiles compared to the wild-type endosperm. We first optimised the interpretation of Acid-PAGE gels using Chinese Spring deletion lines. We then analysed the changes generated in 360 Paragon gamma-irradiated lines and in 117 Fielder CRISPR/Cas9 lines. Similar gliadin profile alterations, with missing protein bands, could be observed in grains produced by both methods. CONCLUSIONS: The results demonstrate the feasibility and efficacy of using CRISPR/Cas9 to simultaneously edit multiple genes in the large alpha- and gamma-gliadin gene families in polyploid bread wheat. Additional methods, generating genomics and proteomics data, will be necessary to determine  the exact nature of the mutations generated with both methods.","wheat","背景：小麦粒にはグルテンタンパク質が含まれており、これは人口の1〜2％でセリアック病を引き起こす免疫原性エピトープを含んでいます。安全なグルテンのみを含む小麦の品種または系統は特定されておらず、エピトープは5つの複数遺伝子ファミリーによってコードされるグルテンタンパク質に存在し、これらの遺伝子は部分的にタンデムアレイに位置し、パンコムギは同種六倍体であるため、従来の育種だけではそのような目標を達成するのに苦労しています。グルテンの免疫原性は、エピトープの修飾または削除によって低下させることができます。CRISPR / Cas9を含む突然変異誘発技術は、免疫原性エピトープが少ないグルテンタンパク質を含むパン小麦を入手するためのルートを提供します。結果：この研究では、600を超えるアルファおよびガンマグリアジン遺伝子配列の遺伝的多様性を分析して、腹腔疾患エピトープの近くで特定した比較的保存されたドメイン上の6つのsgRNA配列を設計しました。それらを4つのCRISPR / Cas9コンストラクトに組み合わせて、六倍体パン小麦栽培者Fielderでアルファグリアジンまたはガンマグリアジン、あるいはその両方を同時にターゲットにしました。結果を、ガンマ線照射による栽培者Paragonのランダム突然変異誘発で得られた結果と比較しました。このために、Acid-PAGEを使用して、野生型胚乳と比較してグリアジンタンパク質プロファイルが変化したT1粒子を特定しました。最初に、ChineseSpring削除ラインを使用してAcid-PAGEゲルの解釈を最適化しました。次に、360Paragonガンマ線照射ラインと117Fielder CRISPR / Cas9ラインで生成された変化を分析しました。タンパク質バンドが欠落している同様のグリアジンプロファイルの変化は、両方の方法で生成された粒子で観察できました。結論：結果は、CRISPR / Cas9を使用して、倍数体パン小麦の大きなアルファグリアジンおよびガンマグリアジン遺伝子ファミリーの複数の遺伝子を同時に編集することの実現可能性と有効性を示しています。ゲノミクスとプロテオミクスのデータを生成する追加の方法は、両方の方法で生成された突然変異の正確な性質を決定するために必要になります。"]
[299,31480315,"plant","wheat","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;"," ","International journal of molecular sciences","Highly Efficient and Heritable Targeted Mutagenesis in Wheat via the Agrobacterium tumefaciens-Mediated CRISPR/Cas9 System.",2019,"20(17)","[Zhang S et al.]","Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan, Shandong, China.",31480315,"10.3390/ijms20174257 ","The CRISPR/Cas9 system has been successfully used in hexaploid wheat. Although it has been reported that the induced mutations can be passed to the next generation, gene editing and transmission patterns in later generations still need to be studied. In this study, we demonstrated that the CRISPR/Cas9 system could achieve efficient mutagenesis in five wheat genes via Agrobacterium-mediated transformation of an sgRNA targeting the D genome, an sgRNA targeting both the A and B homologues and three tri-genome guides targeting the editing of all three homologues. High mutation rates and putative homozygous  or biallelic mutations were observed in the T0 plants. The targeted mutations could be stably inherited by the next generation, and the editing efficiency of each mutant line increased significantly across generations. The editing types and inheritance of targeted mutagenesis were similar, which were not related to the targeted subgenome number. The presence of Cas9/sgRNA could cause new mutations in subsequent generations, while mutated lines without Cas9/sgRNA could retain the mutation type. Additionally, off-target mutations were not found in sequences that were highly homologous to the selected sgRNA sequences. Overall, the results suggested that CRISPR/Cas9-induced gene editing via Agrobacterium-mediated transformation plays important roles in wheat genome engineering.","wheat","CRISPR / Cas9システムは6倍体コムギでうまく使用されています。誘発された突然変異は次世代に受け継がれる可能性があると報告されていますが、後の世代における遺伝子編集と伝播パターンはまだ研究する必要があります。この研究では、CRISPR / Cas9システムが、DゲノムをターゲットとするsgRNA、AホモログとBホモログの両方をターゲットとするsgRNA、および3つのトリゲノムガイドをターゲットとするアグロバクテリウムを介した変換を介して、5つの小麦遺伝子で効率的な突然変異誘発を達成できることを示しました。 3つすべての同族体の編集。T0植物では、高い突然変異率と推定上のホモ接合または二対立遺伝子突然変異が観察された。対象となる変異は次世代に安定して受け継がれ、各変異系統の編集効率は世代を超えて大幅に向上しました。編集の種類と標的突然変異誘発の遺伝は類似しており、標的サブゲノム番号とは関係がありませんでした。Cas9 / sgRNAの存在は、次の世代で新しい突然変異を引き起こす可能性がありますが、Cas9 / sgRNAのない突然変異系統は突然変異タイプを保持する可能性があります。さらに、選択したsgRNA配列と高度に相同な配列では、オフターゲット変異は見つかりませんでした。全体として、結果は、アグロバクテリウムを介した形質転換を介したCRISPR / Cas9誘導遺伝子編集が小麦ゲノム工学において重要な役割を果たすことを示唆しました。"]
