■ グリホサート・グルホシネート・AMPA 妥当性評価SOP

誘導体化-固相抽出-LC/MS/MSによる一斉分析法(別添方法22)

1. 試薬

(1) アスコルビン酸ナトリウム
測定対象成分を含まないもの
(2) 精製水
測定対象成分を含まないもの
(3) アセトニトリル
測定対象成分を含まないもの
(4) 2.5%ホウ酸溶液
四ホウ酸ナトリウム(無水)2.5gを精製水に溶かして100mLとしたもの
(5) 2%(v/v)リン酸
リン酸2mLを精製水にとかして100mLとしたもの
(6) クロロギ酸9-フルオレニルメチル(FMOC)溶液
FMOC 0.1 gをアセトニトリルに溶かして100 mLとしたもの
(7) 5mM酢酸アンモニウム溶液
酢酸アンモニウム3.9gを精製水に溶かして100mLとした後、精製水で100倍に希釈したもの
(8) 固相カラム用溶出液
アセトニトリル40 mLと5mM酢酸アンモニウム溶液60 mLを混合したもの
(9) グルホシネート標準原液(1000 mg/L)
グルホシネートアンモニウム標準品11 mgをポリプロピレン製メスフラスコに採り,精製水を加えて10 mLに定容したもの
(10) グリホサート標準原液(1000 mg/L)
グリホサート標準品10 mgをポリプロピレン製メスフラスコに採り,精製水を加えて10 mLに定容したもの
(11) アミノメチルリン酸(AMPA)標準原液(1000 mg/L)
AMPA標準品10 mgをポリプロピレン製メスフラスコに採り,精製水を加えて10 mLに定容したもの
(12) 農薬混合標準液A (グルホシネート:10 mg/L,グリホサート:10mg/L,AMPA:10 mg/L)
グルホシネート標準原液(1000 mg/L)1.0 mL,グリホサート標準原液(1000 mg/L)1.0 mLおよびAMPA標準原液(1000 mg/L)1.0 mLをポリプロピレン製メスフラスコに採り,精製水を加えて100 mLに定容する.この溶液は、使用の都度調製する.
(13) 農薬混合標準液B (グルホシネート:100 μg/L,グリホサート:100 μg/L,AMPA:100 μg/L)
農薬混合標準液A 1.0 mLをポリプロピレン製メスフラスコに採り,精製水を加えて100 mLに定容する.この溶液は,使用の都度調製する.

2. 器具および装置

(1) 採水瓶
ポリプロピレン製(1000~2000 mL)のもの
(2) メスフラスコ
ポリプロピレン製(10,100および250 mL)のもの
(3) ピペット
ポリプロピレン製チップを装着可能で、可変式(50~1000 μL,5~10 mL)のもの
(4) 試験管
ポリプロピレン製(30 ~50 mL)のもの
(5) 固相カラム
オクタデシル基を化学結合したシリカゲルまたはこれと同等以上の性能を有するもので,充填量が200 mgのもの<
Bond Elute-ENV(200 mg,3 mL,アジレントテクノロジー社製),Sep-Pak Vac C18(200 mg,3 cc,ウォーターズ社製),Inert Sep C18(200 mg,3 mL,ジーエルサイエンス社製)またはこれらと同等以上の性能を有するもの"
(6) 恒温槽
50±5℃に保持できるもの
(7) 固相抽出装置
バキュームマニホールド:固相カラムを装着でき,マニホールド内の圧力が調整可能なもの
リザーバー:ポリプロピレン製(30 ~50 mL)のもの
(8) 液体クロマトグラフ-質量分析計

3. 農薬添加試料の調製

(1) 採水瓶に水道水を採取する.なお,残留塩素が含まれている場合には,水道水1000 mLに対してアスコルビン酸ナトリウム10~20 mgを加えてよく撹拌し,脱塩素処理を行う.
(2) 以下の操作により,各農薬濃度0.2 μg/Lおよび2.0 μg/L(グルホシネートの目標値の1/100および1/10,グリホサート・AMPAの目標値の1/10000および1/1000)の添加試料を調製する.
●各農薬濃度0.2 μg/Lの農薬添加試料:農薬混合標準液B 500 μLをポリプロピレン製メスフラスコに採り,水道水で250 mLに定容する.
●各農薬濃度2.0 μg/Lの農薬添加試料:農薬混合標準液A 50 μLをポリプロピレン製メスフラスコに採り,水道水で250 mLに定容する.
※ただし,該当するメスフラスコがない場合には,スケールダウンまたはスケールアップしてもよい.
(3) 農薬添加試料は,以下の「4. 前処理」および「5. 分析」の操作を行う.
(4) 空試験として,(1)の手順により脱塩素処理を行った水道水20 mL(n=3~5)を使用して,農薬添加試料と同様に以下の「4. 前処理」および「5. 分析」の操作を行う.
※全ての操作において,農薬添加試料と触れる容器および器具はポリプロピレン製のものを使用する(ガラス製のものを用いないこと).

