研究要旨

  内分泌かく乱化学物質（EDCｓ）の発達期中枢神経系障害に関する研究課題について、周産期曝露による影響の病理学的及び分子生物学的解析手法を用いたｉｎ ｖｉｖｏ評価に関する研究を開始した。その評価は脳の性分化の臨界時期、および生殖活動が可能となる性成熟後の時期の２時点での解析が重要と考えられる。今年度は初年度にあたり、脳の性分化の臨界時期（新生児期）における影響に関して、視床下部に発現が予想される遺伝子の発現レベルの変動を指標として、エストロジェン化合物を用いての評価系の確立を中心に研究を進めた。
  多数の組織材料について解剖学的に特定される細胞領域での遺伝子発現解析を行うためには、パラフィン包埋切片を利用するのが理想的なため、そのための基礎的検討としてパラフィン包埋しても定量的な解析が可能な品質を保ったＲＮＡないし蛋白質を回収できる組織固定法の確立を図り、メタカーン固定法がＲＮＡ、蛋白質双方の解析に優れていることを見出した。
  脳の性分化臨界時期の遺伝子発現評価系の実験方法として、ラット脳の性分化がほぼ完成する時期にあたる生後９日目（P9)に視床下部を採取し、メタカーン固定、パラフィン包埋切片を作成し、脳室周囲に存在し性的に分化することが知られている神経核（性的二型核）をレーザー光を利用したmicrodissection法により顕微鏡下で取り出した。その部位由来のRNAを鋳型としたRT-PCRにより、プロモーター領域にエストロジェンに反応するestrogen response element （ERE)を有するいくつかの候補遺伝子(bcl-x、GABA transporter I、oxytocin、progesterone receptor、neurotensin/neuromedin N、GFAP）のmRNA発現の有無を検索した。その結果、これらの全ての遺伝子が性的二型核で発現していることを確認した。次いで、定量的なRT-PCRに向けての予備的な検討として、エストロジェン化合物を曝露した動物と無処置対照動物との間で、RT-PCRの実験条件の整備を図った。用いた材料は、ethinylestradiol(EE)の母体に対する最大耐量(0.5ppm混餌投与）を胎生期から新生児期にあたるE15〜P9の間、経胎盤的・経乳的に曝露した新生ラット（P9)の視床下部とした。この予備的な検討の結果、最大耐量のEE曝露を受けた雌雄の新生児とも。P9の時点ではその神経核における形態学的変化は見られなかったが、雄の新生児においてEREを有する幾つかの遺伝子の発現低下が認められた。
  この実験系は最終的には低用量域曝露のリスク評価に用いることから、更に高感度な検索法の確立が望まれる。感度をあげるための方法として、微量組織でのより確実な定量化を実現するためにPCR産物を電気泳動したバンドの濃さの定量ではなく、plate hybridizationによる高感度な定量法を組み合わせたcompetitiveRT-PCR法を開発し、この実験系への応用を現在進めている。予備的な検討の結果、無処置雄P9の性的二型核におけるGABA transporter IのmRNA数は1340コピー/ng total RNAであった。