[300,31760434,"plant","wheat","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;Cpf1;","OsU6a, TaU3 and TaU6 (promoters); TaWaxy and TaMTL (target)","Journal of experimental botany","Editing TaMTL gene induces haploid plants efficiently by optimized Agrobacterium-mediated CRISPR system in wheat.",2019,null,"[Liu H et al.]","Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, China.",31760434,"10.1093/jxb/erz529 ","CRISPR/LbCpf1 and CRISPR/xCas9 systems in wheat have not yet been reported. In this study we compared the efficiencies of three CRISPR editing systems (SpCas9,  LbCpf1 and xCas9), and three different promoters (OsU6a, TaU3 and TaU6) driving sgRNA which were introduced into wheat via Agrobacterium-mediated transformation. Results indicated that TaU3 is a better choice than OsU6a or TaU6; the editing efficiency was higher using two sgRNAs than one sgRNA, and the mutants with a large fragment deletion between the two sgRNAs were produced. The LbCpf1 and xCas9 systems were successfully used in wheat. Two endogenous wheat genes, TaWaxy and TaMTL, were edited by the optimized SpCas9 system with high efficiency; the highest efficiency of 80.5% was achieved when using TaU3 and two sgRNAs to target TaWaxy. Seed-set rates of the TaMTL-edited T0 transgenic plants were much lower than that of the wild-type. A haploid induction rate of 18.9% was determined in the TaMTL-edited T1 plants using CRISPR/SpCas9 system. The mutants with reverse insertion of the deleted sequence of the TaMTL and TaWaxy between the two sgRNAs  were identified in the edited T1 plants. Additionally, the wheat grains lacking embryo or endosperm were observed in the TaMTL-edited T1 generation.","wheat","小麦のCRISPR / LbCpf1およびCRISPR / xCas9システムはまだ報告されていません。この研究では、3つのCRISPR編集システム（SpCas9、LbCpf1、xCas9）と、アグロバクテリウムを介した形質転換によって小麦に導入されたsgRNAを駆動する3つの異なるプロモーター（OsU6a、TaU3、TaU6）の効率を比較しました。結果は、TaU3がOsU6aまたはTaU6よりも優れた選択であることを示しました。編集効率は、1つのsgRNAよりも2つのsgRNAを使用した方が高く、2つのsgRNA間に大きなフラグメントが削除された変異体が生成されました。LbCpf1およびxCas9システムは小麦でうまく使用されました。2つの内因性小麦遺伝子であるTaWaxyとTaMTLは、最適化されたSpCas9システムによって高効率で編集されました。TaU3と2つのsgRNAを使用してTaWaxyをターゲットにすると、80.5％という最高の効率が達成されました。TaMTLで編集されたT0トランスジェニック植物のシードセット率は、野生型のそれよりもはるかに低かった。18.9％の半数体誘導率は、CRISPR / SpCas9システムを使用してTaMTLで編集されたT1植物で決定されました。2つのsgRNAの間にTaMTLとTaWaxyの削除された配列が逆挿入された変異体が、編集されたT1植物で同定されました。さらに、胚または内胚葉を欠く小麦粒が、TaMTLで編集されたT1世代で観察されました。"]
[301,30833776,"plant","wheat","CRISPR;Cas9;"," ","Nature biotechnology","One-step genome editing of elite crop germplasm during haploid induction.",2019,"37(3):287-292","[Kelliher T  et al.]","Syngenta Crop Protection, Research Triangle Park, NC, USA.",30833776,"10.1038/s41587-019-0038-x ","Genome editing using CRISPR-Cas9 works efficiently in plant cells(1), but delivery of genome-editing machinery into the vast majority of crop varieties is  not possible using established methods(2). We co-opted the aberrant reproductive  process of haploid induction (HI)(3-6) to induce edits in nascent seeds of diverse monocot and dicot species. Our method, named HI-Edit, enables direct genomic modification of commercial crop varieties. HI-Edit was tested in field and sweet corn using a native haploid-inducer line(4) and extended to dicots using an engineered CENH3 HI system(7). We also recovered edited wheat embryos using Cas9 delivered by maize pollen. Our data indicate that a transient hybrid state precedes uniparental chromosome elimination in maize HI. Edited haploid plants lack both the haploid-inducer parental DNA and the editing machinery. Therefore, edited plants could be used in trait testing and directly integrated into commercial variety development.","wheat","CRISPR-Cas9を使用したゲノム編集は植物細胞で効率的に機能しますが（1）、確立された方法を使用して大多数の作物品種にゲノム編集機構を提供することはできません（2）。半数体誘導（HI）（3-6）の異常な生殖過程を採用して、多様なモノコットおよびジコット種の新生種子の編集を誘導しました。HI-Editという名前の私たちの方法は、市販の作物品種の直接的なゲノム修飾を可能にします。HI-Editは、ネイティブの半数体誘導ライン（4）を使用してフィールドおよびスイートコーンでテストされ、設計されたCENH3 HIシステム（7）を使用してディコットに拡張されました。また、トウモロコシの花粉によって供給されたCas9を使用して、編集された小麦の胚を回収しました。私たちのデータは、一過性のハイブリッド状態がトウモロコシHIの片親染色体除去に先行することを示しています。編集された半数体植物は、半数体誘導物質の親DNAと編集機構の両方を欠いています。したがって、編集された植物は特性試験に使用され、商業品種開発に直接統合される可能性があります。"]
[302,31729822,"plant","wheat","ZFN;","IPK1","Plant biotechnology journal","Genome editing in wheat microspores and haploid embryos mediated by delivery of ZFN proteins and cell-penetrating peptide complexes.",2019,null,"[Bilichak A  et al.]","Lethbridge Research and Development Center, Agriculture and Agri-Food Canada, Lethbridge, AB, Canada.",31729822,"10.1111/pbi.13296 ","Recent advances in genome engineering technologies based on designed endonucleases (DE) allow specific and predictable alterations in plant genomes to generate value-added traits in crops of choice. The EXZACT Precision technology,  based on zinc finger nucleases (ZFN), has been successfully used in the past for  introduction of precise mutations and transgenes to generate novel and desired phenotypes in several crop species. Current methods for delivering ZFNs into plant cells are based on