4. 前処理

(1) 農薬添加試料20 mLをポリプロピレン製試験管に採り,2.5%ホウ酸溶液 1.0 mL,FMOC溶液 2.0 mLを加え,撹拌後,恒温槽内(50℃)で20分間加熱することにより,誘導体化する.
水冷後,2%リン酸 1.2 mLを加え,撹拌し,誘導体化反応を停止させる.
(2) 固相抽出カラムにアセトニトリル3 mL,精製水 3 mLを順次注入し、コンディショニングする.
(3) リザーバー部分に誘導体化後の検査試料水の全量を移し,毎分2~3 mLの流速で固相カラムに通水する.
(4) 5mM酢酸アンモニウム溶液約1 mLで固相カラムを洗浄し,洗浄液は捨てる.
(5) 固相カラムの上端から固相カラム用溶出液1.5 mLを緩やかに流し,カラムからの溶出液を試験管に受ける.
(6) 固相カラム用溶出液で2.0 mLに定容し,これを試験溶液とする.
※各濃度において5回試験を行い,試験結果を報告書に記載する.
※全ての操作において,農薬添加試料と触れる容器および器具はポリプロピレン製のものを使用する(ガラス製のものを用いないこと).

5. 分析

(1) 上記の前処理操作で得られた試験溶液の一定量を表1の測定条件を参考にLC/MS/MSに注入する.
(2) 表2に示す各農薬のモニターイオンのピークの保持時間が標準物質と一致することを確認し,ピーク面積を求める.
(3) (2)で求めた各農薬のモニターイオンのピーク面積から,空試験のピーク面積を差し引いた後,下記「6. 検量線の作成」の操作により得られた検量線を用いて試験溶液中の各農薬濃度を求める.
(4) (3)で求めた試験溶液中の各農薬濃度を,前処理の濃縮倍率(10倍)で除して,検査試料水中の各農薬濃度を算定する.
表1. LC/MS/MS測定条件の例
機器 項目 設定値
LC 分離カラム Capcell Pak C18
(2.0 mm x 150 mm,粒径5 μm,資生堂)
カラム温度 30℃ 
移動相A 5 mM酢酸アンモニウム水溶液
移動相B アセトニトリル
移動相条件 B 5% (0 min) - B 63% (9.3 min) - B95% (13 min)
移動相流量 0.25 mL/min 
注入量 20 μL
MS/MS イオン化法 ESI(負イオン測定モード) 
イオン源温度 150℃
表2. 各農薬のモニターイオンの例
測定対象物質 プリカーサイオン(m/z) プロダクトイオン(m/z)
グルホシネート 402 180, 206
グリホサート 390 168, 150
AMPA 332 110, 136 

6. 検量線の作成

(1) 以下の操作により,検量線用標準溶液(STD1~STD5)を調製する.
●STD1 (0.1 μg/L) :農薬混合標準液B 100 μLをポリプロピレン製メスフラスコに採り,精製水を加えて100 mLに定容する.
●STD2 (0.2 μg/L) :農薬混合標準液B 200 μLをポリプロピレン製メスフラスコに採り,精製水を加えて100 mLに定容する.
●STD3 (0.5 μg/L) :農薬混合標準液B 500 μLをポリプロピレン製メスフラスコに採り,精製水を加えて100 mLに定容する.
●STD4 (1.0 μg/L) :農薬混合標準液B1000 μLをポリプロピレン製メスフラスコに採り,精製水を加えて100 mLに定容する.
●STD5 (3.0 μg/L) :農薬混合標準液B3000 μLをポリプロピレン製メスフラスコに採り,精製水を加えて100 mLに定容する.
※ただし,該当するメスフラスコがない場合には,スケールダウンまたはスケールアップしてもよい.
(2) 上記(1)で調製した検量線用標準溶液を,「4. 前処理」および「5. 分析」の操作によって操作し,各農薬の検量線を作成する.
※検量線用標準溶液は、繰り返し測定(n=3~5)を行い,各濃度の再現性 (RSD)および検量線の直線性を確認する.
※全ての操作において,検量線用標準溶液と触れる容器および器具はポリプロピレン製のものを使用する(ガラス製のものを用いないこと).

関連情報

  • 小林憲弘,木下輝昭,鈴木俊也,高木総吉,吉田仁,望月映希,小林浩,辻清美,上村仁,植田紘行,齋藤信裕,岩間紀知,粕谷智浩,古川浩司,塚本多矩,市川千種,久保田領志,五十嵐良明:水道水中のグルホシネート・グリホサート・AMPAのLC/MS/MS一斉分析法の妥当性評価.環境科学会誌,29(3) 147-158 (2016).