traditional genetic transformation methods that result in stable integration of the nuclease in the genome. Here, we describe for the first time, an alternative ZFN delivery method where plant cells are transfected  with ZFN protein that eliminates the need for stable nuclease genomic integration and allows generation of edited, but not transgenic cells or tissues. For this study, we designed ZFNs targeting the wheat IPK1 locus, purified active ZFN protein from bacterial cultures, complexed with cell-penetrating peptides (CPP) and directly transfected the complex into either wheat microspores or embryos. NGS analysis of ZFN-treated material showed targeted edits at the IPK1 locus in independent experiments. This is the first description of plant microspore genome editing by a ZFN when delivered as a protein complexed with CPP.","wheat","設計されたエンドヌクレアーゼ（DE）に基づくゲノム工学技術の最近の進歩により、植物ゲノムの特定の予測可能な変化が、選択した作物に付加価値のある特性を生み出すことができます。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）に基づくEXZACT Precisionテクノロジーは、過去に、いくつかの作物種で新規で望ましい表現型を生成するための正確な突然変異と導入遺伝子の導入に成功裏に使用されてきました。ZFNを植物細胞に送達するための現在の方法は、ゲノムへのヌクレアーゼの安定した統合をもたらす従来の遺伝子形質転換法に基づいています。ここでは、安定したヌクレアーゼゲノム統合の必要性を排除し、編集されたがトランスジェニック細胞または組織の生成を可能にしない、植物細胞にZFNタンパク質をトランスフェクトする代替のZFN送達方法を初めて説明します。この研究では、小麦のIPK1遺伝子座を標的とするZFNを設計し、細菌培養物から活性ZFNタンパク質を精製し、細胞浸透ペプチド（CPP）と複合体を形成し、複合体を小麦の小胞子または胚に直接トランスフェクトしました。ZFN処理された材料のNGS分析は、独立した実験でIPK1遺伝子座でターゲットを絞った編集を示しました。これは、CPPと複合体を形成したタンパク質として送達された場合のZFNによる植物小胞子ゲノム編集の最初の説明です。"]
[303,30839150,"plant","wheat","CRISPR;Cas9;","wheat male fertility gene Ms1","Plant biotechnology journal","CRISPR/Cas9-mediated knockout of Ms1 enables the rapid generation of male-sterile hexaploid wheat lines for use in hybrid seed production.",2019,"17(10):1905-1913","[Okada A et al.]","University of Adelaide, Urrbrae, South Australia, Australia.",30839150,"10.1111/pbi.13106 ","The development and adoption of hybrid seed technology have led to dramatic increases in agricultural productivity. However, it has been a challenge to develop a commercially viable platform for the production of hybrid wheat (Triticum aestivum) seed due to wheat's strong inbreeding habit. Recently, a novel platform for commercial hybrid seed production was described. This hybridization platform utilizes nuclear male sterility to force outcrossing and has been applied to maize and rice. With the recent molecular identification of the wheat male fertility gene Ms1, it is now possible to extend the use of this novel hybridization platform to wheat. In this report, we used the CRISPR/Cas9 system to generate heritable, targeted mutations in Ms1. The introduction of biallelic frameshift mutations into Ms1 resulted in complete male sterility in wheat cultivars Fielder and Gladius, and several of the selected male-sterile lines were potentially non-transgenic. Our study demonstrates the utility of the  CRISPR/Cas9 system for the rapid generation of male sterility in commercial wheat cultivars. This represents an important step towards capturing heterosis to improve wheat yields, through the production and use of hybrid seed on an industrial scale.","wheat","ハイブリッド種子技術の開発と採用により、農業生産性が劇的に向上しました。しかし、小麦の強い同系交配習慣のために、ハイブリッド小麦（Triticum aestivum）種子を生産するための商業的に実行可能なプラットフォームを開発することは挑戦でした。最近、商業的なハイブリッド種子生産のための新しいプラットフォームが説明されました。このハイブリダイゼーションプラットフォームは、核の雄性不稔性を利用して交差を強制し、トウモロコシと米に適用されています。コムギの雄性生殖遺伝子Ms1の最近の分子同定により、この新しいハイブリダイゼーションプラットフォームの使用をコムギに拡張することが可能になりました。このレポートでは、CRISPR / Cas9システムを使用して、Ms1に遺伝性の標的変異を生成しました。Ms1への2対立遺伝子フレームシフト変異の導入は、小麦栽培者FielderとGladiusで完全な雄性不稔をもたらし、選択された雄性不稔系統のいくつかは潜在的に非トランスジェニックでした。私たちの研究は、市販の小麦栽培品種における雄性不稔の迅速な生成のためのCRISPR / Cas9システムの有用性を示しています。これは、産業規模でのハイブリッドシードの生産と使用を通じて、小麦の収量を改善するためにヘテロシスを捕捉するための重要なステップを表しています。"]
[304,30706614,"plant","wheat","agroinfiltration;CRISPR;Cas9;","TaCKX2-1; TaGLW7; TaGW2; TaGW8","Plant biotechnology journal","Development of an Agrobacterium-delivered CRISPR/Cas9 system for wheat genome editing.",2019,"17(8):1623-1635","[Zhang Z et al.]","University of Missouri, Columbia, MO, USA.",30706614,"10.1111/pbi.13088 ","CRISPR/Cas9 has been widely used for genome editing in many organisms, including  important crops like wheat. Despite the tractability in designing CRISPR/Cas9, efficacy in the application of this powerful genome editing tool also depends on  DNA delivery methods. In wheat, the biolistics based transformation is the most used method for delivery of the CRISPR/Cas9 complex. Due to the high frequency of gene silencing associated with co-transferred plasmid backbone and low edit rate  in wheat, a large T0 transgenic plant population are required for recovery of desired mutations, which poses a bottleneck for many genome editing projects. Here, we report an Agrobacterium-delivered CRISPR/Cas9 system in wheat, which includes a wheat codon optimized Cas9 driven by a maize ubiquitin gene promoter and a guide RNA cassette driven by wheat U6 promoters in a single binary vector.  Using this CRISPR/Cas9 system, we have developed 68 edit mutants for four grain-regulatory genes, TaCKX2-1, TaGLW7, TaGW2, and TaGW8, in T0 , T1 , and T2 generation plants at an average edit rate of 10% without detecting off-target mutations in the most Cas9-active plants. Homozygous mutations can be recovered from a large population in a single generation. Different from most plant species, deletions over 10 bp are the dominant mutation types in wheat. Plants homozygous of 1160-bp deletion in TaCKX2-D1 significantly increased grain number  per spikelet. In conclusion, our Agrobacterium-delivered CRISPR/Cas9 system provides an alternative option for wheat genome editing, which requires a small number of transformation events because CRISPR/Cas9 remains active for novel mutations through generations.","wheat","CRISPR / Cas9は、小麦などの重要な作物を含む多くの生物のゲノム編集に広く使用されています。CRISPR / Cas9の設計における扱いやすさにもかかわらず、この強力なゲノム編集ツールのアプリケーションにおける有効性は、DNA配信方法にも依存します。小麦では、バイオリスティックベースの変換がCRISPR / Cas9複合体の送達に最も使用される方法です。同時転送されたプラスミドバックボーンに関連する遺伝子サイレンシングの頻度が高く、小麦の編集率が低いため、目的の変異の回復には大量のT0トランスジェニック植物集団が必要であり、多くのゲノム編集プロジェクトのボトルネックになります。ここでは、小麦のアグロバクテリウムが提供するCRISPR / Cas9システムを報告します。これには、トウモロコシのユビキチン遺伝子プロモーターによって駆動される小麦コドン最適化Cas9と、小麦U6プロモーターによって駆動されるガイドRNAカセットが単一のバイナリーベクターに含まれます。このCRISPR / Cas9システムを使用して、T0、T1、およびT2生成プラントで、検出せずに平均編集率10％で、4つの粒子調節遺伝子TaCKX2-1、TaGLW7、TaGW2、およびTaGW8の68の編集変異体を開発しました。ほとんどのCas9活性植物におけるオフターゲット変異。ホモ接合変異は、単一世代の大集団から回復することができます。ほとんどの植物種とは異なり、10bpを超える欠失が小麦の主要な変異型です。TaCKX2-D1で1160bpの欠失がホモ接合である植物は、スパイクレットあたりの粒子数を大幅に増加させました。結論として、Agrobacteriumが提供するCRISPR / Cas9システムは、小麦ゲノム編集の代替オプションを提供します。これは、CRISPR / Cas9が世代を超えて新しい突然変異に対してアクティブなままであるため、少数の変換イベントを必要とします。"]
[305,31219637,"plant","wheat","CRISPR;Cas9;","TONNEAU1-recruiting motif (TRM) protein gene homolog (TaGW7)","Plant journal","Gene editing of the wheat homologs of TONNEAU1-recruiting motif encoding gene affects grain shape and weight in wheat.",2019,"100(2):251-264","[Wang W  et al.]","Kansas State University, Manhattan, KS, USA.",31219637,"10.1111/tpj.14440 ","Grain size and weight are important components of a suite of yield-related traits in crops. Here, we showed that the CRISPR-Cas9 gene editing of TaGW7, a homolog of rice OsGW7 encoding a TONNEAU1-recruiting motif (TRM) protein, affects grain shape and weight in allohexaploid wheat. By editing the TaGW7 homoeologs in the B and D genomes, we showed that mutations in either of the two or both genomes increased the grain width and weight but reduced the grain length. The effect sizes of mutations in the TaGW7 gene homoeologs coincided with the relative levels of their expression in the B and D genomes. The effects of gene editing on grain morphology and weight traits were dosage dependent with the double-copy mutant showing larger effect than the respective single copy mutants. The TaGW7-centered gene co-expression network indicated that this gene is involved in the pathways regulating cell division and organ growth, also confirmed by the cellular co-localization of TaGW7 with alpha- and beta-tubulin proteins, the building blocks of microtubule arrays. The analyses of exome capture data in tetraploid domesticated and wild emmer, and hexaploid wheat revealed the loss of  diversity around TaGW7-associated with domestication selection, suggesting that TaGW7 is likely to play an important role in the evolution of yield component traits in wheat. Our study showed how integrating CRISPR-Cas9 system with cross-species comparison can help to uncover the function of a gene fixed in wheat for allelic variants targeted by domestication selection and select targets for engineering new gene variants for crop improvement.","wheat","穀物のサイズと重量は、作物の収量に関連する一連の形質の重要な要素です。ここでは、TONNEAU1リクルートモチーフ（TRM）タンパク質をコードする米OsGW7のホモログであるTaGW7のCRISPR-Cas9遺伝子編集が、同種六倍体小麦の粒形と重量に影響を与えることを示しました。BおよびDゲノムのTaGW7ホモエログを編集することにより、2つまたは両方のゲノムのいずれかでの変異により、粒子の幅と重量が増加するが、粒子の長さが減少することを示しました。TaGW7遺伝子ホモエログの変異の効果サイズは、BおよびDゲノムでのそれらの発現の相対レベルと一致しました。穀物の形態と重量特性に対する遺伝子編集の効果は投与量に依存し、ダブルコピー変異体はそれぞれのシングルコピー変異体よりも大きな効果を示しました。TaGW7中心の遺伝子共発現ネットワークは、この遺伝子が細胞分裂と臓器成長を調節する経路に関与していることを示し、微小管アレイの構成要素であるアルファチューブリンおよびベータチューブリンタンパク質とのTaGW7の細胞共局在によっても確認されました。 。四倍体の飼いならされた野生のエマー、および六倍体の小麦のエクソーム捕獲データの分析は、飼いならされた選択に関連するTaGW7の周りの多様性の喪失を明らかにし、TaGW7が小麦の収量構成要素特性の進化において重要な役割を果たす可能性が高いことを示唆している。私たちの研究は、CRISPR-Cas9システムを種間比較と統合することで、家畜化選択の対象となる対立遺伝子変異体の小麦に固定された遺伝子の機能を明らかにし、作物改良のための新しい遺伝子変異体を設計するための標的を選択するのにどのように役立つかを示しました。"]
[306,31673276,"plant","wheat","CRISPR;Cas9;","TaABCC6; TaNFXL1; TansLTP9.4","Plant methods","An optimised CRISPR/Cas9 protocol to create targeted mutations in homoeologous genes and an efficient genotyping protocol to identify edited events in wheat.",2019,"15:119","[Cui X et al.]","Ottawa Research and Development Centre, Ottawa, ON, Canada.",31673276,"10.1186/s13007-019-0500-2 ","Background: Targeted genome editing using the Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 system has been applied in a large number of plant species. Using a gene-specific single guide RNA (sgRNA) and the CRISPR/Cas9 system, small editing events such as deletions of few bases can be obtained. However larger deletions are required for some applications. In addition, identification and characterization of edited events can be challenging in plants with complex genomes, such as wheat. Results: In this study, we used the CRISPR/Cas9 system and developed a protocol that yielded high number of large deletions employing a pair of co-expressed sgRNA to target the same gene. The protocol was validated by targeting three genes, TaABCC6, TaNFXL1 and TansLTP9.4  in a wheat protoplast assay. Deletions of sequences located between the two sgRNA in each gene were the most frequent editing events observed for two of the three  genes. A comparative assessment of editing frequencies between a codon-optimized  Cas9 for expression in algae, crCas9, and a plant codon-optimized Cas9, pcoCas9,  showed more consistent results with the vector expressing pcoCas9. Editing of TaNFXL1 by co-expression of sgRNA pair was investigated in transgenic wheat plants. Given the ploidy of bread wheat, a rapid, robust and inexpensive genotyping protocol was also adapted for hexaploid genomes and shown to be a useful tool to identify homoeolog-specific editing events in wheat. Conclusions:  Co-expressed pairs of sgRNA targeting single genes in conjunction with the CRISPR/Cas9 system produced large deletions in wheat. In addition, a genotyping protocol to identify editing events in homoeologs of TaNFXL1 was successfully adapted.","wheat","背景：クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ Cas9システムを使用したターゲットゲノム編集は、多数の植物種に適用されています。遺伝子特異的なシングルガイドRNA（sgRNA）とCRISPR / Cas9システムを使用して、少数の塩基の削除などの小さな編集イベントを取得できます。ただし、一部のアプリケーションでは、より大きな削除が必要です。さらに、編集されたイベントの識別と特性評価は、小麦などの複雑なゲノムを持つ植物では困難な場合があります。結果：この研究では、CRISPR / Cas9システムを使用し、同じ遺伝子をターゲットにするために共発現されたsgRNAのペアを使用して多数の大きな削除を生成するプロトコルを開発しました。プロトコルは、小麦プロトプラストアッセイで3つの遺伝子、TaABCC6、TaNFXL1、およびTansLTP9.4をターゲットにすることによって検証されました。各遺伝子の2つのsgRNAの間にある配列の削除は、3つの遺伝子のうちの2つで観察された最も頻繁な編集イベントでした。藻類での発現のためにコドン最適化されたCas9、crCas9と植物コドン最適化されたCas9、pcoCas9の間の編集頻度の比較評価は、pcoCas9を発現するベクターでより一貫した結果を示した。トランスジェニック小麦植物において、sgRNAペアの共発現によるTaNFXL1の編集を調査した。パン小麦の倍数性を考えると、迅速で堅牢かつ安価なジェノタイピングプロトコルも六倍体ゲノムに適合し、小麦のホモエログ固有の編集イベントを特定するための有用なツールであることが示されました。結論：CRISPR / Cas9システムと組み合わせて単一遺伝子を標的とするsgRNAの共発現ペアは、小麦に大きな欠失をもたらしました。さらに、TaNFXL1のホモエログの編集イベントを識別するためのジェノタイピングプロトコルが正常に適応されました。"]
[307,31273916,"plant","wheat; maize","CRISPR;Cas9;","TaGASR7; ZmTMS5","Molecular plant pathology","A barley stripe mosaic virus-based guide RNA delivery system for targeted mutagenesis in wheat and maize.",2019,"20(10):1463-1474","[Hu J et al.]","China Agricultural University, Beijing, China.",31273916,"10.1111/mpp.12849 ","Plant RNA virus-based guide RNA (gRNA) delivery has substantial advantages compared to that of the conventional constitutive promoter-driven expression due  to the rapid and robust amplification of gRNAs during virus replication and movement. To date, virus-induced genome editing tools have not been developed for wheat and maize. In this study, we engineered a barley stripe mosaic virus (BSMV)-based gRNA delivery system for clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/Cas9-mediated targeted mutagenesis in wheat and maize. BSMV-based delivery of single gRNAs for targeted mutagenesis was first validated in Nicotiana benthamiana. To extend this work, we transformed wheat and maize with the Cas9 nuclease gene and selected the wheat TaGASR7 and maize ZmTMS5 genes as targets to assess the feasibility and efficiency of BSMV-mediated mutagenesis. Positive targeted mutagenesis of the TaGASR7 and ZmTMS5 genes was achieved for wheat and maize with efficiencies of up to 78% and 48%. Our results  provide a useful tool for fast and efficient delivery of gRNAs into economically  important crops.","wheat; maize","植物RNAウイルスベースのガイドRNA（gRNA）の送達は、ウイルスの複製および移動中のgRNAの迅速かつ強力な増幅により、従来の構成的プロモーター駆動型発現と比較して実質的な利点があります。現在まで、ウイルス誘発性のゲノム編集ツールは小麦とトウモロコシ用に開発されていません。この研究では、小麦とトウモロコシのクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（CRISPR）/ Cas9を介した標的突然変異誘発のための大麦縞モザイクウイルス（BSMV）ベースのgRNAデリバリーシステムを設計しました。標的突然変異誘発のための単一gRNAのBSMVベースの送達は、Nicotianabenthamianaで最初に検証されました。この作業を拡張するために、Cas9ヌクレアーゼ遺伝子で小麦とトウモロコシを形質転換し、BSMVを介した突然変異誘発の実現可能性と効率を評価するためのターゲットとして小麦のTaGASR7とトウモロコシのZmTMS5遺伝子を選択しました。TaGASR7およびZmTMS5遺伝子の陽性標的突然変異誘発は、最大78％および48％の効率で小麦およびトウモロコシで達成されました。私たちの結果は、経済的に重要な作物にgRNAを迅速かつ効率的に送達するための有用なツールを提供します。"]
[308,30907219,"plant"," ","Agroinfiltration;"," ","Autophagy","Actin filaments are dispensable for bulk autophagy in plants.",2019,"15(12):2126-2141","[Zheng X  et al.]","Tsinghua University, Beijing, China.",30907219,"10.1080/15548627.2019.1596496 ","Actin filament, also known as microfilament, is one of two major cytoskeletal elements in plants and plays important roles in various biological processes. Like in animal cells, actin filaments have been thought to participate in autophagy in plants. However, surprisingly, in this study we found that actin filaments are dispensable for the occurrence of autophagy in plants. Disruption of actin filaments by short term treatment with actin polymerization inhibitors,  cytochalasin D and latrunculin B, or transient overexpression of Profilin 3 in Nicotiana benthamiana had no effect on basal autophagy as well as the upregulation of nocturnal autophagy and salt stress-induced autophagy. Furthermore, anti-microfilament drug treatment affected neither basal nor salt stress-induced autophagy in Arabidopsis. In addition, prolonged perturbation of actin filaments by silencing Actin7 or 24-h treatment with microfilament-disrupting agents in N. benthamiana caused endoplasmic reticulum (ER) disorganization and subsequent degradation via autophagy involving ATG2, 3,  5, 6 and 7. Our findings reveal that, unlike mammalian cells, actin filaments are unnecessary for bulk autophagy in plants.Abbreviations: ATG: autophagy-related; CD: cytochalasin D; Cvt pathway: cytoplasm to vacuole targeting pathway; DMSO: dimethyl sulfoxide; ER: endoplasmic reticulum; LatB: latrunculin B; Nb: Nicotiana benthamiana; PAS: phagophore assembly site; PRF3: Profilin 3; RER: rough ER; SER: smooth ER; TEM: transmission electron microscopy; TRV: Tobacco rattle virus; VIGS: virus-induced gene silencing; wpi: weeks post-agroinfiltration.",null,"マイクロフィラメントとしても知られるアクチンフィラメントは、植物の2つの主要な細胞骨格要素の1つであり、さまざまな生物学的プロセスで重要な役割を果たします。動物細胞と同様に、アクチンフィラメントは植物のオートファジーに関与すると考えられてきました。しかし、驚くべきことに、この研究では、アクチンフィラメントが植物のオートファジーの発生に不可欠であることがわかりました。アクチン重合阻害剤、サイトカラシンDおよびラトランキュリンBによる短期治療によるアクチンフィラメントの破壊、またはニコチアナベンタミアナにおけるプロフィリン3の一過性の過剰発現は、基礎オートファジー、ならびに夜間オートファジーおよび塩ストレス誘発オートファジーのアップレギュレーションに影響を与えなかった。さらに、抗マイクロフィラメント薬物治療は、アラビドプシスの基礎的または塩ストレス誘発性のオートファジーに影響を与えなかった。さらに、アクチン7をサイレンシングすることによるアクチンフィラメントの長期の摂動またはN.ベンタミアナにおけるマイクロフィラメント破壊剤による24時間の処理は、ATG2、3、5、6および7を含むオートファジーを介した小胞体（ER）の崩壊およびその後の分解を引き起こした。哺乳類の細胞とは異なり、アクチンフィラメントは植物のバルクオートファジーには不要であることを明らかにします。略語：ATG：オートファジー関連。CD：サイトカラシンD; Cvt経路：細胞質から空胞へのターゲティング経路。DMSO：ジメチルスルホキシド; ER：小胞体; LatB：ラトランキュリンB; Nb：ニコチアナベンタミアナ; PAS：食胞アセンブリサイト; PRF3：プロフィリン3; RER：ラフER; SER：スムーズER; TEM：透過型電子顕微鏡; TRV：タバコガラガラウイルス; VIGS：ウイルス誘発性遺伝子サイレンシング; wpi：アグロインフィルトレーション後数週間。"]
[309,31784756,"plant"," ","CRISPR;Cas9;"," ","Journal of experimental botany","Decrosslinking enabled visualization of RGEN-ISL signals for DNA sequences in plant tissues.",2019,null,"[Nagaki K et al.]","Okayama University, Kurashiki, Japan.",31784756,"10.1093/jxb/erz534 ","Information about the positioning of individual loci in the nucleus and the status of epigenetic modification at such loci in each cell contained in plant tissue expand our understanding of how cells in tissue coordinate gene expression. To obtain such information, a less damaging DNA visualization method  in tissue that can be used with immunohistochemistry is required. Recently, a less damaging DNA visualization method using the CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated caspase 9) system, named RNA-guided endonuclease - in situ labeling (RGEN-ISL), was reported. This system  made it possible to visualize the target DNA locus in the nucleus fixed on the slide glass with a set of simple operations, but this system could not apply to cells in plant tissues. In this report, we have developed a modified RGEN-ISL method with decrosslinking that made it possible to simultaneously detect target  the DNA loci and immunohistochemistry signals, including histone modification, in various types of plant tissues and species.",null,"核内の個々の遺伝子座の位置と、植物組織に含まれる各細胞のそのような遺伝子座でのエピジェネティック修飾の状態に関する情報は、組織内の細胞が遺伝子発現を調整する方法についての理解を深めます。このような情報を取得するには、免疫組織化学で使用できる組織内の損傷の少ないDNA視覚化方法が必要です。最近、CRISPR / Cas9（クラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート/関連カスパーゼ9）システムを使用した、RNA誘導エンドヌクレアーゼ-insituラベリング（RGEN-ISL）と呼ばれる損傷の少ないDNA視覚化法が報告されました。このシステムは、スライドガラスに固定された核内の標的DNA遺伝子座を一連の簡単な操作で視覚化することを可能にしましたが、このシステムは植物組織の細胞には適用できませんでした。このレポートでは、さまざまな種類の植物組織および種において、標的DNA遺伝子座とヒストン修飾を含む免疫組織化学シグナルを同時に検出することを可能にする、脱架橋を伴う修正RGEN-ISL法を開発しました。"]
[310,30317650,"plant"," ","CRISPR;Cas9;"," ","New phytologist","TIR-NB-LRR immune receptor SOC3 pairs with truncated TIR-NB protein CHS1 or TN2 to monitor the homeostasis of E3 ligase SAUL1.",2019,"221(4):2054-2066","[Liang W et al.]","University of British Columbia, Vancouver, BC, Canada.",30317650,"10.1111/nph.15534 ","Intracellular nucleotide binding (NB) and leucine-rich repeat (NLR) proteins function as immune receptors to recognize effectors from pathogens. They often guard host proteins that are the direct targets of those effectors. Recent findings have revealed that a typical NLR sometimes cooperates with another atypical NLR for effector recognition. Here, by using the CRISPR/Cas9 gene editing method, knockout analysis and biochemical assays, we uncovered differential pairings of typical Toll Interleukin1 receptor (TIR) type NLR (TNL)  receptor SOC3 with atypical truncated TIR-NB (TN) proteins CHS1 or TN2 to guard the homeostasis of the E3 ligase SAUL1. Overaccumulation of SAUL1 is monitored by the SOC3-TN2 pair, while SAUL1's disappearance is guarded by the SOC3-CHS1 pair.  SOC3 forms a head-to-head genomic arrangement with CHS1 and TN2, indicative of transcriptional co-regulation. Such intricate cooperative interactions can probably enlarge the recognition spectrum and increase the functional flexibility of NLRs, which can partly explain the overwhelming occurrence of NLR gene clustering in higher plants.",null,"細胞内ヌクレオチド結合（NB）およびロイシンリッチリピート（NLR）タンパク質は、病原体からのエフェクターを認識する免疫受容体として機能します。それらはしばしば、それらのエフェクターの直接の標的である宿主タンパク質を保護します。最近の調査結果は、典型的なNLRがエフェクター認識のために別の非典型的なNLRと協力することがあることを明らかにしました。ここでは、CRISPR / Cas9遺伝子編集法、ノックアウト分析、生化学的アッセイを使用して、典型的なトールインターロイキン1受容体（TIR）タイプNLR（TNL）受容体SOC3と非典型的な短縮型TIR-NB（TN）タンパク質CHS1またはTN2の異なるペアリングを明らかにしました。 E3リガーゼSAUL1のホメオスタシスを保護します。SAUL1の過剰蓄積はSOC3-TN2ペアによって監視され、SAUL1の消失はSOC3-CHS1ペアによって保護されます。SOC3は、CHS1およびTN2と直接ゲノム配列を形成し、転写の共調節を示します。このような複雑な協調的相互作用は、おそらく認識スペクトルを拡大し、NLRの機能的柔軟性を高める可能性があります。これは、高等植物におけるNLR遺伝子クラスターの圧倒的な発生を部分的に説明できます。"]
[311,31286514,"plant"," ","Agroinfiltration;","CVYV P1b","Plant, cell & environment","Sterol isomerase HYDRA1 interacts with RNA silencing suppressor P1b and restricts potyviral infection.",2019,"42(11):3015-3026","[Ochoa J  et al.]","Campus Universidad Autonoma de Madrid, Madrid, Spain.",31286514,"10.1111/pce.13610 ","Plants use RNA silencing as a strong defensive barrier against virus challenges,  and viruses counteract this defence by using RNA silencing suppressors (RSSs). With the objective of identifying host factors helping either the plant or the virus in this interaction, we have performed a yeast two-hybrid screen using P1b, the RSS protein of the ipomovirus Cucumber vein yellowing virus (CVYV, family Potyviridae), as a bait. The C-8 sterol isomerase HYDRA1 (HYD1), an enzyme involved in isoprenoid biosynthesis and cell membrane biology, and required for RNA silencing, was isolated in this screen. The interaction between CVYV P1b and  HYD1 was confirmed in planta by Bimolecular Fluorescence Complementation assays.  We demonstrated that HYD1 negatively impacts the accumulation of CVYV P1b in an agroinfiltration assay. Moreover, expression of HYD1 inhibited the infection of the potyvirus Plum pox virus, especially when antiviral RNA silencing was boosted by high temperature or by coexpression of homologous sequences. Our results reinforce previous evidence highlighting the relevance of particular composition  and structure of cellular membranes for RNA silencing and viral infection. We report a new interaction of an RSS protein from the Potyviridae family with a member of the isoprenoid biosynthetic pathway.",null,"植物はRNAサイレンシングをウイルスの攻撃に対する強力な防御バリアとして使用し、ウイルスはRNAサイレンシングサプレッサー（RSS）を使用してこの防御を打ち消します。この相互作用において植物またはウイルスのいずれかを助ける宿主因子を特定する目的で、イポモウイルスキュウリ静脈黄化ウイルス（CVYV、Potyviridae科）のRSSタンパク質であるP1bを餌として使用して酵母2ハイブリッドスクリーニングを実施しました。 。この画面では、イソプレノイド生合成と細胞膜生物学に関与し、RNAサイレンシングに必要な酵素であるC-8ステロールイソメラーゼHYDRA1（HYD1）が分離されました。CVYV P1bとHYD1の間の相互作用は、二分子蛍光相補性アッセイによって植物で確認されました。アグロインフィルトレーションアッセイにおいて、HYD1がCVYVP1bの蓄積に悪影響を与えることを実証しました。さらに、HYD1の発現は、特に抗ウイルスRNAサイレンシングが高温または相同配列の共発現によって増強された場合に、ポティウイルスプラムポックスウイルスの感染を阻害しました。私たちの結果は、RNAサイレンシングとウイルス感染に対する細胞膜の特定の組成と構造の関連性を強調する以前の証拠を補強します。PotyviridaeファミリーのRSSタンパク質とイソプレノイド生合成経路のメンバーとの新しい相互作用を報告します。"]
[312,31065034,"plant"," ","Agroinfiltration;","multifunctional viral translation transactivator/viroplasmin (TAV) protein from Cauliflower mosaic virus","Scientific reports","Cauliflower mosaic virus transactivator protein (TAV) can suppress nonsense-mediated decay by targeting VARICOSE, a scaffold protein of the decapping complex.",2019,"9(1):7042","[Lukhovitskaya N et al.]","CNRS, Universite de Strasbourg, Strasbourg, France.",31065034,"10.1038/s41598-019-43414-0 ","During pathogenesis, viruses hijack the host cellular machinery to access molecules and sub-cellular structures needed for infection. We have evidence that the multifunctional viral translation transactivator/viroplasmin (TAV) protein from Cauliflower mosaic virus (CaMV) can function as a suppressor of nonsense-mediated mRNA decay (NMD). TAV interacts specifically with a scaffold protein of the decapping complex VARICOSE (VCS) in the yeast two-hybrid system, and co-localizes with components of the decapping complex in planta. Notably, plants transgenic for TAV accumulate endogenous NMD-elicited mRNAs, while decay of AU-rich instability element (ARE)-signal containing mRNAs are not affected. Using an agroinfiltration-based transient assay we confirmed that TAV specifically stabilizes mRNA containing a premature termination codon (PTC) in a  VCS-dependent manner. We have identified a TAV motif consisting of 12 of the 520  amino acids in the full-length sequence that is critical for both VCS binding and the NMD suppression effect. Our data suggest that TAV can intercept NMD by targeting the decapping machinery through the scaffold protein VARICOSE, indicating that 5'-3' mRNA decapping is a late step in NMD-related mRNA degradation in plants.",null,"病因の間、ウイルスは宿主の細胞機構を乗っ取って、感染に必要な分子や細胞内構造にアクセスします。カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）からの多機能ウイルス翻訳トランスアクチベーター/ビロプラスミン（TAV）タンパク質が、ナンセンス媒介mRNA崩壊（NMD）のサプレッサーとして機能できるという証拠があります。TAVは、酵母の2ハイブリッドシステムで脱キャップ複合体VARICOSE（VCS）の足場タンパク質と特異的に相互作用し、プランタで脱キャップ複合体の成分と共局在します。特に、TAVのトランスジェニック植物は、内因性のNMD誘発mRNAを蓄積しますが、AUに富む不安定要素（ARE）シグナルを含むmRNAの崩壊は影響を受けません。アグロインフィルトレーションベースの一過性アッセイを使用して、TAVがVCS依存的に早期終結コドン（PTC）を含むmRNAを特異的に安定化することを確認しました。我々は、VCS結合とNMD抑制効果の両方に重要な全長配列の520アミノ酸のうち12からなるTAVモチーフを特定しました。私たちのデータは、TAVが足場タンパク質VARICOSEを介してデキャッピング機構をターゲットにすることでNMDをインターセプトできることを示唆しており、5'-3'mRNAデキャッピングが植物におけるNMD関連mRNA分解の後期段階であることを示しています。"]
[313,31321685,"plant"," ","CRISPR;Cas9;agroinfiltration"," ","Transgenic research","DNA-free genome editing with preassembled CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins in plants.",2019,"28(Suppl 2):61-64","[Park J et al.]","Naturegenic Inc., West Lafayette, IN, USA.",31321685,"10.1007/s11248-019-00136-3 ","Processes of traditional trait development in plants depend on genetic variations derived from spontaneous mutation or artificial random mutagenesis. Limited availability of desired traits in crossable relatives or failure to generate the  wanted phenotypes by random mutagenesis led to develop innovative breeding methods that are truly cross-species and precise. To this end, we devised novel methods of precise genome engineering that are characterized to use pre-assembled CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP) complex instead of using nucleic ands or Agrobacterium. We found that our methods successfully engineered plant genomes without leaving any foreign DNA footprint in the genomes. To facilitate introduction of RNP into plant nucleus, we first obtained protoplasts after removing the transfection barrier, cell wall. Whole plants were regenerated from  the single cell of protoplasts that has been engineered with the RNP. Pending the improved way of protoplast regeneration technology especially in crop plants, our methods should help develop novel traits in crop plants in relatively short time  with safe and precise way.",null,"植物における伝統的な形質発達のプロセスは、自然発生的突然変異または人工的ランダム突然変異誘発に由来する遺伝的変異に依存します。交雑可能な近親者における望ましい形質の限られた利用可能性、またはランダム突然変異誘発による所望の表現型の生成の失敗は、真に種間で正確な革新的な育種法の開発につながりました。この目的のために、我々は、核およびアグロバクテリウムを使用する代わりに、事前に組み立てられたCRISPR / Cas9リボヌクレオプロテイン（RNP）複合体を使用することを特徴とする正確なゲノム工学の新しい方法を考案しました。私たちの方法は、ゲノムに外来DNAのフットプリントを残すことなく、植物ゲノムをうまく操作できることを発見しました。植物核へのRNPの導入を容易にするために、トランスフェクションバリアである細胞壁を除去した後、最初にプロトプラストを取得しました。植物全体は、RNPで設計されたプロトプラストの単一細胞から再生されました。特に作物植物におけるプロトプラスト再生技術の改善された方法を待つ間、私たちの方法は、安全で正確な方法で比較的短時間で作物植物の新しい特性を開発するのに役立つはずです。"]